一种抗衰老植物提取组合物及其制备与应用的制作方法

1.本发明属于化妆品领域，涉及一种抗衰老植物提取组合物及其制备与应用。


背景技术：

2.随着人类生活环境和生活方式的不断变化，以及整个人类社会加速进入人口老化，健康长寿的话题越来越受到人们的关注。一些研究认为，衰老与心血管疾病，内脏退行性疾病，恶性肿瘤等有着密切关系。因此，采用适当的方法来减缓衰老是非常重要的。
3.细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。细胞自噬是一种“自己吃自己”过程，是细胞维持物质周转的重要机制，它将衰老的蛋白质、损坏的细胞器等废弃物进行降解并得以循环利用，从而确保细胞本身的代谢需求和某些细胞器的更新，对细胞的存活至关重要。
4.紫苏(学名：perilla frutescens(l.)britt.)是唇形科、紫苏属一年生草本植物。紫苏可供药用和香料用。入药部分以茎叶及子实为主，叶为发汗、镇咳、芳香性健胃利尿剂，有镇痛、镇静、解毒作用，治感冒。木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，大量存在于紫苏、金银花等植物中。具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、降尿酸、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，临床主要用于止咳、祛痰、消炎、降尿酸、治疗心血管疾病、治疗“肌萎缩性脊髓侧索硬化症”，sars，肝炎等。木犀草素以浓度依赖方式诱导hcc细胞株hepg2内ros的增加,并诱导自噬，且cao[1]等发现木犀草素抗hcc细胞株smmc
‑
7721增殖,提高胞内自噬体数量,自噬蛋白lc3
‑ⅰ
向lc3
‑ⅱ
转化,beclin
‑
1表达增加,自噬抑制剂氯喹干预后凋亡减少,表明木犀草素诱导的自噬促进凋亡。
[0005]
苦参，(sophora flavescens alt.)是豆科、槐属草本或亚灌木植物，稀呈灌木状，通常高可达2米。用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风，外治滴虫性阴道炎。苦参碱(murine)是苦参的主要活性成分,具有抗病毒、抗过敏和抗肿瘤等作用。yang等[2]发现,苦参碱抑制活体内mhcc97l移植瘤生长,促进mhcc97l和huh
‑
7细胞中lc3
‑ⅱ
、beclin
‑
1和pi3kc3的上调及自噬底物p62的下调。
[0006]
昆布(ecklonia kurome)亦称“黑菜”、“鹅掌菜”、“五掌菜”等。褐藻纲，翅藻科。昆布性寒,味咸。有软坚散结、消肿利水、润下消痰之功,临床上用于甲状腺肿、颈淋巴结肿、支气管炎、肺结核、咳嗽和老年性白内障等,亦试用于治疗癌症。褐藻素(fucoxanthin)为昆布的有效成分之一,廖政邦等[3]的实验发现,褐藻素诱导hepg2细胞自噬和凋亡,表现为beclin
‑
1、lc3蛋白增加及自噬溶酶体的形成,akt的活化受抑制。3
‑
ma干预提高凋亡率并促进caspase
‑
3活化,提示褐藻素可能通过抑制akt通路诱导保护性自噬。
[0007]
过氧化物(o2
‑
)分子是活性氧(ros)的重要组成成分，是线粒体合成atp的副产物，越来越多证据表明ros是细胞损伤甚至死亡的重要原因，参与各种生理过程。自噬是细胞缺乏能量及氧气等代谢条件下出现的生理过程，自噬可以降低ros水平，避免细胞进一步的损伤。
[0008]
现有的研究几乎很少提及到紫苏、苦参、昆布三者复配在化妆品领域的应用。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的是提供一种抗衰老植物提取组合物及其制备与应用，解决了现有技术中存在的问题。本发明以三者复配比例，对其影响皮肤衰老细胞自噬过程为切入点进行相关测试，最终获得一种加量少、效果强的植物提取组合物。
[0010]
本发明提供了一种抗衰老植物提取组合物，由下述方法制备而成，将紫苏：苦参：昆布按质量比为(1
‑
3):(1
‑
3):(1
‑
3)，通过粉碎、初提、浓缩制备而成。
[0011]
作为优选，所述紫苏：苦参：昆布按质量比为(2
‑
3):(1
‑
2):(2)，优选为3:1:2或2:1:2或3:2:2。
[0012]
作为优选，所述制备方法具体如下：
[0013]
(1)将原料紫苏、苦参、昆布分别粉碎，按比例混合；
[0014]
