贻贝蛋白-聚氨基酸涂层及其制备方法和应用

1.本发明涉及医疗器械及表面处理，尤其是一种亲水润滑抗菌一体化的复合导尿管涂层的制备方法，属于高分子材料技术领域。


背景技术：

2.伴随现代医学技术的发展，介入式导管在临床和术后恢复阶段得到了广泛的应用。然而，由其引发的相关性感染层出不穷。如病菌在导管基材黏附继而生成生物膜的现象，不仅加剧了患者伤处的恶化，还会进一步使机体形成耐药性，耽误病情的救治。
3.常用的医用导管多由硅胶、聚氯乙烯和聚氨酯等疏水高分子材料制造。它们虽然可以提供不错的机械性能及良好的生物相容性，但由于自身结构的性质，在使用过程中存在一定的阻力，引起很多限制，如插管时摩擦力大，易损伤组织并给患者增加了强烈的疼痛感，除了给患者带来强烈地疼痛灼烧感外，还会损伤人体组织，造成发炎和细菌感染等一系列并发症，给身体和精神带来多方面创伤。并且，虽然导管在使用前会进行灭菌，但在使用过程中难免造成二次污染，并在体内形成细菌感染，给术后的恢复带来了严重的危害。
4.因此，如何实现避免细菌黏附、改进导管表面润滑性能，从而减少二次感染的问题，已成为当今医疗器材领域迫在眉睫的挑战之一。目前，相关学者和企业没有考虑到抗菌和润滑功能的一体化，采用构建功能涂层的方法，分别从润滑或者抗菌方面进行单一改性，所以在综合性能方面存在较大局限性。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术的不足，从综合性能的优化入手，同时解决如何实现医用导管表面亲水及抗菌性能一体化问题，本发明提出了一种贻贝蛋白-聚氨基酸涂层及其制备方法，由于贻贝蛋白的强粘附性和能进行二次反应的优势，能通过化学键的形式将带羧基的亲水润滑高分子材料γ-聚谷氨酸，稳定地引入到导管表面，并且贻贝蛋白本身也具备良好的抗菌性能。因此，可以通过简单的方法形成具有良好生物相容性的亲水润滑抗菌复合涂层，赋予普通医用导管表面亲水润滑和主动抗菌的特性。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种贻贝蛋白-聚氨基酸涂层，包括与待涂覆的装置表面接触的贻贝蛋白层和与该贻贝蛋白层交联的聚氨基酸层，所述贻贝蛋白层由贻贝蛋白类物质构成。
7.本发明进一步提供了上述贻贝蛋白-聚氨基酸涂层的制备方法，提供待涂覆的基材，对其表面进行预处理，然后在室温下将基材放入贻贝蛋白类物质的溶液中浸泡，随后取出放在氮吹仪下均匀吹干，得到贻贝蛋白类物质修饰的基材；将得到的贻贝蛋白类物质修饰的基材浸入聚谷氨酸溶液中进行自组装反应，随后取出放在氮吹仪下均匀吹干，在待涂覆的基材表面得到贻贝蛋白-聚氨基酸涂层。
8.其中，所述聚谷氨酸为γ-聚谷氨酸纯品或者γ-聚谷氨酸盐，如聚谷氨酸钠盐、聚谷氨酸钾盐、聚谷氨酸钙盐；其中，γ-聚谷氨酸的分子量为50-3000kda，优选2000kda。聚谷
氨酸(γ-pga)是微生物利用l-谷氨酸和d-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成的一种阴离子多肽型聚合物，是部分微生物自身分泌的一种自身保护物质，此外，还具有优异的亲水润滑性能，而且γ-pga区别于传统的润滑添加剂(聚乙烯吡咯烷酮、硅烷偶联剂)，拥有更好的可降解能力和更优的生物相容性。
9.所述贻贝蛋白类物质为贻贝足丝蛋白亦被称作贻贝黏附蛋白。
