rna编辑相关酶功能阻断剂的用途以及药物筛选方法
技术领域：
：1.本发明涉及生物医药领域，具体的，涉及rna编辑相关酶功能阻断剂的用途以及药物筛选方法，更具体的，涉及rna编辑相关酶功能阻断剂在制备药物中的用途、筛选药物的方法、用于药物筛选的重组细胞或生物体的一部分、筛选药物的方法、药物组合物、恢复细胞内蛋白激酶活性的方法、预测药物的方法。
背景技术：
：：2.蛋白激酶参与调控真核生物的细胞生长、分化、增殖以及凋亡等生命过程。蛋白激酶生理功能的正常发挥依赖于其精确的激酶活性，激酶功能的缺失，引起底物不能被磷酸化；激酶活性的过高，导致底物过度磷酸化。因此，蛋白激酶发挥功能的分子细胞学机制研究一直是真核生物细胞生命活动调节过程中的重要问题。3.目前关于蛋白激酶异常所引起疾病的研究仍有待深入。技术实现要素：4.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：5.目前关于激酶活性异常相关疾病，一般都是通过使用增强或抑制激酶活性的小分子药物进行治疗。根据本发明的实施例，发明人发现了一种新的细胞内可能出现的情况：在结构学上一些导致激酶活性增高的点突变，它们在细胞内的命运并没有那么简单，有可能会触发自身的负反馈调控，从而表现为功能缺失的形式。进一步，本发明的发明人发现了一种新的激酶活性或数量的自调节现象，通过分子生物学、遗传学和细胞成像等技术，意外地揭示了激酶在转录水平上自调节的机制，即：当激酶蛋白活性或蛋白表达数量过高时，会启动rna编辑酶对该激酶对应mrna或者pre-mrna的编辑，从而使得细胞内不能产生正常的激酶蛋白。通过阻断rna编辑相关酶的功能，能够有效地恢复细胞内激酶蛋白的整体活性水平。6.有鉴于此，本发明提出了rna编辑相关酶功能阻断剂的用途以及药物筛选方法，利用rna编辑相关酶阻断剂，能够有效地恢复细胞内蛋白激酶的活性，从而能够有效地治疗相关疾病。7.在第一方面，本发明的实施例提出了rna编辑相关酶功能阻断剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病。根据本发明的实施例，发明人发现通过阻断rna编辑相关酶的功能，能够有效地治疗涉及蛋白激酶活性异常的疾病，尤其是某些疾病涉及蛋白激酶的功能缺失以及蛋白激酶的过度活化。8.第二方面，本发明的实施例提供了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病，所述方法包括：使候选试剂与rna编辑相关酶接触，并检测所述接触前后所述rna编辑相关酶的活性，其中，所述接触之后，所述rna编辑相关酶的活性降低是所述候选试剂可以用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病的指示。9.第三方面，本发明的实施例提供了用于药物筛选的重组细胞或生物体的一部分，所述重组细胞或生物体的一部分携带组成型活化的蛋白激酶突变。10.第四方面，本发明的实施例提供了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病，所述方法包括：使候选试剂与携带组成型活化的蛋白激酶突变的动物体或者前面所述的重组细胞或生物体的一部分进行接触；并检测所述接触前后所述蛋白激酶的功能水平，其中，所述接触之后，所述蛋白激酶的功能水平提高是所述候选试剂可以用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病的指示。11.第五方面，本发明的实施例提供了一种药物组合物，用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病，所述药物组合物包括：rna编辑相关酶功能阻断剂。12.第六方面，本发明的实施例提供了一种恢复细胞内蛋白激酶活性的方法，所述细胞携带蛋白激酶组成型活化突变，所述方法包括：阻断所述细胞内的rna编辑相关酶的功能。13.第七方面，本发明的实施例提供了一种预测药物的方法，其包括：获得rna编辑相关酶的三维结构；基于所述三维结构，确定特征向量；将所述特征向量输入经过训练的机器学习模型，以便输出适于阻断所述rna编辑相关酶的药物，所述药物适于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病。附图说明14.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。15.图1显示了已知的中心法则示意图；16.图2显示了根据本发明实施例的中心法则补充示意图；和17.图3显示了igv可视化分析dyf-5mrna的完整性结果，其中，chr.i代表线虫i号染色体，横坐标的数字为dyf-5基因在i号染色体上的物理位置，图中灰色矩形框和白色矩形框代表dyf-5的外显子，灰色矩形框代表dyf-5激酶结构域，矩形框之间的细线代表内含子；纵坐标为标准化后的读数峰度，范围在0-4000之间。具体实施方式18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行描述。19.治疗或预防疾病的用途20.在本发明的一个方面，本发明的实施例提出了rna编辑相关酶功能阻断剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病。21.如前所述，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：22.本发明的发明人发现了一种新的激酶活性或数量的自调节现象，通过分子生物学、遗传学和细胞成像等技术，意外地揭示了激酶在转录水平上自调节的机制，即：当激酶蛋白活性或蛋白表达数量过高时，会启动rna编辑酶对该激酶对应mrna或者pre-mrna的编辑，从而使得细胞内不能产生正常的激酶蛋白。通过阻断rna编辑相关酶的功能，能够有效地恢复细胞内激酶蛋白的整体活性水平。23.由此，根据本发明的实施例，发明人发现通过阻断rna编辑相关酶的功能，能够有效地治疗涉及蛋白激酶活性异常的疾病，尤其是某些疾病涉及蛋白激酶的功能缺失以及蛋白激酶的过度活化。24.这里所使用的术语“蛋白激酶”是指一类催化蛋白质磷酸化反应过程的酶。它能够利用atp作为能源，催化γ-磷酸盐的转移，同时和目标蛋白质分子中某些丝氨酸或苏氨酸、酪氨酸残基的羟基共价结合，导致蛋白构象的改变，从而发挥功能。25.这里所使用的表达方式“蛋白激酶的功能缺失”指在细胞水平上，细胞所表现的蛋白激酶的整体功能比野生型细胞低，例如完全丧失，或者在细胞水平上蛋白激酶的整体功能比野生型细胞低至少30％，例如至少50％，60％，70％，80％，或者90％。换句话说，通过归一化处理，单位数目细胞所表现的蛋白激酶的活性水平不超过相同数目野生型细胞所展现的蛋白激酶活性水平的70％，60％，50％，40％，30％，20％或者10％，甚至0％。26.这里所使用的表达方式“蛋白激酶的过度活化”是指蛋白质水平上，蛋白激酶的活性高于野生型蛋白激酶的活性，例如通过归一化处理，单位数目蛋白激酶所表现的活性水平不低于相同数目野生型蛋白激酶所展现的活性水平的110％，120％，130％，140％，150％，200％，甚至更高。另外，需要说明的是，“过度”活化可能是由于蛋白质发生了提高活性的突变，也可能是其表达量得到提高，另外还可以体现在蛋白激酶活性的展现不需要其他激活剂(例如激酶的激酶进行激活)就能够表现出活性状态，例如组成型激活的蛋白激酶，相对于野生型蛋白激酶属于过度活化的范畴。27.这里所使用的术语“rna编辑”是指转录后的rna在编码区发生碱基的插入、缺失或转换等现象。根据本发明的实施例，rna编辑是一种独特的修饰方式，它不仅能够改变rna分子的细胞命运，而且还能改变rna的序列信息。根据本发明的实施例，可以适用的“rna编辑相关酶”包括但不限于腺苷酸脱氨酶adar，其介导腺苷酸到肌苷(a至i)的核苷酸的转变，这是最为常见的一种rna编辑类型。在一些实施例中，所述rna编辑相关酶包括选自下列的至少之一：adar1，adar2和adar3。28.这里所使用的术语“功能阻断剂”是指可以降低rna编辑酶的活性的试剂，例如与未施加该功能阻断剂相比，功能阻断剂可以将细胞内rna编辑酶的活性降低至少10％，例如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％。在一些实施例中，所述rna编辑相关酶功能阻断剂是所述rna相关酶的抑制剂、抗体、反义核酸、小核酸、竞争性抑制剂、拮抗剂、适于使rna编辑相关酶发生功能阻断突变的试剂。