淫羊藿次苷Ⅱ在制备抗柯萨奇病毒B组3型药物中的应用

淫羊藿次苷ⅱ在制备抗柯萨奇病毒b组3型药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及中药制药技术领域，涉及中草药淫羊藿中的特异单体淫羊藿次苷ⅱ在制备抗病毒药物组合物中的应用，具体是淫羊藿次苷ⅱ在制备抗柯萨奇病毒b组3型药物中的应用。


背景技术：

2.病毒性心肌炎(viral myocarditis，vmc)指由嗜心性病毒感染引起的，以心肌细胞变性、坏死和间质炎性细胞浸润及纤维渗出为主要改变的心肌疾病，是临床最常见的感染性心肌病，可并发严重的心律失常、心力衰竭、心源性休克、猝死。其致病病原体主要是柯萨奇b组病毒(coxsackieviruses group b，cvb)，在cvb的六个血清型中，cvb3具有强嗜心性。cvb3属于小核糖核酸病毒科肠道病毒，无包膜的单正链rna病毒。感染患者中10％
‑
20％可进展至扩张性心肌病，少数重症患者可发生心力衰竭甚至死亡。目前临床对于病毒性心肌炎的治疗主要以改善左心功能不全的对症支持治疗为主，暂无特异性治疗的药物，均建议给予特异性抗病毒治疗。故不断发掘新的有效的抗cvb3药物，对病毒性心肌炎的治疗意义重要。
3.中药淫羊藿(epimedium brevicornu maxim)别名仙灵脾、千两金、放杖草等，为小檗科淫羊藿属植物，普遍分布于我国贵州、四川、辽宁、江西、陕西、湖南、湖北等地。淫羊藿最早记载见于《神农本草经》，具有极高的药用价值，其应用历史悠久，据记载，淫羊藿的主要功效有补肾壮阳、祛风除湿等。现代研究表明，淫羊藿在临床上可用于治疗乳房肿块、高血压等疾病，还有增强人体免疫功能、延缓衰老、防治神经性疾病等作用。
4.淫羊藿次苷ⅱ是从淫羊藿中提取的一种多羟基黄酮类单体成分，是淫羊藿的有效成分之一，文献报道其具有治疗勃起功能障碍、抗缺血性脑损伤、抗肿瘤等作用，但未见有关淫羊藿次苷ⅱ抗cvb3作用的报道。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供一种淫羊藿次苷ⅱ在制备抗cvb3药物中的应用。
6.本发明的目的之一是提供淫羊藿次苷ii或其药学上可接受的盐作为活性成分在制备抗柯萨奇病毒b组3型药物中的应用。
7.所述柯萨奇病毒b组3型感染所致的疾病包括：人类病毒性心肌炎、无菌性脑炎和新生儿全身性感染等疾病。
8.本发明的目的之二是提供淫羊藿次苷ii或其药学上可接受的盐作为活性成分在抑制柯萨奇病毒b组3型复制药物中的应用。
9.本发明的目的之三是提供淫羊藿次苷ii或其药学上可接受的盐作为活性成分在制备病毒性心肌炎、无菌性脑炎或者新生儿全身性感染治疗药物中的应用。
10.本发明所述的淫羊藿次苷ⅱ的分子式为：c
27
h
30
o
10
(可市购)。
11.本发明对上述分子式为c
27
h
30
o
10
的淫羊藿次苷ⅱ进行了下述实验：
12.以cvb3感染的vero(非洲绿猴肾)和hela(海拉)细胞为研究模型，检测淫羊藿次苷ⅱ对cvb3感染后细胞病变效应(cell cytopathic effect，cpe)的影响；对上清中病毒滴度的影响；对cvb3 mrna的影响。检测结果显示，淫羊藿次苷ⅱ能够在vero和hela细胞中抑制cvb3引起的cpe，降低病毒滴度，抑制cvb3 mrna的转录水平。
13.实验结果证明，淫羊藿次苷ⅱ具有明显的抗cvb3作用，可用于制备抗cvb3的药物、可用于制备抗cvb3 mrna抑制的药物，同时还可制备由cvb3引起的病毒性心肌炎、无菌性脑炎和新生儿全身性感染等疾病的药物。
附图说明
14.图1是用cck8法检测淫羊藿次苷ⅱ对vero细胞生长的影响示意图；
15.图2是用cck8法检测淫羊藿次苷ⅱ对hela细胞生长的影响示意图；
16.图3是在vero细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3引起cpe的影响示意图；
17.图4是在hela细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3引起cpe的影响示意图；
18.图5是用reed
‑
muench公式计算淫羊藿次苷ⅱ作用于cvb3感染的vero细胞后，病毒滴度的变化示意图；
