一种治疗不孕症的中药组合物及其制备方法、应用与流程

1.本发明属于不孕症中药研究技术领域，具体涉及一种治疗不孕症的中药组合物及其制备方法、应用。


背景技术：

2.高泌乳素血症是指由内外环境因素引起的，以催乳素升高、闭经、溢乳、无排卵和不孕为特征的综合征。在育龄期间，备受关注的除了月经的异常外，应该就是高泌乳素血症所致的排卵功能障碍性不孕症了。在生育年龄妇女中的发病率约为6％
‑
10％，基于其混乱的内分泌状态及持续的无排卵，导致了相当一部分患者发生了生殖障碍，此类患者不孕症发病率很高，据统计由此导致的不孕症约占到女性无排卵性不孕症的75％之多。
3.中医将高泌乳素血症归属于“闭经”、“乳汁自出”、“月经过少”等范畴。引起高泌乳素血症的原因主要是肾虚肝郁，肾为先天之本，主生殖、藏精，肾精亏虚则冲任失调，血海空虚，无血可下而致闭经，若肝郁疏泄失职，气血逆乱，则乳汁自出。
4.西医研究中，高泌乳素血症的病理生理及发病机制非常的复杂，至今仍无定论，可能与肾上腺功能初现时功能过盛、膜岛素样生长因子异常、神经内分泌功能失调及遗传等诸多因素相关。但迄今都尚未能够形成较为完整而成熟的理论。
5.目前国内外公认的高泌乳素血症的治疗方法主要有以下几种：溴隐亭、左旋多巴(levo
‑
dopa)、八氢苯并喹啉(cv205
‑
502)、维生素b6等及促排卵治疗等，但都价格昂贵，且目前都尚未获得循证医学证据的明确支持。中药用时长，一般需要持续用药三个月经周期(即连续三个月时间)，但其相对西药在有效性方面具有明显优势。开郁种玉汤在治疗肝郁型不孕症显示出较好效果，但是其针对高泌乳素血症型不孕症、卵泡张力不足及发育不良迟缓症的治疗未见报道。


技术实现要素：

6.针对以上技术问题，本发明提供一种治疗不孕症的中药组合物，能够降低泌素激素水平、增长子宫内膜厚度并恢复卵泡正常发育，最终有效助孕。
7.本发明提供一种治疗不孕症的中药组合物，其按重量份数计由以下原料组成：当归10
‑
15份、炒白术15
‑
25份、炒白芍20
‑
25份、炒香附子8
‑
12份、牡丹皮10
‑
12份，茯苓12
‑
15份、天花粉7
‑
9份、苦楝子4
‑
6份、路路通10
‑
12份、王不留行6
‑
12份、蒲公英8
‑
12份。
8.优选地，其按重量份数计由以下原料组成：当归10份、炒白术15份、炒白芍20份、炒香附子12份、牡丹皮12份、茯苓15份、天花粉7份、苦楝子6份、路路通10份、王不留行12份、蒲公英8份。
9.优选地，所述炒白术为土炒制，所述炒白芍为黄酒炒制，所述炒香附子为醋炒制，所述苦楝子及所述王不留行均为清炒。
10.本发明还提供了上述治疗不孕症的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：按重量份数称取各中药原料，混合后加水煎煮，收集煎煮液，浓缩，即得所述中药组合物。
11.优选地，所述加水煎煮的具体步骤是：将各中药原料混合，加入相当于药材总重量6
‑
8倍量的水浸泡30
±
5min后，煎煮30
±
5min，过滤，收集第一次滤液；滤渣再次加入相当于药材总重量4
‑
6倍量的水，继续煎煮30
±
5min，过滤，收集第二次滤液；合并两次滤液，即得所述煎煮液。
12.优选地，所述浓缩是将所述煎煮液浓缩至含生药量为2g/ml。
13.本发明还提供了上述治疗不孕症的中药组合物在制备治疗高泌乳素血症型不孕症的药物中的应用。
14.本发明的另一个目的是提供一种用于治疗高泌乳素血症型不孕症的中药制剂，其以上述中药组合物为活性成分，并辅以药学上可接受的辅料及载体。
15.本发明提供的治疗不孕症的中药组合物，方中重用白芍，养血调肝、解其郁；牡丹皮，苦辛微寒，入心、肝血分，专功凉血散瘀，且具有凉血而不留瘀，活血而不妄行的特点，此二药为君；当归、香附子，养血疏肝、解郁柔肝，为臣；佐以白术培土健脾，制约肝克脾土，又以茯苓健脾宁心；使以天花粉滋阴生津，再助养肝阴为最妙；新增王不留行、路路通、蒲公英，三药同入肝胃经，通利血脉、通经络、散结消肿，加入少量苦楝子，此四药为使，四药联用，更增强化解肝气郁结，辅助臣药养血疏肝、解郁柔肝的功效，降低泌乳素功效倍增。全方具有疏肝解郁、滋阴养血、清热除烦的功效，用于经前期紧张综合症、不孕症伴有血清泌乳素增高，症属肝郁化热、阴血亏虚者。
