一种治疗骨巨细胞瘤的方法

1.本发明涉及肿瘤学和诊断领域，具体地，本发明涉及一种治疗骨巨细胞瘤的方法。


背景技术：

2.骨巨细胞瘤是一种常见的原发性骨肿瘤1，通常发生在四肢长骨干骺端，包括股骨远端、股骨近端和胫骨近端2。尽管骨巨细胞瘤通常被认为是一种良性肿瘤并且很少发生转移，但它具有局部侵袭性并经常导致严重的骨破坏
3,4
。
3.目前对于骨巨细胞瘤的诊断以及治疗的手段都十分有限。对骨巨细胞瘤的诊断主要通过组织病理学和放射学评估，以及对h3.3g34w突变的检测。
4.目前对于骨巨细胞瘤治疗的手段都十分有限。在临床治疗方面，手术是最常用的治疗方法，但27％
‑
65％的患者在手术后会出现复发或转移8。除手术外，双膦酸盐9和rankl单克隆抗体狄诺塞麦
10
也用于治疗骨巨细胞瘤。然而，这两种药物都有一系列的副作用
11
‑
13
，并且在停药后患者都面临着复发的风险。因此，找到更多的治疗靶点有助于临床上对于骨巨细胞瘤的治疗。
5.综上所述，寻找新的骨巨细胞瘤的标志物和治疗靶点，并针对性地进行靶向药物的研发是当务之急。因此，本领域迫切需要开发可用于治疗骨巨细胞瘤的靶向药物。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种可用于治疗骨巨细胞瘤的靶向药物及其用途。
7.在本发明的第一方面，提供了一种cd44抑制剂的用途，所述cd44抑制剂被用于制备治疗骨巨细胞瘤的药物。
8.在另一优选例中，所述的cd44抑制剂选自下组：小分子药物、特异性抗体、核酸药物、基因编辑药物或其组合。
9.在另一优选例中，所述的核酸药物包括反义rna、microrna。
10.在另一优选例中，所述的cd44抑制剂是阻断srgn和cd44的结合或相互作用的阻断型抑制剂。
11.在另一优选例中，，所述的cd44抑制剂为cd44特异性抗体。
12.在另一优选例中，所述的cd44特异性抗体选自下组：im7、bivatuzumab、rg
‑
7356、h90、pf
‑
3475952、ro5429083。
13.在另一优选例中，所述的cd44抑制剂选自下组：hyaluronan
‑
cisplatin conjugate、angstrom6、verbascoside、amc303。
14.在另一优选例中，所述的药物还含有srgn抑制剂，或者所述的药物与srgn抑制剂联用。
15.在另一优选例中，在施用cd44抑制剂的之前、之后和/或同时，施用srgn抑制剂。
16.述的srgn抑制剂包括：抑制srgn的小分子药物、抗srgn的特异性抗体、核酸药物、基因编辑药物或其组合。优选地，所述的核酸药物包括反义rna、microrna。
17.在另一优选例中，所述的srgn抑制剂阻断srgn和cd44的结合或相互作用。
18.在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗骨巨细胞瘤的药物组合物，所述的药物组合物含有(a)cd44抑制剂，(b)srgn抑制剂和(c)药学上可接受的载体。
19.在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有：
20.(i)第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有cd44抑制剂和药学上可接受的载体；
21.(ii)第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有srgn抑制剂和药学上可接受的载体。
22.在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物是不同的或各自独立的。
23.在另一优选例中，所述药物组合物为口服制剂或者非口服制剂(如注射剂)。
24.在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括：
25.(z1)用于检测骨巨细胞瘤或对骨巨细胞瘤进行分型的标志物的诊断试剂，所述的诊断试剂选自下组：srgn基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂；和
26.(z2)用于治疗骨巨细胞瘤的活性成分，其中，所述的活性成分选自下组：cd44抑制剂、srgn抑制剂或其组合。
27.在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性的抑制骨巨细胞瘤细胞的方法，包括步骤：在含有有效量的cd44抑制剂和/或srgn抑制剂的培养体系下，培养所述的骨巨细胞瘤细胞，从而抑制骨巨细胞瘤细胞。
28.在另一优选例中，所述的骨巨细胞瘤的单核细胞。
29.在另一优选例中，所述的抑制骨巨细胞瘤细胞包括：抑制单核细胞分化成为多核巨细胞。
30.在本发明的第六方面，提供了一种治疗骨巨细胞瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的cd44抑制剂和/或srgn抑制剂。
31.在另一优选例中，所述的对象是骨巨细胞瘤患者。