在一些实施例中，所述rna编辑相关酶的功能阻断突变包括adr-2(ok735),adr-2(cas506),adr-2(cas517),adr-2(cas518)和adr-2(cas519)。通过实施上述突变，可以使得adr-2基因的功能无法正常发挥。另外，根据本发明的实施例，发明人发现adr-2在细胞核中发挥功能，因此，阻止adr-2进入细胞核的试剂也能够实现阻断adr-2功能的效果。29.根据本发明实施例，可以采用的酶功能阻断剂的类型并不受特别限制，可以是蛋白质、小分子化合物、高分子化合物，也可以是核酸试剂，以及适于引起特定突变(例如基因编辑)的试剂。30.在本文中使用的术语“抑制剂”是一类可以特异性地与酶结合并降低酶活性的分子，例如小分子化合物。31.在本文中使用的术语“竞争性抑制剂”是产生竞争性抑制作用的抑制剂。它与被抑制的酶的底物通常有结构上的相似性，能与底物竞相争夺酶分子上的结合位点，从而产生酶活性的可逆的抑制作用。32.在本文中使用的术语“抗体”是指包含rna编辑酶结合位点的结合蛋白。可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。具体的，本领域技术人员可以通过常用的手段分离纯化特异性识别预定抗原的抗体，例如通过杂交瘤手段或者通过噬菌体展示手段。另外，根据本发明的实施例，可以采用的“抗体”包括但不限于双链抗体、全长抗体、单链抗体、多聚体抗体、cdr移植抗体或小分子抗体。本领域技术人员可以理解的是，还可以采用人源化抗体作为药物。33.在一些实施例中，所述蛋白激酶异常相关疾病是所述蛋白激酶的功能缺失与过度活化导致的疾病。在一些实施例中，所述蛋白激酶异常是由所述蛋白激酶的组成型活化引起的。在一些实施例中，所述组成型活化是由所述蛋白激酶的突变引起的。在一些实施例中，所述蛋白激酶包括选自下列的至少之一：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸(tyr)蛋白激酶、组氨酸蛋白激酶、色氨酸蛋白激酶、天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶包括选自下列的至少之一：dyf-5、mapk、nekl-4/nek10、dyf-18/ccrk、lrrk2、erk1/2。在一些实施例中，所述蛋白激酶包括选自下列的至少之一：人mapk，所述人mapk在第157位的t发生突变，所述突变为t157e；dyf-5，所述dyf-5在第164位的t发生突变，所述突变为t164e；人lrrk2，所述人lrrk2在第2091位的g发生突变，所述突变为g2091s；人erk1/2，所述人erk在第202位的t发生突变，所述突变为t202e。另外，根据本发明的实施例的激酶包括但不限于：寿命调节通路相关激酶akt-1和akt-2、细胞代谢相关激酶aak-2、细胞周期相关激酶plk-1以及在纤毛中发挥功能的激酶nekl-4/nek10或dyf-18/ccrk。34.本发明的发明人意外地发现，在疾病例如炎症、癌症、肥胖、神经元疾病、由纤毛异常导致的多系统功能障碍即纤毛疾病等，是由于激酶的活性异常所引起的。在研究过程中，激酶的活性异常存在一个表面矛盾的现象，即对于某些活性过度活化的蛋白激酶，其在细胞内存在功能缺失的现象。换句话说，当蛋白激酶发生过度活化突变，例如组成型活化突变时，细胞水平上的整体蛋白激酶活性并未按照预想的得到提高，相反，细胞水平上的整体蛋白激酶活性发生了显著的降低，究其原因是蛋白激酶的表达量显著降低。换句话说，过度活化蛋白激酶的蛋白质水平的活性与细胞水平上蛋白激酶功能缺失的表型相似。根据本发明的实施例，本发明的发明人发现dyf-5ca突变体中过高的激酶活性能够启动负反馈通路，对激酶自身的mrna进行调控，从而破坏了dyf-5ca蛋白的翻译生成。发明人通过ems正向遗传筛选并结合分子、细胞生物学等多种手段，揭示了腺苷酸脱氨酶adr-2对于dyf-5ca的调节作用及其作用机制：adr-2能够对dyf-5capre-mrna的碱基进行编辑，破坏dyf-5camrna完整性，从而降低了完整dyf-5ca蛋白的生成。35.发明人经过更加深入的研究，意外地发现，通过阻断rna编辑酶的功能，能够使得蛋白激酶的表达量得到提升，使得细胞水平上的整体蛋白激酶活性得到恢复。究其原因，可能在常规的中心法则的基础上(参考图1)，当细胞中蛋白质的活性过高或者表达量过大时，会存在蛋白质直接调控rna的机制(参考图2)。由此，通过采用阻断rna编辑酶的功能，能够有效地治疗上述疾病例如炎症、癌症、肥胖、神经元疾病、由纤毛异常导致的多系统功能障碍即纤毛疾病等。例如，运动纤毛的异常会导致精子活动力下降，进而导致不育的症状；感觉纤毛的缺失导致多囊性肾病等(reiter,j.f.,andleroux,m.r.(2017).genesandmolecularpathwaysunderpinningciliopathies.natrevmolcellbiol18,533-547.通过参考全部并入本文)。36.根据本发明的实施例，可以采用阻断rna编辑酶的功能进行治疗或者预防的疾病包括但不限于皮炎、脑炎、角膜炎、结膜炎、鼻炎、中耳炎、牙龈炎、咽炎、扁桃体炎、肺炎、肝炎、肠炎、痢疾、前列腺炎、子宫内膜炎、宫颈炎、盆腔炎、甲沟炎、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、子宫颈癌、食道癌(食管癌)、膀胱癌、淋巴癌、血癌、胰腺癌、肾癌、子宫体癌(子宫内膜癌)、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、神经系统癌症、卵巢癌、黑色素瘤、胆囊癌、喉癌(喉头癌)、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、卡波西肉瘤、肥胖症、癫痫、心血管疾病(如中风)、先天和发育障碍(如脊柱裂)和退行性疾病(如多发性硬化症、阿兹海默症、帕金森氏症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症)、抑郁症、纤毛不动综合征、关节炎、骨质疏松症、多囊肾疾病、森森布伦纳综合症(ced)、窒息性胸廓发育不良(jatd)、短肋-多指综合征(srps)、srpⅱ型(majewskisyndrome)、srpⅲ型(verma-naumoffsyndrome)、srpⅳ型(beemer-langersyndrome)、srpⅴ型(srpnovel)、骨性关节炎(oa)、骨质疏松(op)。37.本领域技术人员能够理解的是，本发明还提出了治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病的方法，该方法包括为有需要的个体给药治疗有效量的rna编辑相关酶功能阻断剂。38.另外，本发明的实施例还提供了一种药物组合物，用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病，所述药物组合物包括：rna编辑相关酶功能阻断剂。39.前面所描述的特征和优点同样适用于该方法和药物组合物，在此不再赘述。40.另外，根据本发明实施例的组合物可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于鼻内、口服、经皮、经眼、腹膜内、吸入、静脉内、icv、脑池内注射或输注、皮下、植入、阴道内、舌下、尿道(例如，尿道栓剂)、皮下、肌肉内、静脉内、直肠、舌下、粘膜、眼部、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋巴管施用。外用制剂可以呈凝胶、软膏剂、乳膏剂、气溶胶等形式；鼻内制剂可呈喷雾或液滴形式递送；经皮制剂可经由透皮贴剂或离子渗透疗法施用；吸入制剂可以使用喷雾器或类似装置递送。组合物也可以呈片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉剂、缓释制剂、溶液剂、混悬剂、酏剂、气溶胶或任何其它适当组合物的形式。41.为制备此类药物组合物，可以根据常规制药化合技术，将活性成分与药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂混合。可用于本组合物中的药学上可接受的载体涵盖任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，如油/水或水/油乳液，及各种类型的湿润剂。