雷公藤有效成分治疗冠状病毒感染的用途的制作方法

1.本发明属于医药领域，涉及雷公藤的新用途，具体涉及雷公藤及其有效成分用于治疗冠状病毒感染的用途。


背景技术：

2.高致病性冠状病毒感染成了这十年来广受关注公共卫生问题。严重急性呼吸综合征(sars，2002
‑
2004)，中东呼吸综合征(mers，2012
‑
至今)， 2019
‑
ncov(covid
‑
19)，每一个对人类健康，经济发展都带了巨大的冲击。由于没有针对性的有效药物疫苗产能受限，且对突变株的保护率下降，新型冠状病毒的新药研发意义重大，在这场没有硝烟的战争中，全球多家科研机构和制药公司致力于研发新型冠状病毒疫苗和治疗药物。因此发明具有重大的社会学和经济学意义。


技术实现要素：

3.本发明发明人首次发现，雷公藤中的成分：雷公藤红素，扁塑藤素，去甲泽拉木醛可以结合冠状病毒主蛋白酶(3cl pro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(plp)，从而抑制病毒复制。
4.鉴于此，本发明的目的在于提供可以预防和治疗冠状病毒感染的有效广谱抑制剂，可以预防和治疗冠状病毒引起的肺炎感染或普通感冒。同时，提供雷公藤有效成分预防和治疗冠状病毒感染的用途。
5.本发明具体地是通过以下技术方案实现的：
6.一方面，本发明提供了雷公藤有效成分雷公藤红素，扁塑藤素和/或去甲泽拉木醛在制备预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物中的用途；优选地，所述雷公藤有效成分为去甲泽拉木醛。去甲泽拉木醛可以单独与雷公藤红素或扁塑藤素结合使用。
7.雷公藤的有效成分：雷公藤红素，扁塑藤素或去甲泽拉木醛可以市购，或者按照常规方法从雷公藤中提取。
8.购买来源，雷公藤红素购买于索莱宝公司,货号(sc8190)。
9.雷公藤红素的结构式如下：
[0010][0011]
中文名称：雷公藤红素
[0012]
英文名称：celastrol
[0013]
别称：南蛇藤素
[0014]
分子式：c
29
h
38
o4[0015]
分子量：450.61
[0016]
cas号：34157
‑
83
‑0[0017]
用途：雷公藤红素(celastrol)来源于中药雷公藤的根皮，它是治疗类风湿病雷公藤片、雷公藤多苷片等制剂的有效成分之一。现代研究表明：它有很强的抗氧化作用，有抗癌症新生血管生成作用，有抗类风湿作用。
[0018]
购买来源，扁塑藤素购买于索莱宝公司,货号(sp9410)。
[0019]
扁塑藤素的结构式如下：
[0020][0021]
中文名称：扁塑藤素
[0022]
英文名称：pristimerin
[0023]
别称：扁蒴藤素；扁塑藤素；扁塑藤素
[0024]
分子式：c
30
h
40
o4[0025]
分子量：464.642
[0026]
cas号：1258
‑
84
‑0[0027]
用途：扁塑藤素(pristimerin)来源于卫矛科植物雷公藤tripterygium wilfordii hook. f.的全株或去皮木质部份。扁塑藤素可以抑制癌细胞、卵巢癌。此外，扁塑藤素是高效可逆的单酰基甘油脂肪酶(mgl)抑制剂，ic50值为93nm。
[0028]
购买来源，去甲泽拉木醛购买于四川维克奇公司。
[0029]
去甲泽拉木醛的结构式如下：
[0030][0031]
中文名称：去甲泽拉木醛
[0032]
英文名称：demethylzelasteral
[0033]
别称：去甲泽拉木醇
[0034]
分子式：c
29
h
36
o6[0035]
分子量：480.59
[0036]
cas号：107316
‑
88
‑1[0037]
用途：去甲泽拉木醛(demethylzelasteral)来源于卫矛科植物雷公藤tripterygiumwilfordii hook.f.的全株或去皮木质部份。去甲泽拉木醛具有较强的免疫抑制、抗癌、抗炎作用。
[0038]
根据本发明上述新用途的一个具体实施方式，其中，所述疾病是2019 新型冠状病毒肺炎，严重急性呼吸综合症肺炎(sars),中东呼吸综合症肺炎(mers)以及人冠状病毒oc43(hcov
‑
oc43)引发的普通感冒；其中所述冠状病毒为2019新型冠状病毒(2019
‑
cov),严重急性呼吸综合症病毒(sars), 中东呼吸综合症病毒(mers)以及普通感冒病毒(hcov
‑
oc43)。
[0039]
根据本发明上述新用途的一个具体实施方式，其中，所述冠状病毒为人冠状病毒nl63(hcov
‑
nl63)、人冠状病毒229e(hcov
‑