32.在另一优选例中，所述的对象是srgn阳性的患者。
33.在本发明的第七方面，提供了一种srgn基因、mrna、cdna、或蛋白或其检测试剂的用途，它被(a)用作检测骨巨细胞瘤或骨巨细胞瘤风险的标志物；(b)用于对骨巨细胞瘤进行分型的标志物；和/或(c)用于制备诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于检测骨巨细胞瘤或骨巨细胞瘤风险，或用于对骨巨细胞瘤进行分型。
34.在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如dna芯片)或蛋白质芯片。
35.在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。
36.在另一优选例中，所述的srgn基因、mrna、cdna、或蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于人和非人哺乳动物(如灵长动物)，更佳地，来源于被诊断患有骨巨细胞瘤的患者。
37.在另一优选例中，所述srgn基因、mrna、cdna、或蛋白来源于骨巨细胞瘤患者。
38.在另一优选例中，所述的srgn蛋白为人的srgn，较佳地，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
39.在另一优选例中，所述检测包括血清检测、对组织或细胞样品进行检测。
40.在另一优选例中，所述的组织包括离体的骨巨细胞瘤组织。
41.在另一优选例中，所述的细胞包括骨巨细胞瘤的梭形基质细胞。
42.在另一优选例中，所述检测是血液样本检测和/或血清样本检测。
43.在另一优选例中，所述检测试剂包括srgn的特异性抗体、srgn的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。
44.在另一优选例中，所述的srgn蛋白或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。
45.在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
46.在另一优选例中，所述srgn的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
47.在本发明的第八方面，提供了一种用于检测骨巨细胞瘤或对骨巨细胞瘤进行分型的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测srgn基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂；
48.以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测骨巨细胞瘤或骨巨细胞瘤风险；或用于对骨巨细胞瘤进行分型。
49.在另一优选例中，所述检测包括预先判断(预测)、分型检测、和预后检测。
50.在另一优选例中，所述的分型包括将骨巨细胞瘤分为srgn型骨巨细胞瘤(即srgn阳性骨巨细胞瘤)和非srgn型骨巨细胞瘤(即srgn阴性骨巨细胞瘤)。
51.在另一优选例中，所述的检测srgn基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂包括：
52.(a).抗srgn蛋白的特异性抗体；和/或
53.(b).特异性扩增srgn的mrna或cdna的特异性引物。
54.在另一优选例中，所述检测是血液样本检测和/或血清样本检测。
55.在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
56.(i)当检测对象(subject)的血清srgn的浓度≥0.8ng/ml(较佳地，≥0.9ng/ml)，则提示该检测对象发生骨巨细胞瘤的风险高，和/或将该检测对象分型为srgn阳性的骨巨细胞瘤(或srgn型骨巨细胞瘤)；和
57.(ii)当检测对象(subject)的血清srgn的浓度＜0.8ng/ml(较佳地，＜0.6ng/ml)，则提示该检测对象发生骨巨细胞瘤的风险低，和/或将该检测对象分型为srgn阴性的骨巨细胞瘤(或非srgn型骨巨细胞瘤)。
58.在本发明的第九方面，提供了一种检测骨巨细胞瘤或骨巨细胞瘤风险的方法，所述方法包括：
59.a)提供来自受试者的测试样品；
60.b)检测测试样品中srgn蛋白的浓度；和
61.c)将步骤b)中所测定的srgn蛋白的浓度与对照进行比较，
62.其中与所述对照相比，所述样品中srgn蛋白的浓度低于参比值，表明受试者可能患有骨巨细胞瘤或发生骨巨细胞瘤的几率高于正常人群。
63.在另一优选例中，所述的测试样品包括骨巨细胞瘤患者的血液样本和/或血清样本。
64.在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。
65.在另一优选例中，所述参比值为截断值(cut
‑
off值)。
66.在本发明的第十方面，提供了一种确定骨巨细胞瘤的治疗方案的方法，包括：
