白头翁汤在制备治疗肺炎药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及白头翁汤在制备治疗肺炎药物中的应用。


背景技术：

2.肺炎(pneumonia)是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由病原微生物、理化因素，免疫损伤、过敏及药物所致。
3.其中，细菌性肺炎是由细菌本身直接侵袭作用，或其产生的毒素、酶类引起组织坏死和炎症反应，其临床表现多样化，病原谱多元化，且容易产生耐药性，因此，需要不断开展抗细菌性肺炎药物的研究工作。
4.病毒性肺炎是由各种不同种类病毒侵染引起的炎症，常表现为发热、咳嗽咳痰、咽部疼痛等上呼吸道感染症状，伴有全身肌肉疼痛、关节疼痛，部分患者可能会继发细菌性肺炎，表现为咳黄痰、胸痛等症状，严重时可导致持续高热状态、混合性呼吸困难等重症肺炎表现，容易暴发流行，死亡率较高；因此，对抗病毒性肺炎药物的开发研究也具有重要意义。
5.白头翁汤(btwd)，为中医方剂名，原料包括白头翁、黄柏、黄连和秦皮，属于清热剂，具有清热解毒，凉血止痢之功效；主治热毒痢疾，腹痛，里急后重，肛门灼热，下痢脓血，赤多白少，渴欲饮水。
6.目前尚无将白头翁汤用于治疗肺炎的相关报道。


技术实现要素：

7.本发明提供了白头翁汤在制备治疗肺炎药物中的应用，其治疗肺炎效果显著，也扩大了白头翁汤的治疗范围。
8.上述白头翁汤包括如下重量份原料：
9.白头翁2份，黄柏3份，黄连3份，秦皮3份。
10.上述白头翁汤的制备方法如下：
11.取白头翁、黄柏、黄连、秦皮，加水浸泡后，加热煎煮，过滤，得到滤渣和水煎液；滤渣重复加水、煎煮、过滤2次，合并3次水煎液，获得白头翁汤。
12.优选地，浸泡时按照原料12倍重量加水，浸泡1
‑
3h；
13.第2次煎煮按照原料10倍重量加水；
14.第3次煎煮按照原料8倍重量加水；
15.每次煎煮时，煮沸后继续加热1h。
16.进一步地，白头翁汤可维持肺泡
‑
血管屏障的完整性，减轻肺水肿和细胞损伤，抑制肺炎炎症反应，抑制细胞凋亡，调控tlr4/nf
‑
κb信号通路。
17.综上所述，本发明白头翁汤用于制备治疗肺炎的药物，适于临床肺炎的治疗，疗效显著。
附图说明
18.图1附图为本发明实施例2各组小鼠肺组织病理观察(h&e染色)代表性图像(100倍放大，n＝3)；
19.图2附图为本发明实施例2各组小鼠肺湿重/干重(w/d)比；
20.图3附图为本发明实施例2各组小鼠balf上清液中总蛋白浓度；
21.图4附图为本发明实施例2各组小鼠肺组织中mpo活性检测；
22.其中，图2
‑
4中，h1n1模型组与空白组比较，#p<0.05，##p<0.01；h1n1模型组与h1n1+白头翁汤给药组比较，*p<0.05，**p<0.01；h1n1模型组与h1n1+地塞米松阳性药组比较，&p<0.05，&&p<0.01，n＝6；
23.图5附图为本发明实施例2各组小鼠balf上清液中il
‑
1β、il
‑
6以及tnf
‑
α的表达水平；
24.图6附图为本发明实施例2各组小鼠血清中il
‑
1β、il
‑
6以及tnf
‑
α的表达水平；
25.其中，图5
‑
6中，h1n1模型组与空白组比较，#p<0.05，##p<0.01；h1n1模型组与h1n1+白头翁汤给药组比较，*p<0.05，**p<0.01；h1n1模型组与h1n1+地塞米松阳性药组比较，&p<0.05，&&p<0.01，n＝6；
26.图7附图为本发明实施例4各组小鼠肺组织病理观察(h&e染色)代表性图像(100倍放大，n＝3)；
27.图8附图为本发明实施例4各组小鼠肺湿重/干重(w/d)比；
28.图9附图为本发明实施例4各组小鼠balf上清液中总蛋白浓度；
29.图10附图为本发明实施例4各组小鼠肺组织中mpo活性检测；
30.其中，图8
‑
10中，kpn模型组与空白组比较，#p<0.05，##p<0.01；kpn模型组与kpn+白头翁汤给药组比较，*p<0.05，**p<0.01；kpn模型组与kpn+地塞米松阳性药组比较，&p<0.05，&&p<0.01，n＝6；