组合物另外可含固体药物赋形剂如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是对于注射液而言，包括水、盐水、水性葡萄糖和二醇。载体、稳定剂和佐剂的实例，参见e.w.martin编辑的remington”spharmaceuticalsciences(mackpublishingcompany，1990年，第18版。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。42.如本文中所用，术语“治疗有效量”是足以治疗指定病症或疾病的量或可选地足以获得治疗病症或疾病的药理反应的量。确定最有效的施用方式和剂量的方法可以随用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而改变。通常可滴定治疗剂量以优化安全性和功效。可以按主治医师选定的剂量水平和模式进行单次或多次施用。合适的剂型和施用药剂的方法可由本领域的技术人员容易地确定。例如，按约0.01mg/kg至约200mg/kg、约0.1mg/kg至约100mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg施用组合物。当本文描述的化合物与另一种药剂或疗法共同施用时，有效量可低于单独使用该药剂时的量。43.根据本发明的实施例，可以单独给予或与其它药物组合以短时间或长时间治疗或者预防前面所描述的疾病。在本文中所使用的术语“有需要的个体”是指任何存在激酶异常所引发异常的生物体，例如哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人类、鼠类、大鼠、兔、猿、牛、绵羊、猪、狗、猫、家畜、运动用动物、宠物、马和灵长类动物。44.筛选和预测药物的方法45.如前所述，rna编辑功能与蛋白激酶活性异常相关疾病的发生存在关联性，因此，在本发明的又一方面，本发明的实施例提供了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病，所述方法包括：使候选试剂与rna编辑相关酶接触，并检测所述接触前后所述rna编辑相关酶的活性，其中，所述接触之后，所述rna编辑相关酶的活性降低是所述候选试剂可以用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病的指示。46.这里的候选试剂的形式并不受特别限制，可以是蛋白质、小分子化合物、高分子化合物，也可以是核酸试剂，以及适于引起特定突变(例如基因编辑)的试剂。47.该筛选药物的方法可以在体外进行，也可以在细胞模型或者动物模型中进行。48.在本发明的另一方面，本发明的实施例提供了用于药物筛选的重组细胞或生物体的一部分，所述重组细胞或生物体的一部分携带组成型活化的蛋白激酶突变。由于该重组细胞或生物体的一部分携带组成型活化的蛋白激酶突变，并且在细胞水平上蛋白激酶的整体活性低于野生型细胞，因此，利用该重组细胞或者生物体的一部分，也能够有效地实施前面进行药物筛选的方法。49.在本文中所使用的术语“生物体的一部分”可以是动物体的器官或者组织，尤其是患病组织或者器官。50.由此，在本发明的另一方面，本发明的实施例提供了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病，所述方法包括：使候选试剂与携带组成型活化的蛋白激酶突变的动物体或者前面所述的重组细胞或生物体的一部分进行接触，并检测所述接触前后所述蛋白激酶的功能水平，其中，所述接触之后，所述蛋白激酶的功能水平提高是所述候选试剂可以用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病的指示。51.另外，根据本发明的实施例，本发明还提供了一种预测药物的方法，其包括：获得rna编辑相关酶的三维结构；基于所述三维结构，确定特征向量；将所述特征向量输入经过训练的机器学习模型，以便输出适于阻断所述rna编辑酶的药物，所述药物适于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病。在一些实施例中，所述机器学习模型为图神经网络。52.由此，通过基于结构的机器学习模型，可以有效地提高药物预测的效率。关于rna编辑相关酶的三维结构，既可以通过蛋白质晶体数据库获得，也可以通过以下数据库获得：例如剑桥结构数据库(thecambridgestructuraldatabase,csd)、蛋白质数据库(theproteindatabank,pdb)、无机晶体结构数据库(theinorganiccrystalstructuredatabase,icsd)、国际衍射数据中心的粉晶数据库(jcpds-internationalcenterfordiffractiondata,jcpds-icdd)等。53.另外，在确定蛋白质的相关信息(例如氨基酸序列、结构式、或部分晶体数据)之后，还可以通过多种软件进行三维结构重构或者预测蛋白质的三维结构。例如，可以采用rosetta@home平台(网址：https://www.rosettacommons.org)、foldit：solvepuzzlesforscience平台(网址：https://fold.it/portal)、thefolding@home平台(网址：https://foldingathome.org)、templatemodeling平台(网址：https://salilab.org/modeller/)、swiss-model(网址：https://swissmodel.expasy.org/)等。54.另外，也可以使用alphafold使用深度学习算法通过蛋白质序列来预测蛋白质结构。55.在获取蛋白质的三维构象结构之后，可以通过将蛋白质中的每个氨基酸残基作为拓扑图的节点v(有时也称为“顶点”)，采用邻近氨基酸残基对作为边e，构建拓扑图g。从而可以将蛋白质的三维结构转换为数字信息，进一步可以利用图神经网络进行机器学习建模，进一步用于药物预测，关于利用图神经网络预测药物的详细介绍，可以参见https://arxiv.org/abs/2012.05716。56.通过采用本发明的方法，能够有效地筛选可以降低rna编辑相关酶活性的试剂或者能够有效地筛选可以在细胞水平上恢复异常的蛋白激酶功能，由此，进一步，该试剂可以用于治疗或者预防蛋白激酶活性异常相关疾病。众所周知，创新药的开发通常需要筛选百万个化合物，新药研发失败率非常高。通过本发明的方法，能够有效地提高筛选药物的效率，降低新药开发的成本。另外，本发明的发明人意外地发现，通过阻断rna编辑相关酶的功能，除影响组成型活化的蛋白激酶的表达之外，并不影响细胞其他蛋白质的表达，尤其是其他酶的活性，因此，就医药用途而言，本发明所提供的方案对人体是安全的，副作用小，筛选药物的成功性将大大得到提高。57.其他58.最后，本发明的实施例还提供了一种恢复细胞内蛋白激酶活性的方法，所述细胞携带蛋白激酶组成型活化突变，所述方法包括：阻断所述细胞内的rna编辑相关酶的功能。如前所述，利用该方法能够有效地恢复细胞内蛋白激酶活性，从而实现对细胞功能的研究以及使得细胞恢复正常功能。需要说明的是，由于蛋白激酶携带组成型活化突变，因此，通过阻断rna编辑相关酶，无需将蛋白激酶的蛋白表达水平恢复至野生型水平，其细胞水平上的整体活性，也可以恢复至期望的水平。另外，本发明的发明人意外地发现，通过阻断rna编辑相关酶的功能，除影响组成型活化的蛋白激酶的表达之外，并不影响细胞其他蛋白质的表达，尤其是其他酶的活性，因此，就医药用途而言，本发明所提供的方案对人体是安全的，副作用小，筛选药物的成功性将大大得到提高。59.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。60.实验材料与方法61.实验材料62.菌株63.op50(尿嘧啶缺陷型大肠杆菌菌株)：培养线虫；64.trans5α感受态细胞(transgenbiotech，货号为cd201-02)：质粒构建。65.质粒66.sgrna靶位点和实验用途[0067][0068][0069]质粒名称和实验用途[0070][0071]质粒名称和实验用途[0072][0073][0074]质粒名称和实验用途[0075][0076]注：ki指knock-in，pdd162、pdonr和ppd95.77为实验过程中涉及到的质粒模板载体。