(2)加入去离子水提取，原料与去离子水的质量比为1:20
‑
1:50，40
‑
50℃水浴3
‑
5小时，加入纤维素酶，搅拌30分钟，升温至40
‑
60℃微波处理5
‑
15分钟，超声水浴回流提取1
‑
3小时得到提取液；
[0015]
(3)将步骤(2)得到的提取液冷却至20
‑
30℃，用100
‑
200目纱布过滤，得第一滤液；
[0016]
(4)将第一滤液与正丁醇以1:1体积比萃取，分离正丁醇层；连续萃取3
‑
4次，合并正丁醇层溶液，减压浓缩，减压浓缩温度为85
‑
100℃；
[0017]
(5)向步骤(4)得到的正丁醇层溶液中加入澄清剂，静置后离心30
‑
60分钟，用微滤膜过滤后得到二次滤液；
[0018]
(6)将步骤(5)得到的二次滤液减压浓缩，得浓缩液。
[0019]
(7)将步骤(6)得到的溶液用超滤膜进行过滤，收集滤液，得到所述的植物提取组合物。
[0020]
进一步优选，所述纤维素酶加入的总质量占原料总质量的5％
‑
10％。
[0021]
进一步优选，所述步骤(5)中的澄清剂为天然澄清剂、壳聚糖、果汁澄清剂、明胶、蛋清中的一种或几种。
[0022]
进一步优选，所述步骤(5)中的微滤膜孔径为0.1
‑
1.0μm；
[0023]
所述步骤(7)中的超滤膜孔径为0.01
‑
0.05μm。
[0024]
本发明还提供了一种化妆品，包括上述的植物提取组合物以及化妆品可使用的助剂；所述化妆品包括但不限于水剂、乳剂、喷雾、膏霜、凝胶剂、面膜。
[0025]
作为优选，所述组合物占化妆品的质量百分比为0.5
‑
5％。
[0026]
本发明还提供了一种所述组合物在制备影响衰老细胞自噬过程的具有抗衰老功效的化妆品中的应用。
[0027]
本发明还提供了一种抗衰老植物提取组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0028]
(1)将原料紫苏、苦参、昆布分别粉碎，按比例混合；
[0029]
(2)加入去离子水提取，原料与去离子水的质量比为1:20
‑
1:50，40
‑
50℃水浴3
‑
5小时，加入纤维素酶，搅拌30分钟，升温至40
‑
60℃微波处理5
‑
15分钟，超声水浴回流提取1
‑
3小时得到提取液；
[0030]
(3)将步骤(2)得到的提取液冷却至20
‑
30℃，用100
‑
200目纱布过滤，得第一滤液；
[0031]
(4)将第一滤液与正丁醇以1:1体积比萃取，分离正丁醇层；连续萃取3
‑
4次，合并正丁醇层溶液，减压浓缩，减压浓缩温度为85
‑
100℃；
[0032]
(5)向步骤(4)得到的正丁醇层溶液中加入澄清剂，静置后离心30
‑
60分钟，用微滤膜过滤后得到二次滤液；
[0033]
(6)将步骤(5)得到的二次滤液减压浓缩，得浓缩液；
[0034]
(7)将步骤(6)得到的溶液用超滤膜进行过滤，收集滤液，得到所述的植物提取组合物；
[0035]
所述紫苏：苦参：昆布按质量比为(2
‑
3):(1
‑
2):(2)，优选为3:1:2或2:1:2或3:2:2。
[0036]
本发明提供一种影响衰老细胞自噬的抗衰老植物提取组合物、组合物制备方法及应用。所述提取物由紫苏、苦参、昆布组成，该植物提取组合物通过粉碎、提取、浓缩、配方、除菌等工艺制备所得，各组分协同效应良好，能够影响皮肤衰老细胞自噬过程，起到的作用，且性质温和、易于吸收、无刺激，特别符合人们对化妆品安全有效、零负担的要求，可广泛应用于皮肤护理化妆品。
附图说明
[0037]
图1是实验例2中不同组合物对hhdpc细胞影响的对比图。
具体实施方式
[0038]
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。
[0039]
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
[0040]
实施例1：能够影响皮肤衰老细胞自噬效果的植物提取组合物的制备
[0041]
在本发明下述的实施例及对比例中，能够影响皮肤衰老细胞自噬效果的植物提取组合物采用以下工艺制备。
[0042]
(1)将原料按照质量比分别粉碎；
[0043]
(2)加入去离子水提取，原料与去离子水的质量比为1:30，48℃水浴4小时，加入纤维素酶，所加入的酶总质量占原料总质量的8％，搅拌30分钟，升温至54℃微波处理15分钟，超声水浴回流提取3小时；
[0044]
(3)将步骤(2)得到的提取液冷却至室温，用200目纱布过滤，得滤液1；
[0045]