31.图11附图为本发明实施例4各组小鼠balf上清液中il
‑
1β、il
‑
6以及tnf
‑
α的表达水平；
32.图12附图为本发明实施例4各组小鼠血清中il
‑
1β、il
‑
6以及tnf
‑
α的表达水平；
33.其中，图11
‑
12中，kpn模型组与空白组比较，#p<0.05，##p<0.01；kpn模型组与kpn+白头翁汤给药组比较，*p<0.05，**p<0.01；kpn模型组与kpn+地塞米松阳性药组比较，&p<0.05，&&p<0.01，n＝6；
34.图13、14附图为本发明实施例2、4各组小鼠肺组织中bax和bcl
‑
2蛋白免疫组化染色代表性图像，放大100倍，n＝3；
35.图15附图为本发明实施例2、4各组小鼠肺组织中bax和bcl
‑
2阳性细胞率，n＝3；
36.图16附图为本发明实施例2、4各组小鼠elisa检测肺组织中凋亡相关因子caspase
‑
3和caspase
‑
9的活性；
37.其中，图15
‑
16中，模型组与空白组比较，#p<0.05，##p<0.01；h1n1模型组与h1n1+白头翁汤给药组比较，*p<0.05，**p<0.01；kpn模型组与kpn+白头翁汤给药组比较，&p<0.05，&&p<0.01，n＝3；
38.图17、18附图为本发明实施例2、4各组小鼠肺组织中p65和tlr4蛋白的免疫组化染色代表性图像，放大100倍，n＝3；
39.图19附图为本发明实施例2、4各组小鼠肺组织中p65和tlr4阳性细胞率，n＝3；其中，模型组与空白组比较，#p<0.05，##p<0.01；h1n1模型组与h1n1+白头翁汤给药组比较，*p<0.05，**p<0.01；kpn模型组与kpn+白头翁汤给药组比较，&p<0.05，&&p<0.01，n＝3。
具体实施方式
40.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例中计量资料均以表示，用t检验进行统计学处理，p<0.05时两组间差异有显著性。
42.实施例1
43.白头翁汤的制备方法，具体步骤如下：
44.按照《伤寒论》中的药物剂量，分别称量如下原料：
45.白头翁30g、黄柏45g、黄连45g、秦皮45g；
46.各原料置于砂锅中，按下列步骤制备白头翁汤：
47.(1)以12倍重量蒸馏水浸泡2h，大火加热煮沸，沸腾后换成文火加热；从沸腾时开始计时，1h后用纱布过滤药渣，收集水煎液。
48.(2)在上述步骤所得药渣中加入原料10倍重量的蒸馏水，大火加热至沸腾后换成文火加热1h，纱布过滤，收集水煎液。
49.(3)重复步骤(2)，向药渣中加入原料8倍重量的蒸馏水，文火加热1h，纱布过滤，收集水煎液。
50.(4)合并3次水煎液，即为白头翁汤。
51.将白头翁汤加热浓缩至药液含生药浓度为1.4g/ml(即1ml药液对应1.4g原料)，用于后续肺炎疗效研究。
52.实施例2白头翁汤对甲型流感病毒h1n1诱导的小鼠肺炎的保护作用
53.h1n1病毒诱导的肺炎是一种表征良好的、可重复的、高度相似的肺炎模型，可用于检测btwd的治疗潜力。
54.甲型流感病毒h1n1来源：由暨南大学医学院微生物和免疫学教研室提供；
55.取雄性balb/c小鼠，体重在22
±
2g，共60只，随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组(con)、甲型流感病毒h1n1模型组(h1n1)、白头翁汤btwd低(h1n1+bl，3.5g/kg生药量)、中(h1n1+bm，7g/kg)、高(h1n1+bh，14g/kg)剂量组、地塞米松阳性药对照组(dex，5mg/kg)。
56.小鼠在适应性喂养7天后进行预给药，各治疗组每只小鼠分别按照给药剂量灌胃给予实施例1制备的白头翁汤及地塞米松，con组、h1n1组每只小鼠灌胃给予同等量生理盐水，每日1次，连续7天。
57.实验第7天，h1n1组、h1n1+bl组、h1n1+bm组、h1n1+bh组、dex组以每只50μl ld
50
浓度的h1n1病毒滴鼻感染造成肺炎模型。感染6小时后，麻醉小鼠，摘眼球取血，分离血清，
