卵黄高磷蛋白的用途

1.本发明涉及蛋白技术领域，尤其涉及一种卵黄高磷蛋白的用途。


背景技术：

2.一直以来针对幽门螺杆菌的治疗问题都备受关注，早期在临床方面的治疗多采用“三联疗法”来作为根除幽门螺杆菌的主力方案，药物配方包括ppi、克拉霉素、阿莫西林等。但是目前对于该种疗法中涉及到的几种药物，幽门螺杆菌均已经表现出了很高的耐药性。目前取而代之的是具有更高根除率的“四联疗法”，但随之而造成的后果是治疗周期更长以及治疗的成本更加高昂。同时，抗生素药物治疗还会带来一些副作用例如会造成肠道菌群紊乱，同时还会造成菌种耐药性的增加，从而导致治疗hp的感染更加困难。因此，更加明智的选择是寻找具有幽门螺杆菌抗性的天然活性物质，尤其如果能够从食源性组分的角度分析和入手，可能将会得到更加健康并且更加经济的治疗方式。
3.在食源性组分抑菌物质的研究方面，肖波等人研究了茶多酚、葡萄多酚、维生素c等多酚类物质以不同比例混合对于幽门螺杆菌的体外抑制效果，结果表明，这几种多酚类物质在以一定的比例进行混合之后对于幽门螺杆菌的抑制具有很好的增效作用，为多酚类物质应用于保健食品中来协助治疗因幽门螺杆菌感染而造成的症状确定了相应的理论依据。除此之外，罗强等人研究了酱香型白酒中的活性物质(如各种醛类化合物)对于幽门螺杆菌的抑制作用，研究结果表明这些存在于酱香型白酒中的生物活性物质可以降低幽门螺杆菌对于相关细胞的黏附作用，同时还可以抑制幽门螺杆菌的相关毒力基因的表达，从而有助于抑制幽门螺杆菌对于人体胃肠道黏膜的损伤，除上述研究结果之外，越来越多的研究都涉及论证一些食源性组分对于幽门螺杆菌的抑制作用，但是还没有发现卵黄高磷蛋白对幽门螺杆菌的抑制效果。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种卵黄高磷蛋白的应用，以进一步提高卵黄高磷蛋白对幽门螺杆菌的抑菌效果。本发明采用的技术方案是：
5.一种卵黄高磷蛋白在用于抑制幽门螺杆菌的用途。
6.一种卵黄高磷蛋白在用于抑制幽门螺杆菌的保健品和药物中的用途。
7.优选的是，所述的卵黄高磷蛋白在用于抑制幽门螺杆菌的保健品和药物中的用途，其中，所述药物为用于辅助预防治疗胃部幽门螺杆菌，所述药物包括50
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100mg卵黄高磷蛋白和10
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50mg乳铁蛋白溶解于抗坏血酸溶液100ml。
8.优选的是，所述的卵黄高磷蛋白在用于抑制幽门螺杆菌的保健品和药物中的用途，其中，所述保健品为用于抗肠道细菌感染，所述保健品包括0.3g卵黄高磷蛋白、0.006g麦芽糖醇、2g香草香精和2g山梨醇。
9.优选的是，所述的卵黄高磷蛋白在用于抑制幽门螺杆菌的保健品和药物中的用途，其中，所述药物为抗手足口病喷雾剂。
10.优选的是，所述的卵黄高磷蛋白在用于抑制幽门螺杆菌的保健品和药物中的用途，其中，所述抗手足口病喷雾剂具体为：卵黄高磷蛋白300mg，d
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甘露糖0.005g，薄荷香精1g，柠檬香精1g，甘氨酸3g，磷酸氢二钠/柠檬酸调节ph值＝5.4
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5.6，加入缓冲液定容至1000ml，分装于规格喷瓶制成抗手足口病喷雾剂。
11.优选的是，所述的卵黄高磷蛋白在用于抑制幽门螺杆菌的保健品和药物中的用途，其中，所述缓冲液为柠檬酸1g，磷酸氢二钠1.46g，调节ph值＝5.52，补水至1000ml。
12.本发明的优点在于：本发明提供了卵黄高磷蛋白的一种新的用途，通过挖掘卵黄高磷蛋白这一功能性食源性物质的抑菌潜力，进一步提高了其本身的应用价值。
附图说明
13.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
14.图1为本发明实施例1
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实施例4的卵黄高磷蛋白抑菌测试结果图。
具体实施方式
15.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
16.实施例1
17.一种卵黄高磷蛋白的提取工艺，包括以下步骤：
18.(1)将24个鸡蛋蛋壳磕破，用蛋黄分离器分离蛋清，将蛋黄在滤纸上滚动，去除蛋清和卵带，用牙签划开蛋黄膜，收集蛋黄液，并将蛋黄液保持在1～5℃；
