一种低温酶解提取马齿苋的方法

1.本发明涉及一种低温酶解提取马齿苋的方法，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.马齿苋(portulaca oleracea l.)是马齿苋科马齿苋属的一年生草本植物，属于重要的药食同源植物。除了野生马齿苋外，其在全世界范围内被广泛种植，自古就有将马齿苋作为野菜来食用。对于其药用价值，《本草纲目》等医书早有记载，马齿苋具有“散血消肿、利肠滑胎、解毒通淋、治产后虚汗”等功效。而现代医学发现，马齿苋具有抗细菌、抗球虫、抗氧化应激、抗炎和抗癌等众多生物学特性，目前在畜禽养殖、天然药物和许多化妆品中被广泛的开发使用，是非常值得关注的一类中草药。
3.马齿苋之所有具有重要的药物学作用，主要是其植株富含多糖、生物碱、有机酸、萜类和黄酮类等化合物成分，其中也含有褪黑素、去甲肾上腺素和多巴胺等激素类成分。除了整株食用外，目前对马齿苋有效成分的提取，最常见的是水煎或乙醇加热提取。虽然这两种方法操作比较简便，但是提取过程中温度要求太高，会严重破坏马齿苋有效成分；而且乙醇作为易燃化学品，其使用也受到一定的限制。现有技术中还通过微波或超声辅助提取马齿苋多糖和黄酮类化合物，虽然提取效率有所提高，但是提取过程中温度较高，会在一定程度上破坏有效成分，且使用设备不方便操作，产业化中成本较大。因此，建立一种简便易操作、提取过程中不含其它化学成分、能够最大程度保留活性成分的提取方法是亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种低温酶解提取马齿苋的方法，利用利用消化酶酶解和低温提取的方法，能够保护马齿苋有效成分不被破坏，实现高效提取，从而在使用时可以被充分吸收和利用，最大限度地发挥其药效作用。
5.本发明所提供的马齿苋的低温酶解提取方法，包括如下步骤：
6.s1、马齿苋经粉碎得到马齿苋粉末，将所述马齿苋粉末加入至胃蛋白酶水溶液中进行浸提ⅰ；
7.s2、所述浸提ⅰ结束后，加入胰蛋白酶进行浸提ⅱ；
8.s2、所述浸提ⅱ结束后，依次经过滤、离心，收集上清液，即得到马齿苋提取液。
9.上述的提取方法中，采用所述马齿苋地上部分的茎、叶和种子进行粉碎；
10.所述马齿苋粉末的粒度为80～150目。
11.上述的提取方法中，步骤s1中，所述胃蛋白酶水溶液采用生理盐水配制，如0.9％的生理盐水；
12.所述胃蛋白酶水溶液中，所述胃蛋白酶的浓度为1～1.2g/l；
13.采用盐酸(如0.1mol/l)调整所述胃蛋白酶水溶液的ph至1.5～2.0。
14.上述的提取方法中，步骤s1中，所述胃蛋白酶水溶液与所述马齿苋的配比为：10～
15ml：1g。
15.上述的提取方法中，步骤s1中，所述浸提ⅰ的条件为：
16.温度为37～38℃，时间为2～2.2h，水浴下进行，优选2h；
17.上述的提取方法中，步骤s2的反应体系中，所述胰蛋白酶的浓度为1～1.2g/l；
18.步骤s2中，加入所述胰蛋白酶后，采用氢氧化钠(如0.1mol/l)调整所述反应体系的ph至8.0～9.0；
19.步骤s2中，所述浸提ⅱ的条件为：
20.温度为37～38℃，时间为1～1.2h，水浴下进行，优选1h；
21.上述的提取方法中，步骤s3中，采用不锈钢筛过滤药渣，所述不锈钢筛的孔径为20μm；
22.所述离心的条件如下：
23.转速为4500～5500r/min，时间为10～20min；
24.所述提取方法还包括如下步骤：
25.采用0.2μm的孔径滤膜正压过滤所述马齿苋提取液。
26.本发明还提供了一种防治畜禽腹泻的饲料，其包括本发明马齿苋提取液，其质量添加浓度为1％～10％，优选1％～3％、1％或3％。
27.本发明方法制备的提取液保留了马齿苋的多种有效成分，能够作为饲料添加剂，用于防治畜禽腹泻，如可以很好的提高蛋鸡在夏季高温季节的粪便粘稠度，缓解其腹泻症状；不同浓度添加后均可以很好的改善羔羊的腹泻症状，1％的添加浓度就可以起到很好的治疗效果。因此可以将本发明马齿苋提取液添加至畜禽日粮中，代替青贮料，可以更快速高效的发挥作用。
28.本发明提供的低温酶解提取马齿苋有效成分的方法，可以保护马齿苋的有效活性成分，并且操作步骤简便，每一步操作时间容易控制，且无需高精尖设备，可以保障不同批次操作的稳定性，便于其在畜牧兽医临床中的应用。
附图说明
29.图1为本发明马齿苋低温酶解提取方法的流程图。
30.图2为本发明晒干的马齿苋植株和低温酶解提取后的浸提液。