[0077]同源重组模板信息[0078][0079]线虫品系[0080]线虫品系[0081][0082][0083]线虫品系[0084][0085][0086]线虫品系[0087][0088][0089]线虫品系[0090]genomeusingcas9-triggeredhomologousrecombination.natmethods10,1028-1034.friedland,a.e.,tzur,y.b.,esvelt,k.m.,colaiacovo,m.p.,church,g.m.,andcalarco,j.a.(2013).heritablegenomeeditinginc.elegansviaacrispr-cas9system.natmethods10,741-743.通过参照将这些论文并入本文)，对dyf-5进行精确点突变、片段的定位删除和替换以及内源荧光标记。[0100]荧光染料填充实验[0101]线虫头部和尾部纤毛与外界环境直接接触，能够从外界环境中摄取荧光染料，通过纤毛和细胞内转运，最终标记出纤毛神经元(hedgecock,e.m.,culotti,j.g.,thomson,j.n.,andperkins,l.a.(1985).axonalguidancemutantsofcaenorhabditiselegansidentifiedbyfillingsensoryneuronswithfluoresceindyes.devbiol111,158-170.perkins,l.a.,hedgecock,e.m.,thomson,j.n.,andculotti,j.g.(1986).mutantsensoryciliainthenematodecaenorhabditiselegans.devbiol117,456-487.1986；starich,t.a.,herman,r.k.,kari,c.k.,yeh,w.h.,schackwitz,w.s.,schuyler,m.w.,collet,j.,thomas,j.h.,andriddle,d.l.(1995).mutationsaffectingthechemosensoryneuronsofcaenorhabditiselegans.genetics139,171-188通过参照将这些论文并入本文)。因此，荧光染料填充实验能够用来初步检测纤毛的功能是否完整。[0102]ems正向遗传筛选实验[0103]线虫生长周期短、繁殖能力强，是很好的用来做遗传筛选的模式生物。ems，即甲基磺酸乙酯，是一种常用的化学诱变剂。为了寻找dyf-5的调控因子，发明人对模拟组成型活化dyf-5ca突变体进行了正向遗传筛选。由于dyf-5ca突变体成虫具有严重的染色缺陷，因此发明人以诱变前有纤毛染色缺陷到诱变后大部分成虫纤毛染色正常为判断标准，对该突变体进行了大规模的遗传筛选。[0104]差异基因表达分析[0105]使用trim_galore(version0.4.4)去除两端接头、测序质量小于25以及长度小于20bp的片段，然后使用star(version2.5.4b)将序列比对到线虫参考基因组ce10中，其中‑‑sjdboverhang设为139，在发明人的测序数据中star比对结果中比对比率均在85％以上。之后通过htseq(versionversion0.9.1)计算每个转录本的count。然后使用r中的deseq2进行标准化、差异表达分析(andersetal.,2015；dobinandgingeras,2015；loveetal.,2014；wangetal.,2009)。同时，发明人使用网站david(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因id到基因名字的注释，并在metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)网站进行基因功能的富集分析。[0106]rna编辑的鉴定与分析[0107]adar介导的rna编辑导致腺苷酸转变为肌苷，肌苷和鸟苷在结构上高度相似，因此最终使得腺苷酸被识别为鸟苷。通过分析转录组测序数据鉴定除了snp位点之外的这些位点，从而实现rna编辑位点的分析。在发明人的实验分析中，发明人采取sprint的方法进行编辑位点的鉴定(zhang,f.,lu,y.,yan,s.,xing,q.,andtian,w.(2017).sprint:ansnp-freetoolkitforidentifyingrnaeditingsites.bioinformatics33,3538-3548.通过参照将论文并入本文)，即是根据a至i的rna编辑位点的发生特点，在没有snp位点信息的条件下，将rna编辑位点筛选出来。在发明人的分析中，发明人将普通编辑位点(regularres)的支持读数定为大于等于3，将高频编辑位点(hyperres)的支持读数定为大于等于5。同时，由于高频rna编辑经常出现在重复序列区域，因此需要线虫基因组的重复序列信息，该数据可以从网站https//:sprint.tianlab.cn/sprint/dbrep/下载得到。[0108]反义rna的鉴定与分析[0109]发明人通过链特异性rna-seq进行反义rna的鉴定(zhaoetal.,2015b)。[0110]内含子滞留的鉴定与分析[0111]发明人使用irfinder进行全基因组范围内内含子滞留的鉴定与分析(middletonetal.,2017)。它可以通过github(https://github.com/williamritchie/irfinder/wiki)进行下载安装。[0112]实施例1线虫dyf-5激酶的功能分析[0113]雄性生殖细胞相关激酶map(male-germcellassociatedkinase,map)因在雄性生殖细胞内高剂量表达，从而被发现与命名；近年的研究报道：它的功能损伤会引起纤毛结构的异常，在生理水平上可能会导致色素性视网膜炎症，但仍不清楚map激酶发挥功能的分子细胞学机制。线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶dyf-5与哺乳动物的map激酶不仅高度同源且功能保守。来自于线虫的研究发现dyf-5可能通过限制马达蛋白kinesin-ii在纤毛中的运动来维持纤毛结构与功能的完整。线虫丝氨酸/苏氨酸激酶dyf-5特异地在具有纤毛结构的感觉神经元中表达，主要定位于纤毛的远端段。已有的研究表明：dyf-5功能缺失引起纤毛结构的异常延长；然而，过量表达dyf-5，会导致纤毛结构的缺失；由此，发明人入认为dyf-5激酶的活性或者表达剂量，对线虫纤毛结构与功能的维持至关重要。[0114]1.1dyf-5的过度活化影响线虫纤毛的结构与功能[0115]在该实施例中，发明人根据mapk家族激酶活性调控的生化与结构特征，结合基因组编辑技术，在基因组水平上进行碱基置换，成功的获得了将dyf-5第164位苏氨酸(t)转变为谷氨酸(e)的dyf-5(t164e)突变体，即在纤毛神经元中创造dyf-5组成型活化的场景。荧光染料的填充实验可以初步检查线虫纤毛的结构与功能是否完整[0116]发明人分别对野生型、dyf-5功能缺失突变体dyf-5(mn400)和dyf-5模拟组成型活化突变体dyf-5ca进行了荧光染料填充实验，发现所有的野生型线虫都可以从外界环境中摄取染料，但dyf-5的功能缺失和过度活化分别导致99％和92％的个体不能摄取染料。[0117]另外，发明人通过遗传杂交，将绿色荧光蛋白gfp标记osm-6(ift-b复合体组分之一)的转基因标签分别引入野生型、dyf-5功能缺失突变体dyf-5(mn400)和dyf-5模拟组成型活化突变体dyf-5ca中，结合活体荧光成像技术，解析在野生型和突变体中，纤毛的形态结构和物质转运功能。[0118]实验结果表明：dyf-5ca与dyf-5(mn400)的细胞学表型极为相似，与野生型相比，头部和尾部纤毛的远端段均出现了大量的osm-6::gfp信号，暗示了ift颗粒在纤毛远端段表现出堆积现象；此外，头部和尾部纤毛的长度均被明显的延长。通过荧光活体时序成像技术，发明人对野生型和dyf-5ca突变体中，ift颗粒的运动进行了记录和统计分析，实验结果显示：dyf-5的过度活化不仅完全终止了ift颗粒在纤毛远端段的正向运输，而且使它在中间段的正向运输速度由野生型的0.76μm/s降低至0.6μm/s，这也与dyf-5(mn400)突变体中ift(纤毛内部运输intraflagellartransport)颗粒的运动现象高度一致。