16.对比现有技术，本发明的有益效果为：
17.1、本发明提供的中药组合物，全方具有疏肝解郁、滋阴养血、清热除烦、用于经前期紧张综合症、不孕症伴有血清泌乳素增高，症属肝郁化热、阴血亏虚者，症见月经不调或闭经，或婚后久不受孕，胸胁或乳房胀痛，头晕目眩，心烦易怒，失眠，多梦，口燥咽干，腰膝酸软，舌红苔薄黄或薄白而干，脉弦细而数；临床验用结果表明安全、有效、对人体无毒副作用。
18.2、与传统“开郁种玉汤”比较，临床应用和基础实验结果显示，本方剂可以通过增加其对降低高泌素激素水平、增长子宫内膜厚度及恢复卵泡正常发育的疗效并最终有效助孕。
19.3、传统“开郁种玉汤”主要用于疏肝解郁、调经种子，治妇人肝气郁结所致的不孕症；本发明方组治疗高泌乳素血症型不孕症主要针对泌乳素激素水平较高的肝郁型患者无法成功受孕，主要通过养血疏肝、柔肝健脾的方式进行调理，且根据患者月经周期关键时间节点进行周期性合理用药，达到让患者高泌乳素血征的症状消失、子宫内膜增厚、卵泡发育成熟后成功受孕直至成功生产的目的。
附图说明
20.图1是在体外诱导原代小鼠子宫内膜上皮meec细胞的增殖结果；
21.图2是在体外诱导人脐静脉血管内皮细胞的增殖结果；
22.图3是对小鼠体重、卵巢重量、子宫重量的影响；a、体重；b、子宫重量；c、卵巢重量；
23.图4是prl模型小鼠卵巢组织的h&e染色结果；a、正常对照组；b、模型组；c、对比例1组；d、对比例2组；e、本发明方组；
24.图5是高泌乳素血症不孕症的育龄女性患者的临床b超检测结果；a、治疗前；b、本
发明方治疗后。
具体实施方式
25.下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
26.本发明提供一种治疗不孕症的中药组合物，其按重量份数计由以下原料组成：当归10
‑
15份、炒白术15
‑
25份、炒白芍20
‑
25份、炒香附子8
‑
12份、牡丹皮10
‑
12份、茯苓12
‑
15份、天花粉7
‑
9份、苦楝子4
‑
6份、路路通10
‑
12份、王不留行6
‑
12份、蒲公英8
‑
12份。
27.上述中药组合物能够治疗高泌乳素血症型不孕症，于月经前期10天使用。
28.下面结合具体实施例对本发明提供的中药组合物进行说明：
29.实施例1
30.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：当归12g、炒白术15g、炒白芍20g、炒香附子8g、牡丹皮10g、茯苓12g、天花粉9g、苦楝子4g、路路通10g、王不留行6g、蒲公英8g。
31.实施例2
32.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：当归15g、炒白术25g、炒白芍25g、炒香附子12g、牡丹皮10g、茯苓15g、天花粉9g、苦楝子6g、路路通12g、王不留行12g、蒲公英12g。
33.实施例3
34.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：当归10g、炒白术15g、炒白芍20g、炒香附子12g、牡丹皮12g、茯苓15g、天花粉7g、苦楝子6g、路路通10g、王不留行12g、蒲公英8g。
35.实施例4
36.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：当归12g、炒白术20g、炒白芍22g、炒香附子10g、牡丹皮12g、茯苓15g、天花粉8g、苦楝子5g、路路通12g、王不留行8g、蒲公英8g。
37.实施例5