‑
20℃保存，待进一步分析。颈椎脱臼处死小鼠后，取肺组织进行各项指标分析。
58.各组小鼠肺组织剥离后用苏木精和伊红染色(h&e)，观察肺部组织的病理变化，如附图1所示，空白组未见明显异常，与空白组相比，h1n1组有了明显的组织学改变，包括间质水肿、肺泡壁增厚和大量炎性细胞浸润肺泡腔；经btwd预防给药后明显减轻了h1n1诱导的病理改变，且高浓度效果最好。
59.为进一步评价实验中btwd对h1n1诱导的肺炎小鼠的保护机制，对h1n1诱导的肺水肿和微血管通透性相关的几个参数进行了量化：
60.湿/干肺重量比(w/d)：取各组小鼠右肺中叶，称重；肺组织在80℃恒温烤箱中加热48h，然后称重以确定肺的基线干重；计算湿/干肺重量比。
61.肺泡灌洗液(balf)蛋白浓度：取各组小鼠肺叶进行灌洗，使用bca蛋白检测试剂盒(购自南京建成生物公司)检测肺泡灌洗液上清液中的蛋白浓度；
62.肺组织mpo活性：使用mpo检测试剂盒(购自南京建成生物公司)对肺组织中的mpo活性进行评估，在460nm处测量光密度(od)值的变化以计算mpo活性。
63.结果如附图2
‑
4所示，btwd治疗基本消除了h1n1诱导的肺水肿和微血管通透性，可见，btwd对肺泡
‑
血管屏障的完整性、肺水肿和细胞损伤具有较强的保护作用，且其保护作用可能为剂量依赖型。
64.实施例3白头翁汤抑制h1n1诱导的肺炎炎症反应
65.通过酶联免疫吸附测定法(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，elisa)对各促炎性因子在实施例2各组balf和血清中的水平进行测定，结果如附图5、6所示：
66.btwd降低了balf中il
‑
6，il
‑
1β和tnf
‑
α表达水平，同时也降低了血清中il
‑
6，il
‑
1β和tnf
‑
α表达水平。上述结果表明，btwd抑制了肺炎小鼠中h1n1介导的tnf
‑
α，il
‑
6和il
‑
1β的上调，即btwd抑制小鼠肺炎炎症反应，类似于在组织病理学和微血管通透性分析中btwd对肺炎治疗相关的保护作用，且其作用方式可能为剂量依赖型。
67.实施例4白头翁汤对肺炎克雷伯菌(kpn)诱导的小鼠肺炎的保护作用
68.kpn诱导的肺炎是一种表征良好的、可重复的、高度相似的肺炎模型，可用于检测btwd的治疗潜力。
69.肺炎克雷伯菌来源：由广东药科大学生命科学与生物制药学院病原生物学与免疫学教研室提供；
70.取雄性balb/c小鼠，体重在22
±
2g，共60只，随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组(con)、肺炎克雷伯菌模型组(kpn)、白头翁汤btwd低(kpn+bl，3.5g/kg生药量)、中(kpn+bm，7g/kg)、高(kpn+bh，14g/kg)剂量组、地塞米松阳性药对照组(dex，5mg/kg)。
71.小鼠在适应性喂养7天后进行预给药，各治疗组每只小鼠分别按照给药剂量灌胃给予实施例1制备的白头翁汤及地塞米松，con组、kpn组每只小鼠灌胃给予同等量生理盐水，每日1次，连续7天。
72.实验第7天，kpn组、kpn+bl组、kpn+bm组、kpn+bh组、dex组以每只50μl 1～2
×
105cfu/ml kpn菌液滴鼻感染造成肺炎模型。感染6小时后，麻醉小鼠，摘眼球取血，分离血清，
‑
20℃保存，待进一步分析。颈椎脱臼处死小鼠后，取肺组织进行各项指标分析。
73.各组小鼠肺组织剥离后用苏木精和伊红染色(h&e)，观察肺部组织的病理变化，如附图7所示，空白组未见明显异常，与空白组相比，kpn组有了明显的组织学改变，包括间质水肿、肺泡壁增厚和大量炎性细胞浸润肺泡腔；经btwd预防给药后明显减轻了kpn诱导的病
理改变，且高浓度效果最好。
74.为进一步评价实验中btwd对kpn诱导的肺炎小鼠的保护机制，对kpn诱导的肺水肿和微血管通透性相关的几个参数进行了量化，如湿/干肺重量比(w/d)、肺泡灌洗液(balf)蛋白浓度和肺组织mpo活性，具体方法同实施例2.