[0119]以上的实验结果表明：dyf-5的功能缺失或者过度活化，在细胞水平上，对纤毛的建立与功能维持具有相似的生物学效应。[0120]1.2转录水平分析dyf-5ca与dyf-5(mn400)突变体[0121]发明人分别对野生型、dyf-5功能缺失突变体dyf-5(mn400)和dyf-5模拟组成型活化突变体dyf-5ca进行了转录组测序，实验结果表明：与野生型相比，在dyf-5(mn400)和dyf-5ca突变体中，有众多基因的表达量发生改变，分别有321和174个基因的表达量显著上调(foldchange》＝2；fdr《0.05)以及494和64个基因的表达量显著下调(foldchange《＝-2；fdr《0.05)；进一步利用基因聚类分析软件—metascape，对这些显著上调或下调的基因，进行功能聚类分析发现：有意思的是，dyf-5(mn400)和dyf-5ca突变体的分析结果也是极为相似，尤其是二者中相对于野生型而言表达上调的基因主要与纤毛的建立与功能维持相关，例如，编码纤毛内物质转运相关蛋白的大部分基因(che-11、dyf-11、ift-20、osm-5以及osm-3等)都发生了显著上调。这也从转录水平上，为ift颗粒在二者纤毛远端段的堆积现象，提供了纤毛基因表达方面的机理解释。[0122]为了进一步解释dyf-5的功能缺失或者过度活化所导致的相似的生物学效应，发明人检查了dyf-5在dyf-5(mn400)和dyf-5ca突变体中转录水平的表达量。然而，与野生型相比，并没有显著的变化；令人意外的是，当发明人用可视化软件igv(integrativegenomicsviewer)进一步观察分析野生型dyf-5和突变体dyf-5camrna的转录组测序结果时，基本检测不到完整的dyf-5camrna。在野生型中，dyf-5在每个外显子上的峰度基本相同，在内含子上检测不到读长(reads)的分布；在dyf-5(mn400)突变体中，dyf-5在每个外显子上的分布与峰度和野生型高度一致；但在dyf-5ca突变体中，dyf-5的读长呈现出不均匀的分布，表现为前几个外显子读长的峰度明显地高于野生型，后几个外显子读长的峰度又显著地低于野生型，而且一些应该被剪切掉的内含子(如第4、5、6和7个内含子)也存在明显的读长分布，参考图3。[0123]这些实验结果表明：与野生型相比，在dyf-5ca突变体中，dyf-5转录本的完整性不仅受到了严重的破坏，而且仅留的转录本可能存在内含子剪切失败的现象，也从转录水平暗示了在dyf-5ca突变体中，虽然dyf-5的转录水平与野生型相比没有变化，但是最终能够正常发挥功能的dyf-5ca蛋白表达量很低，所以与dyf-5(mn400)的表型极为相似。[0124]1.3内源dyf-5ca在纤毛中的定位与分布明显减少[0125]为了进一步解释dyf-5过度活化的生物学机制，发明人在蛋白水平上检查了内源dyf-5ca蛋白在纤毛神经元中的表达水平以及在纤毛中的定位与分布情况。[0126]发明人首先采用crispr-cas9基因组编辑技术，在dyf-5基因起始密码子(atg)的后方原位插入编码绿色荧光蛋白gfp的碱基序列，成功构建了gfp标记内源dyf-5的线虫品系。通过荧光染料填充实验，发明人发现在dyf-5的n端连接gfp荧光标签，并不影响线虫纤毛从外界环境中摄取荧光染料；结合活体荧光成像技术，发明人发现内源gfp::dyf-5也是主要定位于纤毛的远端段，纤毛的形态与结构，都与野生型无异，进一步表明在dyf-5的n端连接gfp荧光标签，并不影响它的正常功能。因此，发明人采用相似的方法，成功构建了gfp标记内源dyf-5ca的线虫品系，结合荧光活体成像技术，在相同的拍摄条件下，对gfp::dyf-5ca在纤毛中的定位与分布进行了记录，实验结果显示：osm-6::mcherry标记的纤毛结构被明显的延长，并且osm-6::mcherry在纤毛的远端段也出现了明显的堆积，但是基本检测不5ca(d150a)的线虫品系，以使得dyf-5丧失激酶活性；其次，发明人对该线虫品系进行了转录组测序以及分析了该突变体中dyf-5mrna的完整性，结果表明：dyf-5mrna的完整性被完全恢复；再者，发明人通过荧光活体成像技术，对内源gfp::dyf-5ca(d150a)的定位与分布进行解析，在该突变体中，ift颗粒在纤毛远端段的堆积以及纤毛的异常延伸现象依然存在，但是内源dyf-5在纤毛内的定位与分布被明显地恢复。[0138]这些实验结果肯定了发明人的假说：即线虫dyf-5激酶的过度活化，启动了未知的负反馈机制，从而在转录水平上破坏了其自身mrna的完整性，随之发生的是，dyf-5ca在纤毛中的定位与分布减少，进而导致纤毛结构与功能的异常。[0139]在本实施例中，发明人首次发现了模拟组成型活化dyf-5ca突变体中的纤毛表型，并对dyf-5ca的分子、蛋白特性进行了分析：dyf-5ca和dyf-5(mn400)无效突变体相似，能够导致纤毛染色缺陷、纤毛远端段ift颗粒的堆积以及纤毛的异常延伸；在dyf-5ca突变体中，细胞内过高的激酶活性触发了一个反馈过程，破坏了dyf-5的mrna完整性，进而降低了dyf-5ca在纤毛神经元的表达水平，使该模拟组成型活化dyf-5ca突变体在蛋白水平上表现为功能缺失的形式。[0140]实施例2dyf-5ca调节因子的鉴定与分析[0141]2.1ems正向遗传筛选鉴定dyf-5ca的调节因子[0142]为了寻找dyf-5ca的调节因子，发明人根据dyf-5ca突变体中纤毛染色缺陷的成虫表型对其进行了大规模的正向遗传筛选。整个遗传筛选策略如下：发明人使用化学诱变剂ems(ethylmethanesulfonate,ems)处理dyf-5ca突变体，之后对其后代进行染料染色，并从中挑选纤毛染色正常且外显率高的候选突变体，待候选突变体纯合后通过单核苷酸多态性基因定位法结合全基因组测序的手段确定候选突变体的基因型。通过筛选，发明人一共获得了7株候选突变体。[0143]2.2adr-2导致dyf-5ca突变体呈现纤毛染色缺陷[0144]通过遗传筛选发明人发现多个adr-2的等位基因能够恢复dyf-5ca突变体的染色缺陷。adr-2是线虫中负责rna编辑功能的哺乳动物adar同源蛋白，包括双链rna结合结构域和脱氨酶结构域。在线虫中，之前的报道表明adr-2的缺失使得线虫表现出化学趋向性缺陷，但是随后的实验表明前面行为学实验中使用的adr-2(gv42)并不是真正的无效突变体，它的脱氨酶结构域的缺失反而使得该区域产生了新的有功能的基因，所以目前在线虫中adr-2的缺失还未被报道对线虫有什么影响。[0145]在发明人的筛选中，发明人一共获得了4个adr-2突变体，这四个突变体都属于突变位点位于adr-2外显子区域的点突变体，而且引起了不同的adr-2氨基酸序列的改变。这些突变体分别导致adr-2第169位的丝氨酸突变为苯丙氨酸(adr-2(s169f)(cas519))、第277位的苏氨酸突变为异亮氨酸(adr-2(t277i)(cas506))、第319位的甘氨酸突变为谷氨酸(adr-2(g319e)(cas518))以及第476位的谷氨酰胺突变为终止密码子(adr-2(q476*)(cas517))。同时，这些突变位点都位于adr-2的脱氨酶结构域。通过和哺乳动物中adar蛋白进行同源性分析，发明人发现，除了第476位的谷氨酰胺，其他突变位点都是高度保守的。这些adr-2点突变体生长、运动以及繁殖能力等与野生型没有明显区别，而且它们本身不具备纤毛缺陷，但是都可以完全恢复dyf-5ca突变体中的纤毛染色缺陷。[0146]为了进一步检测adr-2是否参与dyf-5ca引起的纤毛缺陷过程，发明人通过遗传杂交，在dyf-5ca突变体背景下引入adr-2的缺失突变，并成功获得了dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体。发明人发现，在该双突变体中，线虫纤毛染色缺陷被完全恢复；进一步地，当发明人在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体的背景下过量表达纤毛特异性启动子pdyf-1驱动的野生型adr-2时，又能够使该线虫表现出严重的纤毛染色缺陷。以上结果充分且必要地表明了adr-2能够导致dyf-5ca突变体表现出纤毛染色缺陷，而且是通过细胞自主性的方式发挥功能的。