19.图6是用reed
‑
muench公式计算淫羊藿次苷ⅱ作用于cvb3感染的hela细胞后，病毒滴度的变化示意图；
20.图7是用荧光定量pcr法检测淫羊藿次苷ⅱ作用于cvb3感染的vero细胞后，对cvb3 mrna转录水平的影响示意图；
21.图8是用荧光定量pcr法检测淫羊藿次苷ⅱ作用于cvb3感染的hela细胞后，对cvb3mrna转录水平的影响示意图。
具体实施方式
22.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
23.1、cck8筛选淫羊藿次苷ⅱ作用vero细胞最大无毒浓度
24.取处于对数生长期的vero细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于96孔板中，1
×
104个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，将不同浓度的淫羊藿次苷ⅱ(5μm、10μm、15μm、20μm和25μm)加入96孔板中，每个稀释度接种5个孔为实验组，设5个孔只加培养基、细胞为实验对照组，另设5孔只加培养基作空白对照，每孔0.1ml。置于37℃，5％co2培养箱中培养，分别于培养24h、48h后采用cck8法测定od值，计算细胞存活率。
[0025][0026]
如图1所示，本发明用cck8分析的方法检测药物对细胞生长的影响，采用本领域实验公认的细胞模型vero，选用的淫羊藿次苷ⅱ浓度分别为5μm、10μm、15μm、20μm和25μm，实验数据进行单因素方差分析，结果显示浓度大于20μm的淫羊藿次苷ⅱ对vero细胞的生长有明显的影响(p<0.05)。
[0027]
2、cck8筛选淫羊藿次苷ⅱ作用hela细胞最大无毒浓度
[0028]
实验方法同上，但细胞种板量为2
×
104个/孔。
[0029]
如图2所示，采用cvb3特异性细胞模型hela，选用的淫羊藿次苷ⅱ浓度分别为10μm、15μm、20μm、25μm和30μm，实验数据进行单因素方差分析，结果显示浓度大于20μm的淫羊藿次苷ⅱ对hela细胞的生长有明显的影响(p<0.05)。
[0030]
3、在vero细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3引起cpe的影响
[0031]
取处于对数生长期的vero细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞接种于24孔板中，1
×
105个/孔，待细胞长满单层，弃去培养液，pbs清洗2
‑
3次，以moi＝0.1的cvb3感染vero细胞，2h后，吸出病毒液，替换为2％fbs培养基配置的含不同浓度淫羊藿次苷ⅱ的培养基，同时设淫羊藿次苷ⅱ单独给药组，cvb3感染组，阴性培养基对照组。24h后在光学显微镜下观察cpe。如图3所示，cpe是病毒在宿主细胞中复制后导致细胞内发生一系列变化，如：开始时，细胞核发生变化，染色质着边，核浓缩，随后细胞膜发生变化，失去黏附作用，细胞变圆，从培养瓶壁脱落，或细胞互相融合等。这些变化可通过光学显微镜检查。结果显示：和cvb3感染组相比，淫羊藿次苷ⅱ浓度为10μm、15μm和20μm时能有效抑制cvb3引起的cpe，特别是20μm。
[0032]
4、在hela细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3引起cpe的影响
[0033]
实验方法同上，但细胞量为2
×
105个/孔，观察时间为加药后17h。结果显示：如图4所示，和cvb3感染组相比，淫羊藿次苷ⅱ浓度为15μm、17.5μm和20μm时能有效抑制cvb3引起的cpe，特别是20μm
[0034]
是用reed
‑
muench公式计算淫羊藿次苷ⅱ作用于cvb3感染的vero细胞后，病毒滴度的变化示意图；
[0035]
5、在vero细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3病毒滴度的影响
[0036]
种板，接毒以及加药方式同3，加药24h后，收集细胞上清，4℃，12000rpm，离心10min，再次收集细胞上清，备用。