67.a)提供来自受试者的测试样品；
68.b)检测测试样品中srgn蛋白或mrna的浓度；和
69.c)基于所述样品中的srgn蛋白或mrna的浓度来确定治疗方案。
70.在另一优选例中，所述样品选自下组：血液、血清、离体的骨巨细胞瘤组织或细胞。
71.在另一优选例中，所述的细胞包括骨巨细胞瘤的梭形基质细胞。
72.在另一优选例中，当骨巨细胞瘤患者的血清srgn的浓度≥0.8ng/ml，则选择srgn抑制剂的治疗方案、cd44抑制剂的治疗方案或srgn抑制剂和cd44抑制剂的联用治疗方；当骨巨细胞瘤患者的血清srgn的浓度＜0.8ng/ml，则可选用常规的骨巨细胞瘤治疗方案。
73.在另一优选例中，所述的srgn抑制剂包括：抑制srgn的小分子药物、抗srgn的特异性抗体、核酸药物。
74.在另一优选例中，所述的核酸药物包括反义rna、microrna。
75.在另一优选例中，所述的srgn抑制剂阻断srgn和cd44的结合或相互作用。
76.在另一优选例中，所述的cd44抑制剂包括：抑制cd44的小分子药物、抗cd44的特异性抗体、核酸药物。
77.在另一优选例中，所述的核酸药物包括反义rna、microrna。
78.在另一优选例中，所述的cd44抑制剂阻断srgn和cd44的结合或相互作用。
79.在另一优选例中，所述的常规的骨巨细胞瘤治疗方案选自下组：双膦酸盐、rankl单克隆抗体(如狄诺塞麦)、手术治疗、放疗、或其组合。
80.在另一优选例中，所述的srgn抑制剂选自下组：
81.shsrgn
‑
2，其序列为：ccaggacttgaatcgtatctt(seq id no：2)或
82.shsrgn
‑
5，其序列为：acatggattagaagaggattt(seq id no：3)。
83.在本发明的第十一方面，提供了一种诊断设备，所述的诊断设备包括：
84.输入模块，所述输入模块被配置为输入受试者的测试样品中srgn蛋白和/或mrna的浓度数据；
85.骨巨细胞瘤诊断
‑
骨巨细胞瘤分型模块，所述的骨巨细胞瘤诊断
‑
骨巨细胞瘤分型模块被配置为：基于所述的srgn蛋白和/或mrna的浓度数据，对所述受试者是否患有骨巨细胞瘤进行诊断分析，和/或对骨巨细胞瘤进行分型分型，并获得诊断分析结果和/或分型分析结果；
86.输出模块，所述输出模块被配置为输出所述的诊断分析结果和/或分型分析结果。
87.在另一优选例中，所述的输出模块包括：打印机、显示器、屏幕、手机、pad、或其组合。
88.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
89.图1显示了抑制cd44能够在体外减少破骨细胞的形成。其中，(a)至(d)显示了用
hfob1.19条件性培养基(a
‑
b)或srgn重组蛋白(c
‑
d)和cd44中和抗体(10ng/ml)处理小鼠原代骨髓细胞，诱导破骨细胞分化。破骨细胞数量统计(a,c)和代表性图像(b,d)。(e)至(h)显示了用hfob1.19条件性培养基(e和f)或srgn重组蛋白(g和h)和cd44中和抗体(10ng/ml)处理raw264.7细胞，诱导破骨细胞分化。破骨细胞数量统计(e,g)和代表性图像(f,h)。(i)显示了蛋白水平验证cd44敲除。(j)至(m)显示了用hfob1.19条件性培养基(j
‑
k)或srgn重组蛋白(l
‑
m)处理cd44敲除的raw264.7细胞，诱导破骨细胞分化。破骨细胞数量统计(j,l)和代表性图像(k,m)。
90.图2显示了cd44中和抗体在小鼠体内抑制多核巨细胞的形成与骨巨细胞瘤的生长。其中，(a)至(d)显示了gctb
‑
19细胞胫骨注射后，cd44中和抗体治疗组和对照组小鼠活体成像，腿骨离体成像以及ct的代表性图(a)，箭头指示骨损伤部位。小鼠活体成像荧光统计值(b)，小鼠腿骨离体成像荧光值统计(c)，小鼠腿骨相对骨体积统计(d)。(e)显示了小鼠腿骨切片h&e以及trap染色。(f)显示了trap+多核巨细胞数量统计。(g)显示了cd44中和抗体组和对照组小鼠体重统计。(h)显示了cd44中和抗体组和对照组小鼠血细胞统计。图中，wbc为白细胞，rbc为红细胞。
具体实施方式
91.本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，骨巨细胞瘤患者的血清srgn蛋白水平显著高于对照组，因此srgn可作为一类新的预测骨巨细胞瘤的生物学标记物，用于骨巨细胞瘤的诊断、分型和/或治疗。此外，梭形基质细胞分泌的srgn会与单核细胞上的cd44受体相互作用,进而促进单核细胞分化成为多核巨细胞。因此，cd44可以作为临床上治疗骨巨细胞瘤的一个靶点。在此基础上，本发明人完成了本发明。
92.具体地，实验表明，srgn在骨巨细胞瘤的梭形基质细胞中特异地高表达，并且通过与其受体cd44的相互作用，促进多核巨细胞的形成，从而帮助骨巨细胞瘤在体内的生长。因此，cd44和/或srgn可作为骨巨细胞瘤的治疗靶点。
93.术语
94.样品
95.本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。