[0147]2.3adr-2缺失恢复dyf-5ca突变体中纤毛结构与功能[0148]为了进一步检测adr-2是否参与dyf-5ca引起的纤毛缺陷过程，发明人通过遗传杂交，将绿色荧光蛋白gfp标记osm-6(ift-b复合体组分之一)的转基因标签引入dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，以对其纤毛形态进行可视化。发现，在该双突变体中：成虫水平上，线虫纤毛染色缺陷被完全恢复；细胞学水平上，纤毛远端段ift颗粒堆积明显减少，纤毛长度显著恢复，此外，纤毛内部运输也出现了一定程度的恢复，在纤毛中间段，正向运输速度从dyf-5ca突变体中的0.6μm/s恢复至0.7μm/s，同时纤毛远端段能够进行纤毛内部运输，为0.9μm/s。[0149]2.4adr-2介导的rna编辑功能参与调控dyf-5ca[0150]为了研究adr-2是如何介导参与调控dyf-5ca功能，发明人首先分析了adr-2的定位情况。[0151]发明人在野生型线虫背景下过量表达纤毛特异性启动子pdyf-1驱动的野生型adr-2::gfp的表达，同时通过遗传杂交引入绿色荧光蛋白gfp标记osm-6(ift-b复合体组分之一)的转基因标签对纤毛进行可视化分析，发现：和之前的研究报道一致(nishikura,2016)，adr-2不在纤毛中定位，在胞体神经元的细胞核中大量表达。这表明dyf-5ca过高的激酶活性可能触发了细胞核中的某个反应。[0152]为了进一步鉴定adr-2对于dyf-5ca的调节作用是如何实现的，发明人利用gfp免疫共沉淀结合质谱分析对adr-2相互作用蛋白进行了分析，发现：和之前的报道一致，adr-2可以和adbp-1相互作用，但是发明人并没有检测到任何和纤毛形成与维持过程相关的蛋白。在这里，发明人采用线虫敲入品系ift-74::gfp作用对照，发现ift-74能够捕获大部分与纤毛形成和维持过程相关的蛋白。以上实验结果表明adr-2不能与纤毛形成和维持过程相关的蛋白相互作用。[0153]进一步地，发明人在野生型线虫背景下过量表达纤毛特异性启动子pdyf-1驱动的野生型adbp-1::gfp的表达，分析了adbp-1的定位情况，发现：和adr-2一样，adbp-1只在胞体神经元的细胞核中大量表达。以上结果表明adr-2在细胞核中发挥功能。[0154]为了进一步探讨adr-2对于dyf-5ca的调节机制，发明人对发明人所使用的adr-2(ok735)突变体以及之前筛选获得的adr-2点突变进行了进一步的分析。通过对转录组测序结果进行igv可视化分析发现：adr-2(ok735)突变体中没有完整的adr-2的mrna，属于adr-2无效突变体；筛选得到的adr-2点突变体中adr-2的mrna水平均不受影响。由于adr-2主要是负责rna编辑功能的蛋白，发明人对这些突变位点对adr-2编辑能力的影响进行了预测，通过对已经报道的人中adar2x射线晶体结构进行分析，发明人发现保守的adr-2的三个点突变都可能在一定程度上影响adr-2的编辑能力。[0155]之前的研究报道表明，adbp-1能够结合adr-2的脱氨酶结构域，对其rna编辑功能的发挥起着关键作用。在线虫中一共存在两种adar蛋白，分别是adr-1和adr-2，但只有adr-2具备rna编辑活性。为了进一步鉴定adr-2对于dyf-5ca的调节作用，通过遗传杂交，发明人在dyf-5ca突变体中分别引入了adr-1和adbp-1的突变。发现：adr-1和adbp-1自身突变不会导致纤毛染色缺陷，但是不具备rna编辑功能的adr-1不能够恢复dyf-5ca突变体的纤毛染色缺陷，参与调节adr-2rna编辑功能的adbp-1可以部分恢复dyf-5ca突变体中的纤毛染色缺陷；其次，在细胞水平上，通过ift-b组分之一osm-6对纤毛荧光成像分析，发明人发现adbp-1可以部分恢复dyf-5ca突变体纤毛中ift颗粒的堆积和纤毛长度，但是相对于野生型而言，纤毛长度仍有一定程度的增长。以上实验结果表明adr-2可能通过利用其rna编辑活性来对dyf-5ca进行调节。[0156]2.5全基因组范围rna编辑分析[0157]已有的研究表明adr-2具有rna编辑功能，rna编辑作为一种转录后修饰方式，能够对基因pre-mrna的碱基进行编辑，增加转录多样性，进而使蛋白功能复杂化。随着测序技术的发展以及生物信息学分析手段的进步，发明人可以通过转录组测序数据进行rna编辑位点的鉴定与分析。发明人对处于l1时期的不同线虫品系进行了rna-seq，并利用sprint工具进行了全基因组范围内的rna编辑分析，发现：首先，和之前的报道一致，发明人在野生型中总共检测到了18097个编辑位点，这些编辑位点分布在外显子、内含子以及utr区域；而且，和野生型相比，adr-2和adbp-1的缺失消除了整个基因组范围内rna编辑事件的发生。同时，发明人也对ems筛选获得的adr-2点突变体进行了rna编辑分析，发现它们的突变也都能导致rna编辑事件的消除。以上实验结果进一步表明adr-2介导的rna编辑功能在dyf-5ca突变体中扮演着重要角色。[0158]为了进一步探讨adr-2对于dyf-5ca蛋白功能的影响，发明人分别对dyf-5ca单突变体和dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中处于l1时期的线虫进行了转录组测序，并进行了rna编辑分析。发现：在dyf-5ca单突变体中，相对于野生型而言，整个基因组范围内发生rna编辑的位点出现了明显的减少，消除了野生型线虫中12871个编辑位点，但是异位获得了1537个编辑位点，整个基因组范围内的编辑位点出现了明显的重塑。根据这1537个编辑位点所属的基因，编辑位点数目以及野生型线虫中该位点对应的基因是否能够发生rna编辑，发明人对其进行了详细的分析，发现：在dyf-5ca单突变体中，出现了7个野生型中不能发生rna编辑的基因，分别是d1005.9、dyf-5、b0252.3、f11a6.6、y54g2a.26、aagr-1和c27a7.1。有意思的是，这些异位出现的编辑位点主要分布于dyf-5基因位置，包括内含子和外显子区域。[0159]以上实验结果表明发明人通过遗传筛选获得的adr-2点突变以及adr-2的缺失突变都能够抹灭rna编辑事件的发生。在dyf-5ca突变体中，全基因组范围内发生rna编辑的位点被重塑，adr-2能够特异地对dyf-5capre-mrna的碱基进行编辑。[0160]2.6dyf-5ca突变体中dyf-5位置rna编辑分析[0161]发明人发现adr-2能够特异地对dyf-5capre-mrna的碱基进行编辑。因此，发明人对dyf-5ca突变体中dyf-5自身位置的rna编辑情况进行了具体的分析。dyf-5位于i号染色体，属于前面发明人进行全基因组范围rna编辑分析的i-10区间，在该区间，突变体中出现了大量新的编辑位点。发明人发现：突变体中dyf-5自身位置发生了大量的rna编辑，这些编辑位点位于dyf-5的第六个外显子到第七个内含子之间，进一步地放大这些编辑位点所在的区间，发明人发现dyf-5的第六和第七个外显子区域发生的主要是编辑水平在0～0.3之间的低频的rna编辑，而在第六和第七个内含子中发生的主要是编辑水平在0.3～0.6之间的高频的rna编辑。[0162]为了进一步鉴定dyf-5ca突变体中rna编辑事件的发生，发明人进行了进一步的桑格测序检验。发明人分别对野生型和dyf-5ca突变体进行了rna的提取，并将其反转录为cdna，然后在发明人检测到的rna编辑发生区域的上下游分别设计引物进行pcr，并且进行桑格测序检测。在这里发明人也使用了基因组dna作为对照。和rna-seq结果一致，在桑格测序分析中，发明人在dyf-5ca突变体的cdna中也发现了核苷酸a至g的转变，进一步支持了rna编辑事件的存在。[0163]2.7反义rna是dyf-5capre-mrna发生rna编辑的重要原因[0164]在发明人的工作中，关于转录组测序方面，发明人都是使用链特异性mrna建库方法，以及使用hiseq-2000进行双端150bp文库上机测序。在发明人的建库、测序方法中，通过拆分测序数据得到的read2数据对应的为转录本链mrna序列。因此，发明人通过对测序数据中的read2进行比对分析，并对转录本链和反义链的比对结果进行数据拆分，从而得到反义rna出现的位点、峰度及其所对应的基因等。[0165]通过链特异性转录组测序，发明人进行了全基因组范围内反义rna的鉴定分析。