[0037]
取对数生长期的vero细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，按照1
×
104个/ml的浓度接种于96孔板中，每孔100μl，待细胞长满单层，弃去培养液，用pbs清洗两遍，将收集的上清病毒液用dmem/f
‑
12培养基依次10倍稀释(10
‑1～10
‑
10
)，每个稀释度接种8个孔，另设8孔作空白对照，只加无血清的dmem/f
‑
12培养基，每孔0.1ml。置于37℃，5％co2培养箱中培养，每日观察并记录cpe情况，连续72h，用reed
‑
muench公式计算病毒液的50％细胞感染剂量(50％tissue culture infective dose，tcid
50
)。
[0038][0039]
如图5所示，和病毒感染组相比淫羊藿次苷ⅱ10μm、15μm和20μm能降低细胞上清中由cvb3感染引起的滴度，且差异具有统计学意义。
[0040]
6、在hela细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3病毒滴度的影响
[0041]
种板，接毒以及加药方式同4，加药17h后，后续检测同上。
[0042]
如图6所示，和病毒感染组相比淫羊藿次苷ⅱ17.5μm和20μm能降低细胞上清中由cvb3感染引起的滴度，且差异具有统计学意义。
[0043]
7、在vero细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3 mrna转录水平的影响
[0044]
种板，接毒以及加药方式同3，加药24h后，收集细胞提取总rna，流程如下：
①
取出6孔板，置于冰上，pbs清洗2次，加入1ml trizol裂解5
‑
10min，转移裂解液至ep管中；
②
加入
0.2ml氯仿，涡旋震荡仪震荡30s，室温静置15min。12000rpm，4℃离心15min；
③
取上层无色水相置于新ep管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min,12000rpm，4℃离心10min；
④
弃上清，取1ml 75％乙醇洗涤rna沉淀，上下颠倒洗涤，12000rpm，4℃离心8min；
⑤
弃上清，待沉淀rna残留的乙醇挥发后，取30μl rnase
‑
free water溶解rna沉淀，冻于
‑
80℃冰箱。
[0045]
根据所得rna浓度值，定量为1μg，计算所需rna样本的量。将提取的rna在20μl体系中进行反转录为cdna，反应程序为：37℃，15min；85℃，5sec，4℃保存，反应体系如下：
[0046]
表1实时荧光定量pcr反转录体系
[0047][0048]
表2实时荧光定量pcr引物序列
[0049][0050]
将获得的cdna为模板，每个样品三个重复，以β
‑
actin为内参，在荧光定量pcr仪中进行扩增，反应程序为：95℃，30s；(95℃，3s
→
60℃，30s)
×
40次循环，溶解曲线仪器默认，反应体系如表：
[0051]
表3实时荧光定量pcr反应体系
[0052]
[0053]
实验重复三次，利用graphpad prism5软件进行数据分析作图，用β
‑
actin做内参、2
‑△△
ct
计算结果，计算各组之间的相对水平。
[0054]
如图7所示，淫羊藿次苷ⅱ20μm能有效降低cvb3 mrna的转录水平。
[0055]
8、在vero细胞中观察淫羊藿次苷ⅱ对cvb3 mrna转录水平的影响
[0056]
种板，接毒以及加药方式同3，加药17h后，后续检测同上。
[0057]
如图8所示，淫羊藿次苷ⅱ15μm、17.5μm和20μm能有效降低cvb3 mrna的转录水平。
[0058]
综合以上实验结果得出结论：淫羊藿次苷ⅱ有明显抑制cvb3复制的作用，具有明显的抗cvb3作用，可用于制备抗cvb3的药物、可用于制备抗cvb3 mrna抑制的药物，同时还可制备由cvb3引起的病毒性心肌炎、无菌性脑炎和新生儿全身性感染等疾病的药物。
[0059]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。