229e)或人冠状病毒 hku1(hcov
‑
hku1)。
[0040]
根据本发明上述新用途的一个具体实施方式，其中，所述冠状病毒为新冠病毒现有的突变株，例如英国突变株，南非突变株，印度突变株，以及未来新增的新冠突变株。
[0041]
另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗冠状病毒感染的药物组合物，其特征在于：含有治疗或预防有效量的雷公藤有效成分雷公藤红素，扁塑藤素和/或去甲泽拉木醛以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；优选地，所述雷公藤有效成分为去甲泽拉木醛。
[0042]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述药物组合物为口服制剂或口腔或鼻吸入制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂。
[0043]
本发明还提供了一种用于预防或治疗冠状病毒感染的口服制剂，其特征在于：含治疗有效量的雷公藤有效成分雷公藤红素，扁塑藤素和/或去甲泽拉木醛和任选的其他抗冠状病毒感染的药物活性成分，以及药学上可接受的载体辅料。
[0044]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述有效成分雷公藤红素，扁塑藤素和/或去甲泽拉木醛来源于雷公藤。
[0045]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述口服制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂，优选片剂。
[0046]
本发明提供了雷公藤提取物的新用途，作为冠状病毒有效的广谱抑制剂，可以治疗2019新型冠状病毒肺炎，严重急性呼吸综合症肺炎(sars), 中东呼吸综合症肺炎(mers)以及人冠状病毒oc43(hcov
‑
oc43)引发的普通感冒。
[0047]
本发明的化合物可以配制成各种适合的药物制剂形式。
[0048]
本发明的有益效果
[0049]
与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
[0050]
雷公藤抑制冠状病毒的有效成分主要是：雷公藤红素，扁塑藤素，去甲泽拉木醛，可以结合2019新型冠状病毒主蛋白酶(3clpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(plp)， 3cl和plp蛋白酶是催化rna病毒前体蛋白裂解的关键蛋白酶，对病毒的复制有重要作用，而且高度保守。因此雷公藤可以抑制2019新型冠状病毒复制。作为老药新用，雷公藤的安全性没有问题，因此可以应用于临床
[0051]
雷公藤有效成分有效成分在细胞水平能够抑制冠状病毒主蛋白酶(3clpro) 和木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)，明显的抑制病毒的复制，从而达到治疗2019 新型冠状病毒感染及其它冠状病毒感染。
附图说明
[0052]
图1.sars
‑
cov
‑
2 3cl&celastrol传感图
[0053]
图1显示雷公藤红素和sars
‑
cov
‑
2 3cl的亲和力。
[0054]
图2.sars 3cl&celastrol传感图
[0055]
图2显示雷公藤红素和sars 3cl的亲和力。
[0056]
图3.mers 3cl&celastrol传感图
[0057]
图3显示雷公藤红素和mers 3cl的亲和力。
[0058]
图4.sars
‑
cov
‑
2 plp&celastrol传感图
[0059]
图4显示雷公藤红素和sars
‑
cov
‑
2plp的亲和力。
[0060]
图5.sars plp&celastrol传感图
[0061]
图5显示雷公藤红素和sars plp的亲和力。
[0062]
图6mers plp&celastrol传感图
[0063]
图6显示雷公藤红素和mers plp的亲和力。
[0064]
图7.sars
‑
cov
‑
2 3cl&pristimerin传感图
[0065]
图7显示扁塑藤素和sars
‑
cov
‑
2 3cl的亲和力。
[0066]
图8.sars 3cl&pristimerin传感图
[0067]
图8显示扁塑藤素和sars 3cl的亲和力。
[0068]
图9.mers 3cl&pristimerin传感图
[0069]