10.γ-聚谷氨酸与贻贝蛋白相互结合形成的稳定涂层，可以利用贻贝蛋白上带有正电荷官能团的化合物先与细胞膜表面带有负电的羧基磷酸相互吸引，进而使病菌的细胞膜受损，丧失生理功能，最终导致病菌死亡，达到主动抑菌得目的；γ-聚谷氨酸的侧链上含有大量羧基，有很好的亲水效果，降低导管表面接触角，达到润滑效果。
11.本发明用γ-pga和贻贝蛋白复合体系作为亲水润滑抗菌的基础，利用二者自聚合原位组装，基材表面构建具有良好生物相容性的亲水润滑抗菌涂层。由于反应在基材表面进行反应，很大程度上保证了其覆盖的均匀性，有利于对导管相关特征进行精确的分析研究，而且反应只需在弱碱条件下即可引发，避免了激烈化学反应对产品造成损害。
12.其中，所述基材为聚氨酯、聚氯乙烯或硅胶等高分子材质。
13.优选地，基材表面预处理为采用等离子体处理、碱煮法或接枝法活化基材表面。在一些具体的实施方式中，等离子体处理为在等离子机中处理5-10分钟；碱煮法为将基材浸泡在浓度为5mol/l左右的naoh溶液中，并在60℃左右的水浴锅中保持6h左右，然后取出基材，用大量的去离子水冲洗，并在空气中自然干燥备用；接枝法为将基材浸泡在作为引发剂的二苯甲酮的有机溶液中(0.1g/ml)，放置30-60min后取出，随后浸入具有亲水润滑性质的聚乙二醇单体溶液(1.0-1.5mol/l)中并用紫外光照射45-60min，即可形成表面具有润滑效果的接枝层，通过聚合反应将反应性的官能团的单体接枝到基材的分子链。
14.在一个优选的实施方式中，在活化基材表面之前，先对基材进行超声清洗处理。在一个实施方式中，所述基材为导管基材，首先将导管基材先裁剪成适合的长度，如5-10cm，然后加入清洗剂无水乙醇，超声，再更换去离子水，继续超声交替清洗三次彻底除去基材上杂物，放入烘箱干燥，随后将干燥好的管材在等离子体机中处理，备用。优选地，两次超声时间均为10-30min，超声使用的功率设为80-100w，烘箱干燥温度设置为60℃，等离子体机中处理时间为5-10min。
15.优选地，所述贻贝蛋白溶液的溶剂为tris-hcl溶液或pbs碱性缓冲溶液(0.01m)，所述tris-hcl溶液的浓度为0.02～0.08g/100ml；所述贻贝蛋白溶液的浓度为2～10mg/ml，ph值为8-9。碱性条件有利于活化贻贝蛋白的官能团，从而进一步与基材及聚谷氨酸反应。
16.所述聚谷氨酸溶液通过如下方法制备得到：将聚谷氨酸加入到去离子水中，常温下磁力搅拌0.5-1h，并超声15-30min促溶，待溶液呈无色透明的状态备用。
17.优选地，所述贻贝蛋白溶液的浓度为2～10mg/ml，ph值为8-9；聚谷氨酸溶液的浓度为0.2g/ml-2g/ml。
18.优选地，先将基材在贻贝蛋白溶液中浸泡5-30min，随后取出放在氮吹仪下均匀吹干，得到贻贝蛋白修饰的基材，然后再浸入聚谷氨酸溶液中5-30min，随后取出放在氮吹仪下均匀吹干，即得到贻贝蛋白-聚氨基酸抗菌润滑医用涂层。
19.本发明进一步提出了贻贝蛋白-聚氨基酸涂层在用于抗菌润滑医用涂层上的应用。
20.本发明进一步提出了一种医用导管，其表面涂覆有贻贝蛋白-聚氨基酸涂层。本发明的贻贝蛋白-聚氨基酸涂层适合应用于医用导管中，如导尿管、透析管、体内介入导管、消化道管、呼吸道管、引流管等。
21.本发明从医用导管润滑及抗菌性能两方面同时入手，借助贻贝蛋白(mfp)能够沉积于大多数材料表面的功能，结合mfp与γ-聚谷氨酸(γ-pga)的多重相互作用，在pu表面制备了mfp-pga功能化涂层。通过一系列表征和性能测试发现：pu/mfp-pga表面具有良好的抗菌润滑性能。本发明丰富了聚电解质自组装的方法，拓展了生物大分子在医用材料上的应用，并在实践中为医用导管的抗菌及润滑需求提供了一体化的解决方案。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