96.表达
97.如本文所用，术语“表达”包括mrna从基因或基因部分的产生，并且包括由rna或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cdna，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
98.参比值
99.如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较srgn蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
100.在本发明中，所述参比值指截断值(cut
‑
off值)，优选0.8ng/ml和0.9ng/ml(骨巨细胞瘤患者血清中srgn的浓度)。
101.骨巨细胞瘤
102.如本文所用，术语“骨巨细胞瘤”指由骨巨细胞瘤引起的肿瘤。
103.骨巨细胞瘤组织中主要有三种细胞类型，分别是梭形基质细胞、多核巨细胞和单核细胞。多核巨细胞在形态和功能上与破骨细胞高度相似，被认为是骨巨细胞瘤造成溶骨的主要原因，而梭形基质细胞则是其中主要的恶性成分5‑7。梭形基质细胞不仅能够恶性增殖，还能分泌各类细胞因子招募单核细胞，并诱导单核细胞分化成为多核巨细胞。
104.srgn蛋白和多核苷酸
105.在本发明中，术语“本发明蛋白”、“srgn蛋白”、“srgn多肽”可互换使用，都指具有srgn氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的srgn蛋白。此外，该术语还包括全长的srgn及其片段。本发明所指的srgn蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
106.丝甘蛋白聚糖(srgn)是最早被发现的蛋白聚糖之一。它主要由17.6kda的核心蛋白与糖胺聚糖链组成
17
。
107.srgn既可储存于胞内也可以被分泌到胞外基质中去。srgn主要表达在造血谱系的细胞中，例如中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、血小板等等
18
‑
22
。一些研究报道，srgn与一些肿瘤的发生发展有关
23
‑
26
。
108.人的srgn蛋白全长为158个氨基酸(登录号为p10124)。氨基酸序列如下：mmqkllkcsrlvlalalilvlessvqgyptrraryqwvrcnpdsnsancleekgpmfellpgesnkiprlrtdlfpktriqdlnrifplsedysgsgfgsgsgsgsgsgsgfltemeqdyqlvdesdafhdnlrsldrnlpsdsqdlgqhgleedfml(seq id no：1)
109.srgn蛋白由位于染色体10q22.1的srgn基因编码，全长为158个氨基酸，分三个区域组成：信号肽(1
‑
27位氨基酸残基组成)，n端(28
‑
76位氨基酸残基组成)和c端(77
‑
158位氨基酸残基组成)，c端有多个丝氨酸/甘氨酸重复区，主要与gag结合，n端有两个半胱氨酸残基。
110.在本发明中，术语“srgn基因”、“srgn多核苷酸”可互换使用，都指具有srgn核苷酸序列的核酸序列。
111.人srgn基因的基因组全长47279bp(ncbi genbank登录号为5552)，其转录产物mrna序列全长1217bp(ncbi genbank登录号为nm_002727.4)。
112.需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
113.在得到了srgn的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且
根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的srgn核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
114.一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
115.此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
116.目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(如载体)和细胞中。
117.通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的srgn多肽。一般来说有以下步骤：
118.(1).用本发明的编码人srgn多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
119.(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
120.(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