图9显示扁塑藤素和mers 3cl的亲和力。
[0070]
图10.sars
‑
cov
‑
2 plp&pristimerin传感图
[0071]
图10显示扁塑藤素和sars
‑
cov
‑
2plp的亲和力。
[0072]
图11.sars plp&pristimerin传感图
[0073]
图11显示扁塑藤素和sars plp的亲和力。
[0074]
图12.mers plp&pristimerin传感图
[0075]
图12显示扁塑藤素和mers plp的亲和力。
[0076]
图13.sars
‑
cov
‑
2 3cl&demethylzelasteral传感图
[0077]
图13显示去甲泽拉木醛和sars
‑
cov
‑
2 3cl的亲和力。
[0078]
图14.sars 3cl&demethylzelasteral传感图
[0079]
图14显示去甲泽拉木醛和sars 3cl的亲和力。
[0080]
图15.mers 3cl&demethylzelasteral传感图
[0081]
图15显示去甲泽拉木醛和mers 3cl的亲和力。
[0082]
图16.sars
‑
cov
‑
2 plp&demethylzelasteral传感图
[0083]
图16显示去甲泽拉木醛和sars
‑
cov
‑
2 plp的亲和力。
[0084]
图17.sars plp&demethylzelasteral传感图
[0085]
图17显示去甲泽拉木醛和sars plp的亲和力。
[0086]
图18.mers plp&demethylzelasteral传感图
[0087]
图18显示去甲泽拉木醛和mers plp的亲和力。
[0088]
图19.雷公藤红素抑制2019新型冠状病毒3cl蛋白酶的ic
50
[0089]
图19显示荧光共振能量转移(fret)法检测雷公藤红素对2019 cov 3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0090]
图20.扁塑藤素抑制2019新型冠状病毒3cl蛋白酶的ic
50
[0091]
图20显示荧光共振能量转移(fret)法检测扁塑藤素对2019 cov 3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0092]
图21.去甲泽拉木醛抑制2019新型冠状病毒3cl蛋白酶的ic
50
[0093]
图21显示荧光共振能量转移(fret)法检测去甲泽拉木醛对2019 cov 3clpro 细胞外蛋白酶切活性的影响
[0094]
图22.雷公藤红素抑制mers冠状病毒3cl蛋白酶的ic
50
[0095]
图22显示荧光共振能量转移(fret)法检测雷公藤红素对mers 3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0096]
图23.扁塑藤素抑制mers冠状病毒3cl蛋白酶的ic
50
[0097]
图23显示荧光共振能量转移(fret)法检测扁塑藤素对mers 3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0098]
图24.去甲泽拉木醛抑制mers冠状病毒3cl蛋白酶的ic
50
[0099]
图24显示荧光共振能量转移(fret)法检测去甲泽拉木醛对mers 3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0100]
图25.雷公藤红素抑制2019新型冠状病毒plp蛋白酶的ic
50
[0101]
图25显示荧光共振能量转移(fret)法检测雷公藤红素对2019 cov plpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0102]
图26.扁塑藤素抑制2019新型冠状病毒plp蛋白酶的ic
50
[0103]
图26显示荧光共振能量转移(fret)法检测扁塑藤素对2019 cov plpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0104]
图27.去甲泽拉木醛抑制2019新型冠状病毒plp蛋白酶的ic
50
[0105]
图27显示荧光共振能量转移(fret)法检测去甲泽拉木醛对2019 cov plpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0106]
图28.雷公藤红素抑制mers冠状病毒plp蛋白酶的ic
50
[0107]