19.(2)将蛋黄液中加1l水，调节ph＝5，在4℃的条件下搅拌6h，然后再用离心机在7000rmp离心1h，收集沉淀，再加入溶解有0.05mol nacl的溶液800ml，搅拌4h。再在7000rmp 15℃的条件下离心30min，收集沉淀。将收集到的沉淀置于大烧杯中，加入600ml正己烷和200ml乙醇的有机混合溶液进行混合，在通风橱中4℃条件下搅拌6h，搅拌完成后抽滤成蛋糕状，然后再加入400ml含有1.74molnacl的溶液在4℃条件下搅拌，得到第一液体；
20.(3)将第一液体在转速为7000rmp，温度为15℃条件下离心40min，将上清液抽滤，再将抽滤过的液体装入透析袋中，把透析袋放入盛满纯水的大烧杯中透析48h，并定期去更换透析水，将透析完成后的液体放入平皿中，在
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80℃条件下冻结，在冻结成型之后放入冻干机中冻干得到卵黄高磷蛋白。
21.实施例2
22.一种卵黄高磷蛋白的铁螯合处理方法，包括以下步骤：
23.a1.配置0.15mol/l的硫酸亚铁铵溶液10ml待用，然后取0.4g卵黄高磷蛋白完全溶解于40ml水中，得到10mg/ml的卵黄高磷蛋白溶液，然后调节ph至6.5；
24.a2.取5ml 0.15mol/l硫酸亚铁铵溶液加入到10mg/ml 40ml卵黄高磷蛋白溶液中，搅拌均匀后充分混合1h，混合后在离心机中离心15min，离心完成之后取得上清液装入透析袋中，透析48h，透析完成之后将透析过的液体倒入平皿中，在
‑
80℃的条件下冻结成型，之后放入冷冻干燥机中冻干得到最终的铁螯合卵黄高磷蛋白；
25.a3.将得到的铁螯合卵黄高磷蛋白在4℃的条件下保存；
26.实施例3
27.一种卵黄高磷蛋白的去磷酸化方法，其中，包括以下步骤：
28.b1.首先配置0.4mol/l的naoh溶液20ml，然后将0.5g卵黄高磷蛋白与配置好的naoh溶液混合，将混合后的液体倒入50ml离心管中在37℃的条件下水浴加热3h，之后用1mol/l的hcl调节ph至7，得到混合液；
29.b2.将混合液倒入透析袋中在盛满纯水的烧杯中透析48h，定期更换透析水，透析完成之后将其倒入平皿中，在
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80℃的冰箱中冻结成型，最后在冷冻干燥机中冻干为去磷酸化卵黄高磷蛋白；
30.b3.将得到的去磷酸化卵黄高磷蛋白在4℃的条件下保存。
31.实施例4
32.一种卵黄高磷蛋白的热处理方法，其中，包括以下步骤：
33.c1.将0.5g卵黄高磷蛋白溶于50ml水中完全溶解得到10mg/ml的卵黄高磷蛋白溶液50ml，将卵黄高磷蛋白溶液放入50ml离心管中，将离心管置于100℃水浴锅中，在100℃条件下水浴加热1.5h，得到蛋白溶液；
34.c2.将热处理后的蛋白溶液透析24h，然后将透析过的蛋白溶液倒入平皿中，并在
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80℃冰箱中冻结，冻结成型后将平皿放入冷冻干燥机中冻干，得到热处理卵黄高磷蛋白；
35.c3.将热处理卵黄高磷蛋白在4℃的的条件下保存。
36.实施例5卵黄高磷蛋白样品抑菌实验
37.抑菌实验采用的条件为温度37℃，培养菌种所用的培养基为ph为6.8、含有4％去纤维羊血的脑心浸液琼脂培养基，采用的实验方法为国标方法ws/t650—2019《抗菌和抑菌效果评价方法》，具体的实验操作方法与其一致，如下所述。
38.实施例1的卵黄高磷蛋白抑菌实验：确定抑菌实验中卵黄高磷蛋白的浓度为2mg/ml，取试验所用菌24h新鲜斜面培养物用pbs洗下，用pbs稀释至约4.5
×
106cfu/ml菌悬液备用，取无菌试管，先加入5.0ml卵黄高磷蛋白，置20℃的水浴中5min后，再加入0.1ml试验用菌悬液，迅速混匀并立即计时，待试验菌与实施例1
‑
4的卵黄高磷蛋白样品相互作用至1h的时间，分别吸取1.0ml试验菌与卵黄高磷蛋白混合液接种2个平皿，倾注培养基，菌量无法计数时，以pbs做10倍系列稀释，选适宜稀释度分别吸取1.0ml接种2个平皿，做活菌培养计数，同时用pbs代替样品，进行平行试验，作为阳性对照，阳性对照回收菌落数在1.0
×
104cfu/ml～9.0
×
104cfu/ml之间，取同批次pbs、培养基作阴性对照，所有试验样本和对照样本均在36℃培养，细菌繁殖体培养48h观察最终结果，试验重复3次，计算平均抑菌率。
39.抑菌率计算：
40.x＝(a0—a1)/a0×
100％
41.式中：