121.本发明中，srgn多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
122.本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含srgn编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
123.此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
124.包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
125.宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
126.用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
127.获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下
进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
128.在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
129.cd44蛋白和多核苷酸
130.cd44是一种跨膜糖蛋白，参与多种细胞过程，包括细胞分裂、存活、迁移和粘附
14
。
131.cd44基因位于11p13染色体上，一共有20个外显子，其中十个外显子会受到可变剪接的调控，这些外显子被称为可变外显子
15
。通过可变剪接以及翻译后修饰，cd44基因能够表达出不同的cd44蛋白亚型。这些亚型的分子质量从85kda到250kda不等，并且表达也具有一定的组织特异性。
132.cd44蛋白的功能主要有：作为受体与可溶性细胞外成分或细胞外基质相互作用；作为辅助受体与其它受体协作激活下游的信号通路；调节肌动蛋白细胞骨架
16
。
133.人的cd44蛋白全长为361个氨基酸(登录号为p16070)，氨基酸序列如下：mdkfwwhaawglclvplslaqidlnitcrfagvfhvekngrysisrteaadlckafnstlptmaqmekalsigfetcrygfieghvviprihpnsicaanntgvyiltsntsqydtycfnasappeedctsvtdlpnafdgpititivnrdgtryvqkgeyrtnpediypsnptdddvssgsssersstsggyifytfstvhpipdedspwitdstdripatrdqdtfhpsggshtthgsesdghshgsqegganttsgpirtpqipewliilasllalalilavciavnsrrrcgqkkklvinsgngavedrkpsglngeasksqemvhlvnkessetpdqfmtadetrnlqnvdmkigv(seq id no：4)。
134.在本发明中，术语“cd44基因”、“cd44多核苷酸”可互换使用，都指具有cd44核苷酸序列的核酸序列。
135.人cd44基因的基因组全长93232bp(ncbi genbank登录号为960)，其转录产物mrna序列全长4288bp(ncbi genbank登录号为nm_001001391.2)。
136.srgn和骨巨细胞瘤的相关性
137.本发明人意外地发现，骨巨细胞瘤患者的血清srgn蛋白水平显著高于对照组，因此srgn可作为一类新的预测骨巨细胞瘤的生物学标记物，用于骨巨细胞瘤的诊断、分型和/或治疗。
138.实验表明，srgn在骨巨细胞瘤的梭形基质细胞中特异地高表达，并且通过与其受体cd44的相互作用，促进多核巨细胞的形成，从而帮助骨巨细胞瘤在体内的生长。因此，srgn可作为骨巨细胞瘤诊断指标和治疗靶点。
139.本发明的实验结果还进一步提示，根据骨巨细胞瘤患者血清中srgn的浓度水平选择不同的治疗方案。比如，当骨巨细胞瘤患者的血清srgn的浓度≥0.8ng/ml，则选择srgn抑制剂的治疗方案、cd44抑制剂的治疗方案或srgn抑制剂和cd44抑制剂的联用治疗方。当骨巨细胞瘤患者的血清srgn的浓度＜0.8ng/ml，则可选用常规的骨巨细胞瘤治疗方案，例如双膦酸盐和rankl单克隆抗体(如狄诺塞麦)、手术治疗等。当然，也可在使用这些常规治疗剂或治疗方案的同时，额外地施用srgn抑制剂和/或cd44抑制剂。
140.此外，本发明人在骨巨细胞瘤细胞中，通过shrna干扰方式特异性地敲低了srgn
(采用的shrna为shsrgn
‑
2：ccaggacttgaatcgtatctt，seq id no：2；和shsrgn
‑
5：acatggattagaagaggatttseq id no：3)。结果表明，在srgn被敲低之后，骨巨细胞瘤的条件性培养基在体外诱导小鼠原代骨髓细胞或者raw264.7细胞向破骨细胞分化的能力受到明显地抑制(实验结果也可参见本技术人2021年7月20日同日提交的发明名称为“一种骨巨细胞瘤的诊断方法”的中国申请)。