23.(1)本发明从现今医用导管领域亟需解决的抗菌和润滑两个问题入手，创新性的将抗菌和润滑效果统一结合，是市面上单一改性导尿管所不具备的；
24.(2)本发明复合涂层的制备，借鉴了层层自组装技术(以材料间形成离子键为基础进行反应)，本发明利用贻贝蛋白中含有多种抗菌基团，以及能够沉积在塑料、陶瓷、金属等材质表面的特性，在复合涂层中发挥黏附层的作用，进而与聚谷氨酸发生静电组装作用，引入亲水性能优异的羧基，实现抗菌润滑性能一体化设计，利用贻贝蛋白可以与基材表面形成坚实共价键的性质，并在温和条件下促使贻贝蛋白在导管表面自聚合形成稳定的黏附层继而与γ-pga发生静电组装，达到优异的稳定性和覆盖的均匀性，这是普通物理涂层法无法实现的；
25.(3)本发明的复合涂层进行了抗蛋白吸附和抗细菌粘附能力的测试，结果显示其大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共培育下，有良好的抑菌效果和抗蛋白吸附能力，在生物医用材料领域有较好的应用前景；
26.(4)本涂层使用的原材料均具备良好的生物相容性，对人体几乎无毒害作用。
附图说明
27.下面结合附图和具体实施方式对本发明作更进一步的详细说明：
28.图1为实施例1制备的复合涂层的亲水性能对比，其中a为未处理过的pu导尿管基材，b为市售表面经抗菌处理的pu导尿管基材，c为市售表面经润滑处理的pu导尿管基材，d为本发明的经复合涂层处理过的pu导尿管基材；
29.图2为复合涂层的抗菌性能对比，其中，a表示大肠杆菌，b表示金黄色葡萄球菌，1是未处理过的pu导尿管基材，2是市售表面经抗菌处理的pu导尿管基材，3为本发明的经复合涂层处理过的pu导尿管基材，可以观察到，3的接触部位更加透明，细菌生长较少，抗菌效果更好；
30.图3为复合涂层的抗蛋白粘附性能对比，其中，a是未处理过的pu导尿管基材，b是市售表面经抗菌处理的pu导尿管基材，c为本发明的经复合涂层处理过的pu导尿管基材，在同一梯度稀释的样品中，c表面形成的菌落数最少，即抗蛋白吸附性能最优；
31.图4为复合涂层的抗蛋白粘附性能的定量分析，其中，a是未处理过的pu导尿管基材，b是市售表面经抗菌处理的pu导尿管基材，c为本发明的经复合涂层处理过的pu导尿管基材，当在pu表面引入mfp-pga复合涂层后，e.coli和s.aureus在其表面粘附的活细菌的数量分别减少到原pu基材表面的15％和52％，验证了其抗细菌黏附的性能；
32.图5为复合涂层的生物相容性分析，其中a是未处理过的pu导尿管基材，b是市售的pu导尿管基材，c为本发明的经复合涂层处理过的pu导尿管基材。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明做更进一步地解释，可以更好地理解本发明。下列实施例仅用于说明本发明，但不用来限定本发明的实施范围。
34.下述实施例中对亲水性能的考察选用jysp-360型接触角测量仪。首先用静态液滴法在不同基材表面滴落一滴水，然后采取三点法测定不同涂层的接触角角度，测三次后取其平均值即为该涂层接触角的最终结果。
35.实施例1贻贝蛋白-聚氨基酸抗菌润滑医用涂层的制备。