(4)将滤液1与正丁醇以1:1体积比实施萃取，用力振摇，静止3h后，分离正丁醇层，连续萃取3次，合并正丁醇层溶液，置于旋转蒸发仪中减压回收正丁醇，温度为85℃；
[0046]
(5)向步骤(4)得到的正丁醇层溶液中加入澄清剂，静置后离心30分钟，用微滤膜过滤后得到二次滤液；
[0047]
(6)其特征在于，步骤(4)所述转速为8000rpm；
[0048]
(7)将步骤(5)得到的二次滤液减压浓缩，减压浓缩回收正丁醇，得浓缩液。
[0049]
(8)将步骤(7)得到的溶液用超滤膜进行过滤，收集滤液，得到一种影响衰老细胞自噬的抗衰老植物提取组合物。
[0050]
实施例2：不同比例组合物复配对过氧化物(o2‑
)的清除测试
[0051]
按照实施例1中的方法将三种植物提取物按照下表2比例进行复配，得到组合物1
‑
15，对比例1
‑
3。
[0052]
表1
[0053][0054]
在本发明上述的组合物及对比例中，植物提取组合物对过氧化物(o2‑
)的清除测试方法和结果如下：
[0055]
o2‑
自由基清除测试
[0056]
取4.0ml tris
‑
hcl缓冲溶液(ph8.2，50.0mmol/l)，加入1.0ml受试液，于25℃水浴保温10min。加入0.1ml邻苯三酚溶液(25.0mmol/l)，混合后充分摇匀，保温5min，滴加几滴
盐酸溶液(10.0mmol/l)结束反应，于325nm处测定吸光度a，平行测定3次。以维生素c为阳性对照。
[0057]
按以下公式计算各受试液对o2‑
自由基清除率：
[0058]
o2‑
清除率(％)＝[a0
‑
(a1
‑
a2)]/a0*100％
[0059]
式中：a0为空白对照液的吸光度；
[0060]
a1为加入受试液后反应的吸光度；
[0061]
a2为不加邻苯三酚的受试液的吸光度。
[0062]
实验结果：结果下表2，将组合物1
‑
15与对比例1
‑
3比较后，发现：
[0063]
1)3种原料复配组合后对过氧化物(o2‑
)的清除效果优于单一植物；
[0064]
2)在3种植物复配组合的不同比例对应的过氧化物清除率不同，优选为紫苏：苦参：昆布＝(1
‑
3):(1
‑
3):(1
‑
3)，更优选为紫苏：苦参：昆布＝3:1:2或2:1:2或3:2:2。
[0065]
表2
[0066]
[0067][0068]
上述试验结果表明，测试例1
‑
15组合物相对空白组，都具有清除过氧化物(o2‑
)效果，但相同条件下组合物比例不同，对过氧化物的清除效果也会有影响，其中组合物7、12、14的抑菌效果相对较好。
[0069]
实施例3：自噬基因lc3a的表达检测
[0070]
(1)mtt细胞毒性测试
[0071]
在96well multi plate(corning)中按照1x10
4 cells/well的密度接种含有10％牛血清的dmem培养基和角质形成细胞(hacat)各100μl，培养24小时后换成无血清培养基。在无血清培养基中分别加入上述实施例中组合物7、12、14进行处理后培养24小时。之后去除培养基，用20μl的mtt溶液进行处理，在37℃下使其反应2小时。在去除mtt溶液的细胞中加入200μl异丙醇，轻轻地震荡30min，完全溶解结晶甲臜，在570nm处测定吸光度，根据如下公式计算细胞存活率。
[0072][0073]
对照组不加入样品进行试验。细胞毒性相关结果见下表3。
[0074]
表3
[0075][0076]
(2)自噬基因表达检测
[0077]
表4
[0078][0079]
将表皮角质细胞(hacat)接种于含dk－sfm培养液的培养瓶中，置于37℃的co2(co2体积分数为5％)恒温培养箱中培养6d。将细胞培养瓶取出，在其中加入胰蛋白酶消化4min，然后将细胞接种于96孔板，孵育24h，对照组每孔加200μl细胞培养液，加药组每孔加200μl含1％组合物7/12/14的植物提取组合物提取液，培养箱中培养24h，用qpcr检测lc3a基因的表达，结果重复三次取平均值。检测结果如图1所示。
[0080]
实验结果得知，用组合物7/12/14进行培养，自噬相关基因lc3a的表达率明显提高，因此可以判断紫苏、苦参、昆布三者组合能够有效影响细胞自噬的进程。
[0081]
实施例4：细胞内ros水平检测
[0082]
将大鼠皮肤成纤维细胞培养于含体积分数10％新生牛血清的dmem培养基中，并置于37℃的co2(co2体积分数为5％)恒温培养箱中，传代培养后的人皮肤成纤维细胞呈球形，培养4h后细胞开始贴壁生长，逐渐变为梭形，24h细胞基本贴壁，采用第7代的细胞进行实验，培养48～72h，用作细胞内活性氧的表达检测。