38.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：当归15g、炒白术25g、炒白芍20g、炒香附子8g、牡丹皮12g、茯苓15g、天花粉9g、苦楝子6g、路路通10g、王不留行12g、蒲公英8g。
39.实施例6
40.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：当归12g、炒白术18g、炒白芍25g、炒香附子12g、牡丹皮10g、茯苓12g、天花粉9g、苦楝子4g、路路通10g、王不留行6g、蒲公英10g。
41.对比例1
42.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：白芍30g、香附子9g、当归15g、炒白术15g、牡丹皮9g、茯苓9g、天花粉6g。
43.对比例2
44.一种治疗不孕症的中药组合物，其由以下原料组成：当归10g、炒白术15g、炒白芍20g、炒香附子12g、牡丹皮12g、茯苓15g、天花粉7g、王不留行12g、蒲公英8g。
45.上述实施例1
‑
6及对比例1
‑
2的中药组合物的制备方法均是按照以下步骤进行：按重量份数称取各中药原料后混合于非铁质煮器后，加入相当于药材总重量6
‑
8倍量的水浸泡30
±
5min后，煎煮30
±
5min，过滤，收集第一次滤液；滤渣再次加入相当于药材总重量4
‑
6倍量的水，继续煎煮30
±
5min，过滤，收集第二次滤液；合并两次滤液，浓缩至含生药量为2g/ml。
46.下面对本发明提供的中药组合物的治疗效果进行说明：
47.一、对人源细胞和鼠源原代细胞增殖的影响
48.1、分离和培养小鼠原代子宫内膜上皮细胞(meec)
49.动物饲养、检疫、处死解剖后，于无菌条件下收集用pbs清洗后的小鼠子宫组织，剪成约1mm3小碎块，用含1mg/ml胶原酶、2ng/ml dnase的消化液于37℃消化30分钟，再用含10％fbs的dmem培养基终止消化；继续用40μm无菌细胞过滤器收集细胞悬液于离心管中，并用无血清培养基反洗细胞过滤器后，收集细胞过滤器中的腺团块于离心管中，500
×
g离心5分钟，弃上清，收集沉淀，加如1ml 0.25％胰酶(含edta)于37℃摇床孵育10分钟，加9ml培养基终止消化，500
×
g离心5分钟，弃上清，收集meec细胞至细胞培养皿中，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养过夜，开展meec纯度鉴定用于后续实验。
50.2、cck
‑
8法检测细胞增殖的活性
51.选取人脐静脉血管内皮细胞huvec(atcc，美国)、原代小鼠子宫内膜上皮细胞(meec)培养于含10％fbs、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的dmem培养基中，按照5
×
103个细胞(3
×
103huvec细胞)/孔接种于96孔板培养过夜后，用对比例1组(基础方组)、对比例2组(基础方加味王不留行和蒲公英方组)、本发明实施例3(基础方加味王不留行、蒲公英、路路通、苦楝子方组)制备得到的中药组合物分别对细胞(设1.25、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0mg/ml等5个浓度梯度，每个浓度5个复孔，并设溶剂对照组)处理48h后，弃去孔板培养基后，加入ckk
‑
8溶液50μl/孔后，置于37℃培养箱内避光孵育2h
‑
4h，用全波长酶标仪(thermo lab systems，usa)测定各孔在450nm波长的光吸收值(od450)，计算细胞增殖率值。
52.3、结果
53.3.1、cck
‑
8法检测在体外诱导人脐静脉血管内皮细胞、原代小鼠子宫内膜上皮细胞的增殖活性
54.结果如图1
‑
2所示。
55.cck
‑
8实验结果显示(参照图1)，应用对比例1组(即传统“开郁种玉汤”组)、对比例2组(基础方加味王不留行和蒲公英方组)、本发明实施例3提供的中药组合物处理原代小鼠子宫内膜上皮meec细胞48h后，本发明实施例3组效果优于对比例1组、对比例2组，呈浓度依赖式地诱导了meec细胞的增殖活力。