42.x—抑菌率，％；
43.a0—阳性对照组回收菌量，单位为cfu/ml；
44.a1—试验组回收菌量，单位为cfu/ml。
45.将三次平行实验的抑菌率结果进行平均计算，最终得到实施例1卵黄高磷蛋白原样品对幽门螺杆菌的平均抑菌率，从而可以初步判断出卵黄高磷蛋白对于幽门螺杆菌的抑菌效果。
46.所有试验至少进行3次，所有数据均为3次测定的平均值，结果以平均值
±
标准偏
差表示，采用spss 16.0软件进行分析，使用单因素方差分析(anova)分析数据，并进行duncan的多范围检验进行数据比较和分析，结果在p<0.05时被认为有显著性差异，具有统计学意义。
47.实施例1psv原样品及处理组样品抑菌率结果如图1，实施例1的卵黄高磷蛋白样品及其他实施例2
‑
4各个处理组样品对幽门螺杆菌的抑菌率，初步确定了卵黄高磷蛋白对幽门螺杆菌的抑制效果，从抑菌实验的结果可以看出在浓度为2mg/ml，作用时间为1h的条件下，实施例1卵黄高磷蛋白对于幽门螺杆菌具有很强的抑制作用，抑菌率高达98％，因此可以初步判断卵黄高磷蛋白对于幽门螺杆菌具有一定的抑制作用。
48.采用冻干后储存于4℃冰箱中的实施例2
‑
实施例4的铁螯合卵黄高磷蛋白、去磷酸化卵黄高磷蛋白和热处理卵黄高磷蛋白，经三种不同处理方法下的卵黄高磷蛋白蛋白样品进行二阶段抑菌实验，抑菌实验方法与实施例1卵黄高磷蛋白原样品抑菌实验方法相同，作用时间为1h，三组样品均配制成2mg/ml的样液，每组样品均进行三次平行实验后对对照组和实验组进行菌落计数，计算抑菌率，然后计算每组平均抑菌率再进行比较，实验结果对比如图1所示，可以看出经过三种不同条件下的处理之后，铁螯合处理组和热处理组两组样品对于幽门螺杆菌的抑菌率与原样品相比并无表现出明显的变化，而去磷酸化处理组的抑菌率，相比起来则发生明显下降。
49.分析其原因如下：卵黄高磷蛋白具有良好的热稳定性，在100℃条件下处理30min，其相应吸光度仍无显著变化，又因为psv本身的无规则结构，高温处理并不会破坏它的聚集体，也就不会限制其抑菌效果，而铁螯合组抑菌率依然很高的原因是卵黄高磷蛋白仍未处于饱和状态，其本身依然能够继续螯合金属离子，也有可能是因为在针对幽门螺杆菌抑制作用的发挥中，螯合金属离子并非是主要影响因素，但前者可能性更大。对卵黄高磷蛋白的去磷酸化处理在一定程度上破坏了卵黄高磷蛋白的亲水结构，卵黄高磷蛋白中主要存在的磷酸丝氨酸基团被破坏，这会影响卵黄高磷蛋白的金属螯合活性，从而可能限制了卵黄高磷蛋白的抑菌能力，从这一角度来看，铁螯合组抑菌率没有变化更加可能的原因在于卵黄高磷蛋白并未处于铁饱和状态。
50.实施例6卵黄高磷蛋白的应用
51.用于辅助预防治疗胃部幽门螺杆菌的产品配方：取50
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100mg卵黄高磷蛋白和10
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50mg乳铁蛋白溶解于抗坏血酸溶液100ml(ph为5.0
‑
6.0)，制备出对幽门螺杆菌有抑制作用的口服液。
52.用于抗肠道细菌感染产品配方：0.3g卵黄高磷蛋白中加入0.006g麦芽糖醇、2g香草香精、2g山梨醇混合，并压片制成抗肠道细菌感染药物。
53.缓冲液：柠檬酸1g，磷酸氢二钠1.46g，调节ph值＝5.52，补水至1000ml。
54.抗手足口病喷雾剂：采用本发明制备的卵黄高磷蛋白300mg，d
‑
甘露糖0.005g，薄荷香精1g，柠檬香精1g，甘氨酸3g，磷酸氢二钠/柠檬酸调节ph值＝5.4
‑
5.6，加入缓冲液定容至1000ml，分装于10ml和18ml规格喷瓶制成抗手足口病喷雾剂。
55.用于提高免疫力的保健品配方：银杏叶提取物300份、卵黄高磷蛋白100份、蛋黄素650份、白芍360份、熟地黄230份，枸杞子230份，黄芪360份，生半夏360份；将上述组分压制成双层片、多层片或夹心片，包薄膜衣。
56.对比例1
57.取市售的牛乳铁蛋白进行实施例5的抑菌实验，其抑菌率为55.2％。
58.对比例2
59.取市售的重组人乳铁蛋白进行实施例5的抑菌实验，其抑菌率为46.1％。
60.本发明卵黄高磷蛋白的提取工艺，通过提取卵黄高磷蛋白，并将其分别通过铁螯合、去磷酸化和热处理，测试其对幽门螺杆菌的抑制作用，幽门螺杆菌经铁螯合处理和热处理抑菌率得到98％以上，去磷酸化处理的抑菌率下降明显，通过挖掘卵黄高磷蛋白这一功能性食源性物质的抑菌潜力，进一步提高了其本身的应用价值。
61.最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。