图28显示荧光共振能量转移(fret)法检测雷公藤红素对mers plpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0108]
图29.扁塑藤素抑制mers冠状病毒plp蛋白酶的ic
50
[0109]
图29显示荧光共振能量转移(fret)法检测扁塑藤素对mers plpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0110]
图30.去甲泽拉木醛抑制mers冠状病毒plp蛋白酶的ic
50
[0111]
图30显示荧光共振能量转移(fret)法检测去甲泽拉木醛对mers plpro细胞外蛋白酶切活性的影响。
[0112]
图31.扁塑藤素抑制oc43病毒
[0113]
图31显示对核蛋白免疫荧光染色检测扁塑藤素对冠状病毒oc43的抑制效果
[0114]
图32.雷公藤红素抑制oc43病毒
[0115]
图32显示对核蛋白免疫荧光染色检测雷公藤红素对冠状病毒oc43的抑制效果
[0116]
图33.去甲泽拉木醛抑制oc43病毒
[0117]
图33显示对核蛋白免疫荧光染色检测去甲泽拉木醛对冠状病毒oc43的抑制效果
[0118]
图34雷公藤红素的cc
50
[0119]
图34显示雷公藤红素的半数毒性浓度cc
50
[0120]
图35扁塑藤素的cc
50
[0121]
图35显示扁塑藤素的半数毒性浓度cc
50
[0122]
图36去甲泽拉木醛的cc
50
[0123]
图36显示去甲泽拉木醛的半数毒性浓度cc
50
[0124]
下面结合具体实验操作及数据，进一步说明本方面的技术方案。
[0125]
以下通过试验说明雷公藤有效成分对各个亚型冠状病毒的抑制作用。
具体实施方式
[0126]
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，这些实施例仅是对本发明的举例说明而已，无论如何不能解释为对本发明范围的限制。
[0127]
实施例1:spr实验
[0128]
实验材料与仪器
[0129]
biacore t200(ge healthcare,uppsala,sweden),cm5芯片(ge healthcare, uppsala,sweden)，2019
‑
cov 3cl蛋白(近岸蛋白)，2019
‑
cov pl蛋白(近岸蛋白),sars 3cl蛋白(r&d),mers 3cl蛋白(genescript),sars plp蛋白(义翘神州),mers plp蛋白(genescript)
[0130]
2019新冠病毒3cl蛋白spr实验(如图1、7、13所示)
[0131]
机型为ge公司的biacore t200,将2019新型冠状病毒的3cl蛋白(近岸蛋白)通过氨基偶联到cm5芯片上，偶联量为10125.4ru,测量化合物和3cl蛋白在25℃下的亲和力。以
30μl/分钟的流速以100um,50um,25um,12.5um,6.25um, 3.125um，1.5625um,0um的浓度注入化合物,进样时间180s,解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。
[0132]
2019新冠病毒plp蛋白spr实验(如图4、10、16所示)
[0133]
机型为ge公司的biacore t200,将2019新型冠状病毒的plp蛋白(近岸蛋白)通过氨基偶联到cm5芯片上，偶联量为15846.8ru,测量化合物和plp蛋白在25℃下的亲和力。以30μl/分钟的流速以100um,50um,25um,12.5um,6.25um, 3.125um，1.5625um,0um的浓度注入化合物,进样时间180s,解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。
[0134]
sars病毒3cl蛋白spr实验(如图2、8、14所示)
[0135]
机型为ge公司的biacore t200,将sars病毒的plp蛋白(义翘神州)通过氨基偶联到cm5芯片上，偶联量为10452.5ru,测量化合物和sars病毒3cl 蛋白在25℃下的亲和力。以30μl/分钟的流速以100um，50um,25um,12.5um, 6.25um,3.125um，1.5625um,0.78125um,0um的浓度注入化合物,进样时间180s, 解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。
[0136]
sars病毒plp蛋白spr实验(如图5、11、17所示)