141.srgn和cd44的相互作用
142.本发明人首次意外地发现：在骨巨细胞瘤组织中，梭形基质细胞会分泌丝甘蛋白聚糖(srgn)，并且srgn会与单核细胞上的cd44受体相互作用，从而促进单核细胞分化成为多核巨细胞。这提示，srgn和单核细胞上的cd44的相互作用可导致发生骨巨细胞瘤和促进骨巨细胞瘤进展，因此，srgn抑制剂和/或cd44抑制剂可用于在临床上治疗骨巨细胞瘤。
143.cd44抑制剂和srgn抑制剂
144.如本文所用，术语“本发明抑制剂”包括cd44抑制剂、srgn抑制剂或其组合。
145.如本文所用，术语“本发明的cd44抑制剂”，“本发明的cd44靶向抑制剂”可互换使用，均可用于抑制cd44的抑制剂，包括抑制cd44表达水平、活性的抑制剂，以及抑制cd44与sgrn相互作用的抑制剂。
146.如本文所用，术语“本发明的srgn抑制剂”，“本发明的srgn靶向抑制剂”可互换使用，均可用于抑制srgn的抑制剂，包括抑制srgn表达水平、活性的抑制剂，以及抑制srgn与cd44相互作用的抑制剂。
147.在本发明中，本发明抑制剂的种类包括(但并不限于)：小分子药物、特异性抗体、核酸药物、基因编辑药物或其组合。
148.在另一优选例中，所述的核酸药物包括反义rna、microrna。
149.在另一优选例中，本发明的抑制剂是阻断srgn和cd44的结合或相互作用的阻断型抑制剂(如阻断型抗体)。
150.典型地，所述的cd44抑制剂包括(但并不限于)：抑制cd44的小分子药物、抗cd44的特异性抗体、核酸药物、基因编辑药物或其组合。
151.在另一优选例中，所述的cd44抑制剂阻断srgn和cd44的结合或相互作用。
152.特别优选的抗cd44的抗体包括(但并不限于)：im7、bivatuzumab、rg
‑
7356、h90、pf
‑
3475952、ro5429083、或其组合。
153.在另一优选例中，所述的cd44抑制剂包括(但并不限于)：hyaluronan
‑
cisplatin conjugate、angstrom6、verbascoside、amc303。
154.典型地，所述的srgn抑制剂包括：抑制srgn的小分子药物、抗srgn的特异性抗体、核酸药物、基因编辑药物或其组合。优选地，所述的核酸药物包括反义rna、microrna。
155.在另一优选例中，所述的srgn抑制剂阻断srgn和cd44的结合或相互作用。
156.特异性抗体
157.在本发明中，术语“本发明抗体”包括“抗cd44的特异性抗体”和/或“抗srgn的特异性抗体”。
158.一方面，本发明包括对人cd44多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人cd44基因产物或片段。较佳地，指那些能与人cd44基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中
抗体包括那些能够结合并抑制人cd44蛋白的分子，也包括那些并不影响人cd44蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人cd44基因产物结合的抗体。
159.另一方面，本发明还包括对人srgn多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人srgn基因产物或片段。较佳地，指那些能与人srgn基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人srgn蛋白的分子，也包括那些并不影响人srgn蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人srgn基因产物结合的抗体。
160.在本发明中，优选的抗体是阻断型抗体，即可阻断srgn与cd44结合或相互作用的抗体。
161.本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如fab'或(fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链fv分子(ladner等人，美国专利no.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