36.通过对不同浓度梯度的贻贝蛋白(贻贝足丝蛋白)及聚谷氨酸溶液形成涂层的考察发现：当贻贝蛋白浓度低于2mg/ml时，其黏附性能较差，参与反应的官能团数量较少，因而与聚谷氨酸结合后的涂层稳定性较差，而超过10mg/ml会使涂层表面的均一性受到影响。
37.同样地，当聚谷氨酸的浓度低于0.2g/ml时，由于浓度较低，起到亲水润滑作用的羧基也随之降低，没有显著润滑效果，而当浓度达到2g/ml时，溶解度降低，不利于实际操作。综上，优选的，贻贝蛋白浓度为2-10mg/ml，聚谷氨酸浓度为0.2-2g/ml。
38.因此，可以选择将贻贝蛋白溶液的浓度为2～10mg/ml之间，聚谷氨酸溶液的浓度为0.2g/ml-2g/ml。下面以贻贝蛋白溶液为2mg/ml，聚谷氨酸溶液浓度为0.2g/ml为例来制备符合涂层。其他浓度的涂层可以按照相同的方法进行制备，可以根据成本和需求对浓度进行调整。
39.复合涂层制备方法：
40.(1)基材预处理：首先将导管基材先裁剪成适合的长度，如5-10cm，然后加入清洗剂无水乙醇，超声，再更换去离子水，继续超声交替清洗三次彻底除去基材上杂物，放入烘箱干燥，随后将干燥好的管材在等离子体机中处理，备用。优选地，两次超声时间均为15min，超声使用的功率设为100w，烘箱干燥温度设置为60℃，等离子体机中处理时间为8min。
41.(2)先将处理好的基材在贻贝蛋白溶液(2mg/ml，溶剂为0.05g/100ml的tris-hcl溶液，配制100ml)中浸泡15min，随后取出放在氮吹仪下均匀吹干，得到贻贝蛋白修饰的基材，然后再浸入聚谷氨酸溶液(分子量：2000kda，浓度：0.2g/ml配制100ml)中15min，随后取出放在氮吹仪下均匀吹干，即得到贻贝蛋白-聚氨基酸抗菌润滑医用涂层。
42.本实施例对制备的复合涂层的亲水性能进行考察，其结果如图1所示，其中a为未处理过的pu导尿管基材，b为市售表面经抗菌(通过在基材原料中添加银离子等无机重金属添加剂)处理的pu导尿管基材，c为市售表面经润滑处理(通过在表面涂覆聚乙烯吡咯烷酮或石蜡等润滑剂)的pu导尿管基材，d为本发明的经复合涂层处理过的pu导尿管基材，可以直接观测到经过本发明亲水润滑抗菌处理过的导尿管表面亲水性更好。这些结果充分说明，本发明地复合涂层在亲水性能上表现优异，说明本发明地涂层具有良好的亲水润滑性能。
43.实施例2大肠杆菌菌种(atcc 25933)和金黄色葡萄球菌菌种(atcc 6538)的活化。
44.本实施为实施例3和实施例4地前期准备工作，主要有培养基配制和菌种活化，具
体如下：
45.(1)培养基配制
46.本实验使用的是溶菌肉汤(lysozyme broth)液体培养基，具体配制流程如下：首先称取1克胰酪蛋白胨、0.5克酵母提取物和l克nac1粉末溶于100毫升蒸馏水，混匀后在121摄氏度的高压灭菌锅内液体灭菌30分钟，随后于4摄氏度冰箱保存备用。
47.(2)菌种活化
48.将-80摄氏度冷藏箱中保存的大肠杆菌菌种(atcc 25933)和金黄色葡萄球菌菌种(atcc 6538)取出解冻，吸取1毫升于提前灭好菌的100毫升lb肉汤锥形瓶中(超净台中操作)，随后将锥形瓶放置于恒温摇床上(温度设置在37摄氏度左右)培养12小时，随后于4摄氏度冰箱保存，备用。
49.实施例3贻贝蛋白-聚氨基酸抗菌润滑医用涂层的抗菌性能测试。