[0083]
将成纤维细胞按1*100个/ml接种于六孔板，每孔2ml，分别以20，50，100mg/l的植物提取组合物物干预成纤维细胞24小时后，加入终浓度为200μmol/l的h2o2培养4小时，另设空白对照组(不加h2o2和药品)和模型组(只加h2o2不加药物)，胰酶消化收集细胞，按照活性氧检测试剂盒进行操作，上流式细胞仪检测荧光强弱。
[0084]
结果如下表5：
[0085]
表5
[0086]
[0087][0088]
结果显示，测试例1
‑
15的组合物都有降低细胞内活性氧水平的效果。其中组合物7、12、14的效果较好，组合物12的效果最好。
[0089]
实施例5
[0090]
在具体实施方式中，本发明提供了一种能够有效抵的面膜肌底液的配方工艺，具体配方如下表6：
[0091]
表6
[0092]
水86.95甘油4.55丁二醇2.6双丙甘醇2赤藓醇1.5双
‑
二乙氧基二甘醇环己烷1,4
‑
二羧酸酯0.5对羟基苯乙酮0.4
精氨酸0.11聚甲基硅倍半氧烷0.1丙烯酸(酯)类/c10
‑
30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.08泛醇0.1乙基己基甘油0.04卡波姆0.03甘草酸二钾0.03edta二钠0.01植物提取组合物1
[0093]
添加权利要求所述提取物，将组合物7、12、14加入下表7面膜肌底液配方中，添加量为1％，制得面膜肌底液实施例1
‑
3。
[0094]
表7
[0095]
组合物7组合物12组合物14样品1样品2样品3
[0096]
实施例6
[0097]
1.安全性测试(人体皮肤斑贴试验)
[0098]
选取15名年龄为20
‑
50岁之间的无皮肤病过敏史的健康受试者，斑贴方法：选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方式，取约15μl样品1
‑
3的样品滴于斑试器内，外用专用胶带贴覆于受试者背部，每个受试者贴20个斑试器，分别贴试样品1
‑
3的肌底液样品，24小时后除去受试物，去除后分别于0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《护肤品卫生规范》中皮肤反应等级标准记录其结果。
[0099]
试验结果：人体皮肤斑贴试验结果显示所有受试者通过斑贴试验，在0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，其中0例出现皮肤红斑、丘疹、水疱等不良反应，说明本发明的产品安全，无刺激。
[0100]
2.人群测试
[0101]
受试样品：实施例1
‑
3的有效的面膜肌底液，以不添加植物提取物的面膜肌底液为对照组。
[0102]
受试人群：60人，无皮肤过敏史，符合受试者志愿入选标准，年龄18
‑
35岁之间，分成4组，每组15人。面部有明显的暗黄，粗糙，皱纹等不良状态。
[0103]
测试方法：取适量受试样品于涂在已清洁的患处，每天2次，早晚各1次，持续4周。受试者在使用期间保持良好作息时间和饮食习惯，4周后统计受试者的反馈情况。其中面部纹理得到改善、皮肤变得细腻有光泽为显著；面部纹理略微改善、皮肤略微细腻为有效；其他为无效。具体结果见下表8。
[0104]
表8
[0105][0106]
本技术还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本技术权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。
[0107]
本技术说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。
[0108]
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。
[0109]
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
[0110]
上述说明示出并描述了本技术的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本技术并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本技术的精神和范围，则都应在本技术所附权利要求的保护范围内。