162.本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人cd44基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人cd44蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见kohler等人,nature 256；495,1975；kohler等人,eur.j.immunol.6：511,1976；kohler等人,eur.j.immunol.6：292,1976；hammerling等人,in monoclonal antibodies and t cell hybridomas,elsevier,n.y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人cd44蛋白功能的抗体以及不影响人cd44蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人cd44基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人cd44基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如e.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
163.类似地，本发明的srgn抗体也可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。由于srgn蛋白会被分泌并进入血液的情况下，这些分泌的srgn就可成为血清检测的靶对象。
164.检测方法
165.利用srgn存在于骨巨细胞瘤患者的血清或血液中以及特异性地存在于骨巨细胞瘤的梭形基质细胞中，且与骨巨细胞瘤的发生和进展相关，本发明还提供了检测骨巨细胞瘤的方法。
166.在本发明的一个优选例中，本发明提供一种基于srgn蛋白的检测方法，例如通过检测血清中的srgn水平，例如通过elisa法以及时间分辨免疫荧光法(trfia)。此外，还可检测骨巨细胞瘤组织或梭形基质细胞中的srgn蛋白的表达水平。
167.在本发明的一个优选例中，本发明提供一种基于srgn mrna的检测方法，例如通过检测骨巨细胞瘤组织或梭形基质细胞中的srgn的mrna水平，例如通过ddpcr或荧光pcr等方法。
168.检测方法、分型方法和检测试剂盒
169.基于srgn与骨巨细胞瘤的相关性，并且srgn的浓度不同，骨巨细胞瘤的类型不同，因此srgn可以作为骨巨细胞瘤的一种诊断标志物和分型标志物。
170.本发明提供了一种定量或定性检测人srgn蛋白水平或mrna水平的诊断方法(包括分型方法)。在本发明中，所检测的人srgn蛋白或mrna水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)骨巨细胞瘤以及对骨巨细胞瘤进行分型。
171.一种检测样品中是否存在srgn蛋白的方法是利用srgn蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与srgn蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在srgn蛋白。
172.在本发明中，优选的样品是血液、血清、骨巨细胞瘤组织或其梭形基质细胞。
173.srgn蛋白或其多核苷酸可用于srgn蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或dna芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗srgn的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的srgn蛋白。
174.本发明还提供了一种检测骨巨细胞瘤或对骨巨细胞瘤进行分型的试剂盒，它含有检测srgn基因、mrna、cdna、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测骨巨细胞瘤或对骨巨细胞瘤进行分型；
175.其中，所述的标签或说明书注明以下内容：
176.(i)当检测对象(subject)的血清srgn的浓度≥0.8ng/ml(较佳地，≥0.9ng/ml)，则提示该检测对象发生骨巨细胞瘤的风险高，和/或将该检测对象分型为srgn阳性的骨巨细胞瘤(或srgn型骨巨细胞瘤)；
177.(ii)当检测对象(subject)的血清srgn的浓度＜0.8ng/ml(较佳地，＜0.6ng/ml)，则提示该检测对象发生骨巨细胞瘤的风险低，和/或将该检测对象分型为srgn阴性的骨巨细胞瘤(或非srgn型骨巨细胞瘤)。
178.在一优选实施方式中，本发明还提供了srgn的诊断试剂盒，包括：srgn mrna诊断试剂盒或srgn酶联免疫(elisa)检测试剂盒。
179.药物组合物及施用方法
180.含有本发明的抑制剂及其药学上可接受的无机或有机盐作为主要活性成分的药物组合物，可用于治疗骨巨细胞瘤。
181.本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明抑制剂(尤其是cd44抑制剂)或其药学上可接受的盐及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1
‑
2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5
‑
100mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0182]“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润
湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0183]
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
[0184]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0185]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0186]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3
‑
丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0187]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0188]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0189]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0190]
对于抗体类抑制剂，本发明的药物组合物的剂型优选为注射剂。
[0191]
本发明的cd44抑制剂可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂(包括srgn抑制剂或其他治疗)联合给药。
[0192]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0193]
本发明的主要优点包括：
[0194]
(1)本发明首次发现，骨巨细胞瘤患者的血清srgn蛋白水平显著高于对照组，这表明srgn为一类新的可用于检测骨巨细胞瘤的生物学标记，并可用于对骨巨细胞瘤进行分型。
[0195]
(2)本发明首次发现，可根据血清的srgn蛋白水平，对骨巨细胞瘤患者进行分型，为制定更有针对性的治疗策略提供参考依据。
[0196]
(3)本发明首次发现，梭形基质细胞中特异性高表达srgn，并且梭形基质细胞高表达的srgn与单核细胞上cd44发生作用，进而促进单核细胞分化成多核巨细胞。因此，可采用针对cd44靶点，对骨巨细胞瘤进行靶向治疗。
[0197]
(4)本发明首次发现，使用cd44抑制剂和/或srgn抑制剂可用于治疗骨巨细胞瘤，尤其是联合应用时可更有效和协同地治疗骨巨细胞瘤，为临床上治疗骨巨细胞瘤提供了新的治疗方案。
[0198]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york：cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0199]
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
[0200]
材料
[0201]
gctb
‑
1、gctb
‑
2和gctb
‑
3等细胞为来源于不同病人的骨巨细胞瘤细胞系。
[0202]
u2os细胞：人骨肉瘤细胞
[0203]
mg63细胞：人骨肉瘤细胞
[0204]
通用方法
[0205]
(1)病人血清样本的检测：获得病人血清样本后，立即在
‑
80℃冻存。检测前，将血清样本在冰上融化，在4℃以3000转/分钟离心5分钟，吸取上清并按照srgn elisa试剂盒(购自uscn公司)稀释并检测病人血清样本的srgn浓度。
[0206]
实施例1
[0207]
抑制cd44能够在体外减少破骨细胞的形成
[0208]
首先使用了srgn过表达的hfob1.19细胞的条件性培养基与srgn重组蛋白在体外诱导破骨细胞的形成。
[0209]
结果表明，无论使用小鼠原代骨髓细胞或者raw264.7细胞系，srgn均能明显地促进破骨细胞的形成。然而，当进一步加入cd44的中和抗体之后，破骨细胞的形成则受到了明显的抑制(图1的a
‑
h)。
[0210]
此外，在raw264.7细胞中利用crispr
‑
cas9技术敲除了cd44基因(图1i)。
[0211]
结果表明，在cd44被敲除之后，无论是srgn过表达的hfob1.19细胞的条件性培养基或者srgn重组蛋白都无法继续促进破骨细胞的形成(图1的j
‑
m)。
[0212]
这些结果说明了在体外抑制cd44之后能够减少破骨细胞的形成。
[0213]
实施例2
[0214]
cd44中和抗体在小鼠体内抑制多核巨细胞的形成与骨巨细胞瘤的生长
[0215]
在本实施例中，首先通过胫骨注射的方式将骨巨细胞瘤细胞gctb
‑
19注射到免疫缺陷的nod/scid小鼠体内。在注射细胞一周后，以每两天一次的频率给小鼠注射cd44中和抗体或者igg对照。由于肿瘤细胞预先标记了荧光素酶，通过给小鼠注射荧光素酶底物进行活体成像就可以追踪肿瘤细胞在体内的生长。
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