和之前的全基因组范围内rna编辑位点分析一样，发明人将整个基因组从i号染色体到x染色体，每隔1mbp作为一个bin，对每个bin中反义rna的总体表达水平(这里发明人用该区间内标准化后的反义rna的读数的总和，并对其取对数来代表反义rna的总体表达水平)进行了聚类分析。发明人发现：首先，在野生型线虫中，整个基因组范围内分布着大量的不同表达水平的反义rna，而且这些反义rna的分布和染色体区间有着密切关系，早年在人类细胞中反义rna的分布情况的研究中，人们发现反义rna不是在基因组上随机分布的，它坐落于基因上的一些特殊区域，可能起着调控转录本的表达的作用，这和发明人在线虫中看到的结果是高度一致的，也暗示了反义rna的特异分布可能是和对应区间的基因表达调控密切相关的；其次，在adr-2(ok735)突变体中，整个基因组范围内存在着与野生型线虫中分布类似的反义rna；此外，在dyf-5ca突变体中，整个基因组范围内也分布着大量的反义rna，然而，和野生型相比，反义rna分布的区域出现了一定程度的变化，这可以从聚类分析热图中每个bin的颜色深浅反映出来。同时，在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，这些反义rna的存在以及分布，相对于dyf-5ca突变体而言没有明显变化。[0166]以上实验结果表明，在dyf-5ca突变体中，整个基因组范围内反义rna的分布被重塑。这些反义rna可能会和mrna互补配对，导致双链rna的形成，从而被adr-2所识别并且发生rna编辑。这种反义rna重塑的现象很好地解释了前面发明人看到的该突变体中rna编辑被重塑的特点。同时，adr-2的缺失不会影响反义rna的产生及其分布情况，说明在dyf-5ca的调控通路中，adr-2独立于反义rna调节途径或者作用于反义rna信号通路下游。[0167]有意思的是，发明人发现：与野生型相比，dyf-5所属的区间i-10变化很大。因此，发明人对dyf-5ca突变体中dyf-5自身位置反义rna的分布进行了进一步的检测分析。通过igv可视化分析，发明人发现：在野生型线虫中，dyf-5自身位置不存在反义rna，而且，在dyf-5(mn400)突变体中，dyf-5自身位置也不存在反义rna；但是在dyf-5ca突变体中，dyf-5自身位置出现了大量的反义rna，这些反义rna分布于dyf-5的第四个外显子到第七个内含子之间，而且有着较高的峰度。[0168]在之前的实验结果中，发明人发现，在dyf-5ca突变体中，dyf-5的第六个外显子到第七个内含子之间发生了大量的rna编辑，这和dyf-5位置反义rna分布的位置也是高度一致的。其中，dyf-5的第四个外显子到第五个内含子区域异常出现了反义rna，但是没有发生编辑，发明人认为这可能和adr-2对于双链rna的选择特异性相关。以上实验结果表明：在dyf-5ca突变体中，dyf-5自身位置反义rna的异常产生，使其和自身pre-mrna进行碱基互补配对形成双链rna，从而被adr-2所识别并且发生rna编辑。[0169]2.8adr-2缺失部分恢复dyf-5camrna读数分布[0170]基于上述研究，发明人提出假设：dyf-5ca位置上发生的异位rna编辑可能导致了dyf-5capre-mrna的异常剪切，进而破坏了其mrna的完整性。[0171]为了验证这个假设，发明人对不同品系中dyf-5mrna读数比对结果进行了igv可视化分析。发现：首先，在adr-2(ok735)突变体中，和野生型相比，dyf-5位置上的mrna读数没有变化，在外显子上呈现出与野生型相似的峰度以及均匀的读数分布；其次，在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，dyf-5ca突变体中存在的dyf-5位置上的读数分布不均匀以及内含子处也存在读数分布的情况依然存在；此外，发明人也通过rt-qpcr实验进行了进一步的验证：通过在dyf-5不同位置区域设计特异的引物，发现dyf-5ca突变体中dyf-5在前面第三和第四个外显子的表达水平明显高于后面第九和第十个外显子，adr-2的缺失能够部分恢复dyf-5的表达水平，但是dyf-5在第三和第四个外显子的表达水平比其在第九和第十个外显子的表达水平高的现象依然存在；为了进一步检测adr-2对于dyf-5ca的恢复作用，发明人利用irfinder分析了dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中的内含子滞留情况。发现，相对于dyf-5ca突变体而言，dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中第六、七个内含子位置的读数分布峰度以及其相对于外显子所占的比例均出现了一定程度的减少。[0172]因此，发明人猜测在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，虽然dyf-5的读数分布没有明显变化，但是在该双突变体中，dyf-5的mrna完整性被部分恢复，能够产生野生型的全长、功能完整的dyf-5mrna。虽然这些完整的mrna表达量很低，但是它们最终都能够翻译出功能正常的蛋白。[0173]为了验证发明人的猜测，发明人首先对不同品系中内源dyf-5在纤毛神经元中的表达水平进行了定量分析，并且对内源dyf-5在纤毛中的分布进行了定性分析。通过在相同的荧光拍摄条件下进行纤毛成像以及图像处理、绝对荧光强度统计分析，发明人发现：首先，在adr-2(ok735)突变体中，dyf-5在纤毛远端段具有很高的富集(绝对荧光强度为1109±50.42au)，和野生型相比(绝对荧光强度为1086±64.02au)，表达水平以及其在纤毛中的定位分布没有明显变化；其次，在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，dyf-5ca在纤毛中的绝对荧光强度为63.95±7.325au，和野生型相比，dyf-5在纤毛神经元中的表达水平显著下降，但是相对于dyf-5ca突变体(绝对荧光强度为27.07±3.622au)而言，dyf-5ca在纤毛神经元中的表达水平出现了一定程度的恢复，而且，在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，dyf-5在整个纤毛上的分布也呈现出和野生型高度一致的情况，主要聚集在纤毛远端段。[0174]以上荧光成像数据分析结果表明adr-2能够部分恢复dyf-5ca在纤毛中的定位与分布，进一步地支持了前面发明人提到的dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，dyf-5的mrna完整性出现了一定程度的恢复的猜测；而且在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，正常发挥功能的dyf-5蛋白水平依然很低，和前面发明人看到的igv可视化结果也是高度一致的。发明人认为在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，虽然正常发挥功能的dyf-5蛋白水平很低，但是足以部分恢复dyf-5ca突变体的纤毛表型。[0175]综上，在本实施例中，通过遗传筛选、转录组测序结合生物信息学分析以及荧光成像分析等手段，发明人发现adr-2能够调控dyf-5ca及其调节机制：在dyf-5ca突变体中，adr-2能够对dyf-5ca的第六个外显子到第七个内含子区域进行大量的rna编辑，干扰了dyf-5ca的内含子的正常剪切，造成了内含子的异常滞留，严重破坏了dyf-5ca的mrna完整性。[0176]实施例3dyf-5camrna完整性的机制研究[0177]3.1反义rna作用于adr-2上游，严重破坏dyf-5camrna完整性[0178]在该实施例中，发明人分析了dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中dyf-5位置反义rna的存在情况及其表达水平。发现，在adr-2(ok735)突变体中，dyf-5位置不存在反义rna，但是在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中依然存在大量的反义rna分布。