56.此外，结果显示(参照图2)，实施例3提供的中药组合物可以较好诱导人脐静脉血管内皮细胞huvec的增殖活力，例如，5.0mg/ml处理huvec细胞48h后，其对细胞增殖的诱导率达到64.65％，证明本发明方具有促进细胞增殖及血管新生的作用。
57.二、小鼠体内药效学分析实验
58.1.本发明方在体内改善甲氧氯普胺所致小鼠高泌乳素血症综合征
59.1.1高泌乳素血症(prl)小鼠模型的造模及给药方法
60.将饲养于spf级屏障系统动物室并经检疫后的10周龄雌性昆明小鼠(安徽实验动物中心，安徽)随机分为正常对照组、prl模型组；模型组小鼠经背部皮下注射0.1ml灭吐灵(即盐酸甲氧氯普胺注射液，国药集团)，24mg/kg，正常对照组给予0.1ml生理盐水，每日二次，连续注射6天。于末次给药的次日，称量小鼠体重，10％水合氯醛按照3ml/kg经腹腔注射(i.p.)麻醉小鼠，经腹主动脉穿刺采血后elisa法测定小鼠血清泌乳素(prl)水平。小鼠血清泌乳素升高者为prl小鼠模型造模成功。
61.随后，将造模成功的prl模型小鼠随机分为模型组、对比例1组、对比例2组、本发明实施例3组各10只，并取正常对照组10只；各组小鼠均常规同条件喂养。治疗组使用本发明实施例3制备得到的中药组合物给药；对比例1组、对比例2组及本发明实施例3组经口服灌胃治疗20.0g生药/kg，模型组给予等量生理盐水口服灌胃；各组均连续给药20天，并观察动物临床表现。按照上述实验方法称重，解剖各组小鼠采集动脉血进行血清学泌乳素(prl)水平测定，收集称重小鼠子宫、卵巢等脏器组织后于10％福尔马林溶液中固定保存，制备标本用于组织学检测。
62.1.2组织标本的制备
63.病理切片的制备包括脱水、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等步骤，最后置于显微镜下观察。具体步骤如下：
64.(1)脱水：取出固定好的小鼠脏器组织，自来水流水下充分冲洗，然后采用梯度浓度的乙醇对固定好的组织进行脱水，即乙醇浓度由低到高，逐层将组织中水分以乙醇置换出来，将组织按照梯度乙醇的浓度为50％处理2h、70％处理2h、80％处理2h、95％(2次)处理各1h、100％(2次)处理个1h的顺序处理；
65.(2)透明：将脱水处理后的组织浸入二甲苯ⅰ处理60min和二甲苯ⅱ处理60min透明；
66.(3)浸蜡与包埋：将固定好的组织浸入融化的石蜡(55
‑
60℃)中处理40分钟，重复2
‑
3次。然后进行包埋，将蜡块模具放置到包埋机制冷板上，先少量滴加融化的石蜡，在石蜡未完全凝固前，将浸蜡充分的组织立于模具内，待模具底部的石蜡完全凝固后，继续加入新的液态石蜡，淹没整个组织块，然后将包埋框反向固定在模具上，包埋框中继续加入石蜡，待整个蜡块完全凝固后，将模具取下，即为包埋好的蜡块；
67.(4)切片：将蜡块表面修理平整，直到切下的石蜡薄膜上面可见少量组织时，再将切片机的切片厚度调整为5μm，继续休整蜡块，待肉眼观察切下的石蜡薄膜所涵组织面完整，即可进行切片，切片厚度为4
‑
5μm。将切片薄膜平摊在摊片机中(温度55
‑
60℃)展平组织切片，应用载玻片缓缓向上捞出薄膜切片，使薄膜附着在载玻片中央位置后，将载玻片置烘片机上烘烤2h以上；
68.(5)脱蜡：二甲苯ⅰ和ⅱ各处理20分钟后，梯度乙醇(100％、95％、80％、70％、50％)，每次5分钟，最后于蒸馏水中浸泡5分钟；
69.(6)h&e染色：首先，用0.5％苏木素染色液染色组织切片3分钟，自来水冲洗浮色后，1％氨水反蓝，再用自来水冲洗后，以1％盐酸乙醇分化，将不应着色部分的颜色脱掉，自来水冲洗30分钟以上，对细胞核进行染色。其次，用0.5％伊红溶液进行复染10分钟，使胞质
染成红色后，经95％的乙醇2次，每次1分钟，100％的乙醇2次，每次5分钟，进行彻底脱水。再次，将切片浸入二甲苯中2次，每次10分钟进行透明处理；