75.结果如附图8
‑
10所示，btwd治疗基本消除了kpn诱导的肺水肿和微血管通透性，可见，btwd对肺泡
‑
血管屏障的完整性、肺水肿和细胞损伤具有较强的保护作用，且其保护作用可能为剂量依赖型。
76.实施例5白头翁汤抑制kpn诱导的肺炎炎症反应
77.通过酶联免疫吸附测定法(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，elisa)对实施例4各组balf和血清中的促炎性因子水平进行测定，结果如附图11、12所示：
78.btwd降低了balf中il
‑
6，il
‑
1β和tnf
‑
α表达水平，降低了血清中il
‑
6，il
‑
1β和tnf
‑
α表达水平。表明btwd抑制了肺炎小鼠中kpn介导的tnf
‑
α，il
‑
6和il
‑
1β的上调，即btwd抑制kpn诱导的小鼠肺炎炎症反应，类似于在组织病理学和微血管通透性分析中btwd对肺炎治疗相关的保护作用，且其作用方式可能为剂量依赖型。
79.实施例6白头翁汤抑制h1n1与kpn诱导的细胞凋亡
80.bcl
‑
2和bax是bcl
‑
2家族中调节线粒体外膜通透性的两种主要蛋白，h1n1与kpn诱导的细胞凋亡伴随着抗凋亡蛋白bcl
‑
2的表达降低以及促凋亡蛋白bax的表达增加。caspase酶可调控多种与凋亡相关的细胞和生化变化，其中caspase
‑
3和caspase
‑
9为典型的促凋亡蛋白。为了确定btwd是否减少了肺炎小鼠的组织细胞凋亡以及随后的组织损伤，本发明使用免疫组化染色来观察实施例2、4各组小鼠肺组织中凋亡相关蛋白bcl
‑
2和bax的表达。
81.结果如图13
‑
16所示，与预期一样，模型组促凋亡蛋白bax表达明显增多，抗凋亡蛋白bcl
‑
2表达明显下降，caspase
‑
3、9活性显著高于空白组。而btwd处理则能够显著回调上述反应，表明btwd治疗可以抑制肺炎小鼠肺部的凋亡。
82.实施例7白头翁汤通过调控tlr4/nf
‑
κb信号通路抑制肺炎的发生
83.tlr4和p65是tlr4/nf
‑
κb信号通路的主要标志物，采用免疫组化染色法对实施例2、4各组小鼠肺组织中tlr4和p65的表达水平进行检测，结果如附图17
‑
19所示，肺炎模型组的tlr4和p65蛋白阳性区域明显高于空白组；相反，与模型组相比，btwd治疗组tlr4、p65蛋白表达明显降低。上述结果提示，tlr4/nf
‑
κb信号通路在肺炎发生过程中被激活，btwd可以通过调控tlr4/nf
‑
κb信号通路从而抑制小鼠肺炎的发生。
84.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
85.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。