31.图3为本发明马齿苋提取液对腹泻羔羊治愈率的统计结果。
32.图4为3％添加浓度的马齿苋提取液对腹泻羔羊治愈后空肠黏膜形态学观察结果。
具体实施方式
33.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
34.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.实施例1、低温酶解提取马齿苋有效成分的方法
36.马齿苋(portulaca oleracea l.)为秋季野外采收，采用其地上部分，包括茎、叶和种子，按照图1所示的流程进行提取：
37.1、于9～10月份野外采集马齿苋地上整株部分，包括茎、叶和种子，此时种子未完全成熟，不易脱落。
38.2、用清水清洗掉马齿苋表面的尘土，然后于背阴通风处晾干，避免阳光直射。
39.3、粉碎步骤：用电子天平准确称量100g马齿苋，采用不锈钢粉碎机，200转/分转速，将马齿苋植株研磨成粉末，粒度为100目。
40.4、提取溶剂1配制：称取9g氯化钠加入至1000ml蒸馏水中，充分溶解后作为生理盐水备用。称取1g胃蛋白酶(北京汇天东方有限公司)，加入至1000ml生理盐水中，室温溶解后，用0.1mol/l盐酸调整该溶液ph为1.5左右。
41.5、均浆步骤：将研磨好的100g马齿苋粉末加入至提取溶液1中，采用玻璃棒沿同一方向缓慢搅动，使马齿苋粉末充分混匀呈悬浮状态。
42.6、低温提取步骤：将上述混合后的马齿苋提取溶液1，转入有瓶盖的密封玻璃瓶中。然后将玻璃瓶置于37℃水浴中作用2h。
43.7、提取溶液2配制：将作用2h后的玻璃瓶取出，立即称取1g胰蛋白酶(北京汇天东方有限公司)加入至玻璃瓶中，采用玻璃棒沿同一方向缓慢搅动，用0.1mol/l氢氧化钠调整ph为8.5。
44.8、密封后，将玻璃瓶置于37℃水浴中继续作用1h。
45.9、过滤步骤：将低温提取后的马齿苋溶液，经过普通20μm的不锈钢筛过滤后，收集滤液，弃掉药渣。
46.10、离心步骤：将收集的滤液分装至50ml离心管中，经低速离心机5000r/min离心15min，收集上清液。
47.11、除菌步骤：用注射器吸取收集的上清液，经0.2μm滤膜(北京汇天东方有限公司)过滤除菌。
48.晒干后的马齿苋植株以及经本实施例低温酶解提取后的浸提液的照片如图2所示，可以看出晒干后的马齿苋，可以完好地保留整颗植株。经低温酶解提取后，其提取液呈现墨绿色，表明干燥过程中马齿苋植株中的水分挥发，但叶绿素等成分并未遭到破坏，而且本发明提取方法可以很好地释放马齿苋各组成成分。
49.本实施例中，在胃蛋白酶下酶解2h，在胰蛋白酶下酶解1h，如果缩短酶解时间，则马齿苋的有效成分提取不完全，而延长酶解时间时，则有效成分虽然不会受到破坏，但含量不会继续增加。
50.实施例2、低温酶解提取马齿苋有效成分的应用
51.1、产蛋鸡中的应用。
52.选取同批次日龄的产蛋鸡200只，随机分为对照组和马齿苋给药组，每组100只。
53.选用500ml喷壶，按0.2％(1ml实施例1制备的马齿苋提取液：500ml饮用水混合)的浓度，配置马齿苋工作液。混匀后，将马齿苋提取物以喷雾的方式，喷洒至料槽中，与常规日粮进行搅拌。于每天早上投料后，喷洒马齿苋工作液，保证母鸡自由采食，每天仅给药1次，连续给药30天。
54.给药后每天观察产蛋鸡的粪便形态，以此反应产蛋鸡群的腹泻率，结果统计见表1。
55.表1马齿苋提取液对发生腹泻蛋鸡的治疗结果统计
[0056][0057]
由表1的结果可以看出，本发明制备的马齿苋提取液能够很好的提高蛋鸡在夏季高温季节的粪便粘稠度，缓解其腹泻症状。
[0058]
2.2哺乳期羔羊的应用。
[0059]
选取临床上已经发生腹泻的哺乳期羔羊50例作为治疗对象，随机分为5组，每组10例。
[0060]
将实施例1制备的马齿苋提取液，与饮用水分别按0.1％、1％、3％、5％和10％的体积浓度配制工作液。羔羊经人工保定后，利用无针头的注射器经口服给药，每只羔羊给药1ml，每天2次，连续治疗1周。
[0061]
治疗1周后，观察和统计羔羊的腹泻治愈率，结果如图3所示，可以看出，本发明提取的马齿苋提取液，不同浓度添加后均可以很好的改善羔羊的腹泻症状，其腹泻发生率明显下降，1％的添加浓度就可以起到很好的治疗效果。
[0062]
3％添加浓度的马齿苋提取液对腹泻羔羊治愈后空肠黏膜形态学观察结果如图4所示，可以看出，本发明马齿苋提取液对肠道黏膜起到很好的保护作用，可以缓解肠道炎症反应和黏膜上皮细胞脱落。