[0137]
机型为ge公司的biacore t200,将sars病毒的plp蛋白(义翘神州)通过氨基偶联到cm5芯片上，偶联量为15357.7ru,测量化合物和sars病毒plp 蛋白在25℃下的亲和力。以30μl/分钟的流速以100um，50um,25um,12.5um, 6.25um,3.125um，1.5625um,0.78125um,0um的浓度注入化合物,进样时间180s, 解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。
[0138]
mers病毒3cl蛋白spr实验(如图3、9、15所示)
[0139]
机型为ge公司的biacore t200,将mers病毒的3cl蛋白(genescript)通过氨基偶联到cm5芯片上，偶联量为9856ru,测量化合物和mers病毒3cl蛋白在25℃下的亲和力。以30μl/分钟的流速以100um，50um,25um,12.5um, 6.25um,3.125um，1.5625um,0.78125um,0um的浓度注入化合物,进样时间180s, 解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。
[0140]
mers病毒plp蛋白spr实验(如图6、12、18所示)
[0141]
机型为ge公司的biacore t200,将mers病毒的plp蛋白(genescript)通过氨基偶联到cm5芯片上，偶联量为10459.4ru,测量化合物和mers病毒plp 蛋白在25℃下的亲和力。以30μl/分钟的流速以100um，50um,25um,12.5um, 6.25um,3.125um，1.5625um,0.78125um,0um的浓度注入化合物,进样时间180s, 解离时间300s。数据分析方式为稳态分析。
[0142]
spr结果总结在下表中
[0143]
表1.在25℃下雷公藤红素结合冠状病毒3cl和plp蛋白的亲和力(如图1
‑
6所示)
[0144] kd(m)rmax(ru)chi2(ru2)chi2019 cov 3cl1.601*10
‑514.11.351.16sars 3cl5.428*10
‑69.2510.3130.56mers 3cl1.644*10
‑56.9660.01640.1282019 cov plp3.953*10
‑516.650.009830.0992sars plp1.976*10
‑68.9080.0490.221mers plp7.745*10
‑67.1630.3860.621
[0145]
表2.在25℃下扁塑藤素结合冠状病毒3cl和plp蛋白的亲和力(如图7
‑
12所示)
[0146][0147][0148]
表3.在25℃下去甲泽拉木醛结合冠状病毒3cl和plp蛋白的亲和力(如图13
‑
18所示)
[0149] kd(m)rmax(ru)chi2(ru2)chi2019 cov 3cl1.601*10
‑514.11.351.16sars 3cl5.428*10
‑69.2510.3130.56mers 3cl1.644*10
‑56.9660.01640.1282019 cov plp3.953*10
‑516.650.009830.0992sars plp1.976*10
‑68.9080.0490.221mers plp7.745*10
‑67.1630.3860.621
[0150]
实施例2：荧光共振能量转移(fret)法检测化合物对3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0151]
实验材料与仪器
[0152]
荧光底物dabcyl
‑
knstlqsglrke
‑
edans:由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
[0153]
荧光底物母液：用高压灭菌的缓冲液(20mm tris
‑
hcl,ph7.4,120mm nacl) 配制，终浓度为100um。分装成小份，冻存于
‑
20℃备用；
[0154]
化合物母液：用100％dmso配制，终浓度为100mm,4℃保存备用；
[0155]
hbs
‑
ep工作缓冲液(10mm hepes,150mm nacl,3mm edta和0.005％(v/v) surfactant p20,ph7.4)；
[0156]
酶标仪(md公司)
[0157]
3cl蛋白酶fret检测原理：
[0158]
3cl蛋白酶的荧光底物根据3cl蛋白酶底物切割的特异性(核心序列为l