70.(7)封片：用中性树胶对染色好的切片进行封片。在连接照相系统的生物显微镜下观察组织的病理变化并拍照。
71.1.4结果
72.1.4.1对小鼠体重、卵巢重量、子宫重量的影响
73.结果如图3所示。
74.由图3可知，与正常对照组比较，模型组小鼠体重无较大变化(p＞0.05，图3a)、子宫重量降低(
##
p<0.01，图3b)、卵巢重量降低(
#
p<0.05，图3c)。与模型组比较，本发明实施例3组小鼠体重并无变化(p＞0.05)，且与正常对照组比较无统计学差异，说明本发明方组用药具有较好的初步安全性。
75.与模型组比较，对比例1组、对比例2组、本发明实施例3组小鼠子宫重量均恢复正常水平，且本发明实施例3组较对比例1组、对比例2组的恢复效果更好(**p＜0.01，图3b)；与模型组比较，对比例1组、对比例2组、本发明实施例3组小鼠卵巢重量均较模型组升高，其中本发明实施例3组效果最佳(*p＜0.05，图3c)，与正常对照组无统计学显著性差别；说明本发明实施例3组用药具有较好的效果。
76.1.4.2对prl模型小鼠卵巢组织形态学变化的影响
77.结果如图4所示。
78.h&e染色结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠的卵巢呈弥漫性囊样重度改变，可见较多大小不一的裹腔，卵泡膜细胞层较厚并可见部分脱落，粒层细胞多数呈扁平或立方形的不完整形态(图4a
‑
b；50
×
)；与模型组、对比例1组、对比例2组比较，本发明实施例3组小鼠卵巢中有黄体和多个卵泡，近成熟期卵泡有卵细胞、放射冠，颗粒细胞排列紧密，较为明显地改善了卵巢的病变损伤(图4c
‑
e；50
×
)。
79.1.4.3血清性激素水平影响的测定结果
80.结果如表1所示。
81.表1对小鼠血清泌乳素(prl)性激素水平的影响结果
[0082][0083][0084]
注：泌乳素：prolactin(prl)。
[0085]
由表1可知，与正常对照组比较，prl模型组小鼠血清泌乳素(prl)水平显著升高，且有显著的统计学意义(p＜0.05)；与模型组比较，本发明实施例3方组小鼠血清prl水平显著降低，而且本发明实施例3方组的改善作用显著优于对比例1组、对比例2组，均有统计学
意义(p＜0.05)。
[0086]
三、本发明方对高泌乳素血症临床患者治疗效果分析
[0087]
1、高泌乳素血症临床患者治疗有效率统计分析
[0088]
对88个患有高泌乳素血症女性(24岁
‑
40岁)患者的临床检测结果发现，于患者每个月的月经前10天开始连续使用本技术提供的中药组合物10天(每天一剂)，计算为一个疗程，连续治疗1
‑
3个疗程后，有效率达到约96％以上。
[0089]
2、临床患者激素水平统计
[0090]
结果如表2所示。
[0091]
表2对高泌乳素血症临床患者血清泌乳素(prl)水平的影响结果
[0092]
组别数量(n)泌乳素prl(ng/ml)sem治疗前8834.832.86治疗后8816.652.63
[0093]
由表2可知，对高泌乳素血症不孕症的女性患者的临床检测发现，泌乳素(prl)明显升高，使用本技术提供的中药组合物1
‑
3个疗程后，临床检测结果表明，泌乳素prl明显被下调到正常水平范围，且有显著的统计学意义(p＜0.05)，提示本发明方有利于恢复卵泡正常发育提高受孕成功率。
[0094]
3、恢复卵巢功能、卵泡正常发育能力并增强卵泡张力的统计
[0095]
结果如图5所示。
[0096]
对高泌乳素血症不孕症的育龄女性患者的临床检测结果发现，患者由于泌乳素增高导致了双侧卵巢多囊样声像改变、子宫内膜薄型发展(有的子宫内膜厚度仅约为5mm)，使用本技术提供的中药组合物1
‑
3个疗程后，子宫形态大小恢复正常、子宫内膜增厚，卵巢功能能恢复到正常水平，较大程度增强卵泡发育并形成发育成熟的卵泡、宫内妊娠，成功受孕并顺利生产。
[0097]
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。