50.称取15克琼脂粉溶解于100毫升lb中，随后放在立式高压蒸汽灭菌锅，参数设置为：121℃灭菌30分钟。随即在超净台中将其趁热倒入细胞培养皿，风干备用。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养液用pbs缓冲液稀释至106cfu/ml。吸取100微升稀释的菌液均匀滴在lb培养板中，用涂布棒均匀涂布至菌液完全吸收。将1、2、3三种基材(1是未处理过的pu导尿管基材，2是市售表面经抗菌处理的pu导尿管基材，3为本发明的经复合涂层处理过的pu导尿管基材)贴壁至固体培养板，放置于37℃恒温培养箱中孵育12小时。观察材料底部和周围抑菌圈形成情况，并用相机拍照记录。本实施例对制备的复合涂层的抗菌性能进行考察，其结果如图2所示。可以观察到，经过复合涂层处理过的基材，接触部位更加透明，细菌生长较少，抗菌效果更好。这些结果充分说明，本发明地复合涂层在抗菌上表现优异。
51.实施例4贻贝蛋白-聚氨基酸抗菌润滑医用涂层的抗蛋白吸附性能测试。
52.将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养液用pbs缓冲液稀释至107cfu/ml。将a、b、c三种基材用灭菌后的镊子夹至在24孔板中，随后在孔眼中滴入1毫升稀释过的菌液，并放在37℃恒温培养箱中静置孵育4h。将孔眼中的菌液吸出，缓慢加入1毫升pbs缓冲液清洗基材表面，来除去未牢固粘附的细菌，该步骤重复三次。将清洗后的片材取出，置于含有3ml的pbs缓冲液的离心管中，超声处理5分钟，以剥离片材表面粘附的细菌。将从表面剥离的细菌溶液按照一定的倍数进行梯度稀释，吸取100微升梯度稀释的菌液均匀地滴在lb-琼脂培养板上，接着用涂布棒均匀涂布，直到菌液被琼脂培养板完全吸收。随后将lb-琼脂板放在恒温培养箱(模拟常态人体温度设温)中过夜孵育，观察lb-琼脂培养板上细菌繁衍状态，统计菌落数，并用相机拍照记录。本实施例对制备的复合涂层的抗蛋白黏附性能进行考察，其结果如图3-图5所示。可以观察到，在同一梯度稀释的样品中，经过复合涂层处理过的基材表面形成的菌落数最少，并且，e.coli和s.aureus在其表面粘附的活细菌的数量分别减少到原pu基材表面的15％和52％，验证了其抗细菌黏附的性能，这些结果充分说明，本发明地复合涂层在抗蛋白吸附性能上表现优异。
53.实施例5贻贝蛋白-聚氨基酸抗菌润滑医用涂层的生物相容性测试。
54.本实施例对制备的复合涂层的生物相容性进行考察。
55.利用噻唑蓝(mtt)法检测a、b、c三种基材对l929小鼠成纤维细胞的细胞毒性。将a、b、c基材浸泡在基础细胞培养基中，在4℃冰箱中保存1、2和3天。在96孔板中每孔接种细胞，并置于37℃恒温培养箱中孵育36小时，吸出孔中的培养基，将其替换基材预处理的培养基，
以未经任何处理的dmem培养基作为对照组。在37℃培养箱中分别孵育24和48小时后，吸出培养基，用pbs缓冲液轻轻冲洗每个孔，该步骤重复三次。向孔中加入0.2毫升mtt的dmem溶液(0.5毫克/毫升)，37℃恒温培养箱中孵育4小时。轻轻吸出培养基，向孔中加入0.2毫升二甲基亚砜以溶解蓝紫色结晶甲臜。15分钟后利用酶标仪测定溶液在570纳米处的吸光度，实验结果相对于对照组，用百分数表示。其结果如图5所示。该结果表明：复合涂层处理下的小鼠细胞72h存活率高达90％，涂层对小鼠成纤维细胞几乎没有任何毒性作用。
56.采用本发明方法制备的亲水润滑抗菌复合涂层覆盖均匀，稳定性强。本发明制备工艺简便，快速，可实现导管功能化，并可应用于工业化生产，在解决医用导管抗菌需求、体内避免细菌二次感染；减少病患插管痛苦；以及在优化手术过程，促进患者术后恢复等方面，具有良好的市场前景。