‑
q
‑ꢀ‑
s)设计合成。edans和dabcyl为常用的荧光
‑
淬灭分子对，最适激发波长为 340nm,最适发射波长为490nm。dabcyl对edans的淬灭效率大于95％，用荧光方法检测背景值很低。在未加3cl蛋白酶时，两个荧光集团之间的距离很短，约10
‑
100a。在光激发状态下，edans的能力被dabcyl淬灭，该量子现象称为共振能量转移。经过蛋白酶特异性切割后，多肽底物断裂，荧光基团和淬灭基团分离，恢复其本身的全部荧光，所以一个低荧光的多肽底物经过酶切割后成为高荧光的物质，而且荧光强度的增加与多肽水解的程度呈线性相关。底物的氨基酸序列为knstlqsglrke,赖氨酸k修饰dabcyl,谷氨酸e修饰edans，修饰后多肽分子量：
1860.1。
[0159]
化合物抑制冠状病毒3cl蛋白酶的ic
50
测定：
[0160]
将化合物母液稀释，得到浓度依次为100mm、20mm、10mm、2mm、1mm、 200um、100um、20um的化合物溶液，取各浓度化合物溶液1.2ul,分别与120ul 的2um 3cl蛋白酶充分混合(dmso的终浓度为0.5％)，在4℃孵育2小时。然后取各浓度样品100ul加到96孔板中，再分别加入100ul 20um的荧光底物溶液开始反应，此时3cl蛋白酶的终浓度为1um,荧光底物的终浓度为10um，化合物的终浓度分别为500um、100um、50um、10um、5um、1um、0.5um、0.1um。以340nm波长的光激发，检测发射波长为488nm下的荧光值变化，反应连续测定1小时，完成化合物对冠状病毒3cl蛋白酶抑制作用的测定。测定化合物ic
50
值时设定空白对照，即不加化合物，但加相同浓度dmso的3cl蛋白酶样品以及单独荧光底物溶液的样品。每个样品设复孔，测定值取平均。根据不同浓度化合物存在条件下，冠状病毒3cl蛋白酶酶切荧光底物的反应速度，与未加化合物但加0.5％dmso的反应速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率(以含 0.5％dmso条件下的酶活性为100％，抑制率＝100％
‑
不同抑制剂浓度下的酶的相对活性x100％)。根据logistic公式用origin软件进行非线性拟合计算化合物对 3cl蛋白酶活性抑制的ic
50
值。公式如下：
[0161][0162]
上述公式中，a0指加0.5％dmso时的酶活性，a(i)指不同化合物浓度下的酶活性，i指化合物的浓度，p指u因子。
[0163]
在25℃下雷公藤红素、扁塑藤素、去甲泽拉木醛抑制冠状病毒3cl蛋白的 ic
50
值(如图19
‑
25所示)
[0164]
ic
50
2019 cov 3clmers 3cl雷公藤红素2.82um1.422um扁塑藤素4.206um3.185um去甲泽拉木醛0.7935um49.08um
[0165]
实施例3荧光共振能量转移(fret)法检测化合物对plp pro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0166]
实验材料与仪器
[0167]
荧光底物dabcyl
‑
krlkggapikge
‑
edans:由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
[0168]
荧光底物母液：用高压灭菌的缓冲液(20mm tris
‑
hcl,ph7.4,120mm nacl) 配制，终浓度为100um。分装成小份，冻存于
‑
20℃备用；
[0169]
化合物母液：用100％dmso配制，终浓度为100mm,4℃保存备用；
[0170]
hbs
‑
ep工作缓冲液(10mm hepes,150mm nacl,3mm edta和0.005％(v/v) surfactant p20,ph7.4)；
[0171]
酶标仪(md公司)
[0172]
plp蛋白酶fret检测原理：
[0173]
plp蛋白酶的荧光底物根据plp蛋白酶底物切割的特异性(核心序列为 rlkggapikg)设计合成。edans和dabcyl为常用的荧光
‑
淬灭分子对，最适激发波长为340nm,
最适发射波长为490nm。dabcyl对edans的淬灭效率大于 95％，用荧光方法检测背景值很低。在未加plp蛋白酶时，两个荧光基团之间的距离很短，约10
‑