进一步地，发明人对反义rna和mrna表达水平的比例进行了统计分析，发现，和dyf-5ca突变体相比，dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中反义rna和mrna的分布比例没有明显变化，这表明adr-2的缺失不会影响反义rna的产生，而且在dyf-5ca；adr-2(ok735)双突变体中，dyf-5ca的mrna完整性仍受到了严重的破坏，说明反义rna作用于adr-2上游，严重破坏了dyf-5camrna的完整性。[0179]3.2dyf-5ca过高的激酶活性触发反义rna的产生[0180]在该实施例中，发明人对dyf-5ca(d150a)突变体进行了链特异性测序分析，发现：在该突变体中，dyf-5位置不存在反义rna，而且该位置发生的rna编辑现象也随之消失了。因此，以上实验结果表明：dyf-5ca过高的激酶活性作用于dyf-5内含子，使得dyf-5位置产生了大量的反义rna，抑制了dyf-5的正常转录过程，使得dyf-5ca的mrna完整性受到了严重的破坏，但是在这过程中，仍有一些可以逃逸出来的转录出成熟mrna的pre-mrna，这些pre-mrna可以和反义rna互补配对形成双链rna，adr-2的存在使其能够识别这种双链rna结构并发生rna编辑，进一步破坏了dyf-5ca的mrna完整性，从而使其最终在蛋白水平上表现为功能缺失的形式。[0181]综上在本实施例中，发明人针对dyf-5camrna完整性的问题展开了深入的研究，发现：当细胞内激酶活性过高时，其内含子作为顺式调控元件，导致了反义rna的产生，严重破坏了dyf-5camrna完整性；这些异位产生的反义rna和pre-mrna形成的双链rna结构能够被腺苷酸脱氨酶adr-2所识别，对基因的pre-mrna的碱基进行编辑，进一步破坏了dyf-5camrna完整性，降低完整蛋白的生成，从而调节细胞内的激酶活性。[0182]实施例4蛋白激酶自调节机制的普适性[0183]激酶活性的调节是蛋白激酶发挥功能的重要过程，然而目前关于过度活化激酶的作用机制还不清楚。在发明人的工作中，发明人构建了模拟组成型活化dyf-5ca线虫突变体，关于这一问题展开了研究。发明人发现：在细胞内，激酶活性的调节存在负反馈机制，过高的激酶活性能够导致反义rna的产生，进而触发了rna编辑过程，对激酶的pre-mrna的碱基进行编辑，减少完整蛋白的产生，从而进行细胞内激酶数量和活性的调节。然而，发明人的研究对象为模拟组成型活化突变体，缺乏普适性。另外，发明人观察到的生物学现象是在过度活化的dyf-5激酶中发生的，那么别的激酶中是否存在这种自调节机制呢？[0184]发明人通过激酶的过量表达实验从激酶的活性以及数量两个方面进行了进一步的鉴定分析。同时，在前面的工作中，发明人发现过量表达dyf-5的cdna和基因组dna片段呈现出不同的生物学效应，为了进一步解释这一现象，在本实施例中中发明人分别使用dyf-5的cdna和基因组dna片段进行过表达实验，并展开了深入的研究。[0185]4.1过量表达dyf-5干扰内源dyf-5的表达[0186]为了进一步探究dyf-5的细胞学机制，发明人检测了dyf-5的过量表达对于纤毛形态以及内源dyf-5的表达和定位的影响。通过引入红色荧光蛋白mcherry标记osm-6(ift-b复合体组分之一)的转基因标签，发明人发现：过量表达dyf-5的cdna，纤毛形态没有明显变化，但是内源dyf-5在纤毛神经元中的表达水平出现了一定程度的下降；过量表达dyf-5的基因组dna后，发明人基本检测不到完整的纤毛结构，和之前的研究结果高度一致，而且基本检测不到绿色荧光蛋白在纤毛中的信号，内源dyf-5在纤毛神经元中的表达被严重破坏。[0187]4.2过量表达dyf-5使得dyf-5发生了异位的rna编辑[0188]在本实施例中，发明人针对过量表达dyf-5的cdna和基因组dna，处于l3～l4时期的转基因线虫进行了链特异性转录组测序，并分析了dyf-5位置的rna编辑情况，发现：无论过表达dyf-5的cdna还是基因组dna，dyf-5位置都能检测到rna编辑事件的发生。可以看到：过量表达dyf-5cdna后，dyf-5中第三个外显子、第六个外显子以及内含子上发生了低频的rna编辑；过量表达dyf-5基因组dna后，整个dyf-5位置上都有rna编辑事件的发生，而且在第一个内含子、第六至第十个内含子上还存在高频rna编辑的现象。以上实验结果表明：不仅dyf-5激酶活性过高，dyf-5激酶数量过高也能触发自身位置rna编辑事件的发生。[0189]4.3过量表达dyf-5使得dyf-5位置异位产生反义rna[0190]在该实施例中，发明人进行了dyf-5位置反义rna的分析，发现：过量表达dyf-5的cdna和基因组dna都能够导致dyf-5位置反义rna的产生，同时反义rna分布的位置和rna编辑发生的位点也是高度一致的。以上实验结果表明：和dyf-5ca突变体相似，在野生型线虫中过量表达dyf-5，也能够触发dyf-5位置反义rna的异常产生，进而触发rna编辑事件的发生。[0191]4.4adr-2缺失部分恢复dyf-5过量表达导致的纤毛缺陷[0192]在该实施例中，发明人在dyf-5过量表达的转基因线虫中引入了adr-2的缺失突变(adr-2(ok735))，并且借助荧光成像技术在细胞学水平上进行了深入的分析。发现：首先，在成虫水平上，adr-2的缺失不会影响dyf-5cdna过量表达的转基因线虫对荧光染料的摄取，所有转基因线虫都能够正常摄取荧光染料，但是adr-2的缺失能够明显恢复dyf-5基因组dna过量表达所导致的染色缺陷，从8％的转基因线虫染色正常提升到76％的转基因线虫染色正常，而且染色程度和野生型相比没有区别；其次，在细胞学水平上，通过引入红色荧光蛋白mcherry标记osm-6(ift-b复合体组分之一)的转基因标签，发明人对纤毛形态以及内源dyf-5在纤毛中的定位与分布进行了观察检测，发现：adr-2的缺失能够明显恢复dyf-5基因组dna过量表达所引起的纤毛缺陷，纤毛长度也出现了显著性的恢复，与此同时，内源dyf-5在纤毛中的定位与分布也被明显恢复。[0193]4.5蛋白激酶nekl-4/nek10或dyf-18/ccrk的过量表达触发相似的生物学过程[0194]为了进一步探究dyf-5中激酶活性过高或者数量过高所引起的自身负反馈机制在其它蛋白激酶中是否同样存在，发明人针对这一问题进行了深入的研究。有意思的是发明人发现，主要在纤毛中发挥功能的激酶nekl-4/nek10或dyf-18/ccrk基因组dna的过量表达能够导致线虫出现纤毛染色缺陷以及纤毛长度变短的现象；此外，当发明人通过遗传杂交向这些转基因线虫品系中引入adr-2的缺失突变adr-2(ok735)后，发现线虫纤毛染色以及纤毛的长度都出现了明显的恢复。以上实验结果表明：在nekl-4/nek10或dyf-18/ccrk基因组dna过量表达的转基因线虫中，可能存在和dyf-5过量表达的转基因线虫中相似的激酶自调节的生物学过程。[0195]为了进一步验证该假设，发明人分别对nekl-4/nek10和dyf-18/ccrk基因组dna过量表达的转基因线虫品系进行了链特异性转录组测序。通过生物信息学分析，发明人发现：在nekl-4/nek10和dyf-18/ccrk基因组dna过量表达的转基因线虫品系中，它们的过量表达都能够触发自身位置rna编辑事件的发生；而且，这也是由于其自身位置反义rna的异常出现所造成的。因此，以上实验结果表明：在nekl-4/nek10或dyf-18/ccrk基因组dna过量表达的转基因线虫中，存在着与dyf-5过量表达的转基因线虫中相似的激酶自调节的生物学过程，暗示了激酶数量自调节机制的普适性。[0196]综上所述，在本实施例中，结合遗传学等手段，发明人发现，在细胞内，当dyf-5激酶数量过高时，可以发生与dyf-5激酶过度活化所导致的相似的生物学过程：dyf-5cdna和基因组dna的过量表达均能够使得dyf-5激酶自身位置产生反义rna，并且使其自身发生rna编辑，从而破坏其蛋白功能；同时，由于cdna中不存在内含子，adr-2只能对内源表达的dyf-5激酶的pre-mrna的碱基进行编辑，使其呈现出和基因组dna过量表达不一样的细胞学表型；此外，发明人发现，nekl-4/nek10或dyf-18/ccrk基因组dna的过量表达，也会触发与dyf-5相似的生物学过程，表明这是一种在线虫感觉神经元中普遍存在的蛋白激酶自调节机制。[0197]本发明的范围不受上文具体示出和描述的内容的限制。本文所述的内容的变化、修改和其它实现方式在不脱离本发明的精神和范围的情况下将是本领域的普通技术人员显而易见的。当前第1页12当前第1页12