100a。在光激发状态下，edans的能力被dabcyl淬灭，该量子现象称为共振能量转移。经过蛋白酶特异性切割后，多肽底物断裂，荧光基团和淬灭基团分离，恢复其本身的全部荧光，所以一个低荧光的多肽底物经过酶切割后成为高荧光的物质，而且荧光强度的增加与多肽水解的程度呈线性相关。底物的氨基酸序列为krlkggapikge,赖氨酸k修饰dabcyl,谷氨酸e修饰 edans，修饰后多肽分子量：1253.5。
[0174]
化合物抑制冠状病毒plp蛋白酶的ic
50
测定：
[0175]
将化合物母液稀释，得到浓度依次为100mm、20mm、10mm、2mm、1mm、200um、100um、20um的化合物溶液，取各浓度化合物溶液1.2ul,分别与120ul 的2um plp蛋白酶充分混合(dmso的终浓度为0.5％)，在4℃孵育2小时。然后取各浓度样品100ul加到96孔板中，再分别加入100ul 20um的荧光底物溶液开始反应，此时plp蛋白酶的终浓度为1um,荧光底物的终浓度为10um，化合物的终浓度分别为500um、100um、50um、10um、5um、1um、0.5um、0.1um。以340nm波长的光激发，检测发射波长为488nm下的荧光值变化，反应连续测定1小时，完成化合物对冠状病毒plp蛋白酶抑制作用的测定。测定化合物ic50 值时设定空白对照，即不加化合物，但加相同浓度dmso的plp蛋白酶样品以及单独荧光底物溶液的样品。每个样品设复孔，测定值取平均。根据不同浓度化合物存在条件下，冠状病毒plp蛋白酶酶切荧光底物的反应速度，与未加化合物但加0.5％dmso的反应速度进行比较，计算得到各浓度下的抑制率(以含 0.5％dmso条件下的酶活性为100％，抑制率＝100％
‑
不同抑制剂浓度下的酶的相对活性x100％)。根据logistic公式用origin软件进行非线性拟合计算化合物对 plp蛋白酶活性抑制的ic
50
值。公式如下：
[0176][0177]
上述公式中，a0指加0.5％dmso时的酶活性，a(i)指不同化合物浓度下的酶活性，i指化合物的浓度，p指u因子。
[0178]
fret结果总结在下表中
[0179]
在25℃下雷公藤红素、扁塑藤素、去甲泽拉木醛抑制冠状病毒plp蛋白的 ic
50
值(如图25
‑
30所示)
[0180]
ic
50
2019 cov plpmers plp雷公藤红素147um212.4um扁塑藤素6580um867.1um去甲泽拉木醛11.5um25.59um
[0181]
实施例4核蛋白免疫荧光染色检测雷公藤红素、扁塑藤素、去甲泽拉木醛对冠状病毒oc43的抑制效果
[0182]
病毒的制备
[0183]
hcov
‑
oc43(oc43)菌株购自美国典型培养物保藏中心(人类冠状病毒oc43 (atcc，vr
‑
1558))，并通过rd细胞(atcc，ccl
‑
136)进行繁殖；在rd 细胞培养条件是dmem+2％fbs。感染后72小时(hpi)后，通过噬斑法测定病毒滴度(pfu/ml)。
[0184]
病毒感染实验化合物稀释在补充有2％fbs的dmem中，rd细胞在感染复数(moi＝0.1)下被感染oc43。在37℃孵育48小时的过程中，化合物和病毒与细胞保持在一起。通过针对核蛋白的免疫荧光染色评估rd细胞中oc43的感染效率。通常，rd细胞在48hpi时用100％甲醇固定，在37℃时用1％bsa/pbs封闭1h，并在1时用抗 oc43 np mab(sigma，mab 9012，克隆541
‑
8f)染色：1000在37℃下孵育1 小时，然后将二抗再孵育1小时。细胞核用hoechst 33342(thermo scientifich1399)在1：5000处染色15分钟。通过mshot荧光显微照片捕获图像。
[0185]
结果显示：0.411um浓度下，雷公藤红素，扁塑藤素可以抑制99％以上的oc43
‑
cov 病毒复制。1.234um浓度下，去甲泽拉木醛可以抑制99％以上的oc43
‑
cov病毒复制。(如图31
‑
33所示)
[0186]
实施例5
[0187]
化合物半数细胞毒性cc
50
的确证
[0188]
293
‑
ace2细胞接种到96孔板中，次日，细胞先分别加入0.137,0.4111.1.233,3.7, 11.1,33.3和100μm的化合物。药物对293
‑
ace2的细胞毒性用celltiter
‑
glo 2 活性检测来测量。
[0189]
结果显示：雷公藤红素，扁塑藤素和去甲泽拉木醛的cc
50
分别是3.358um， 13.55um和99.9um。(如图34
‑
36所示)
[0190]
上述实施例和实验例对本发明对本发明做了具体说明。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。