人参皂苷Ro在制备Toll样受体4抑制剂上的应用

人参皂苷ro在制备toll样受体4抑制剂上的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种人参皂苷ro在制备toll样受体4抑制剂上的应用。


背景技术：

2.炎症是一种先天性免疫反应，由一系列复杂的生物过程组成，可保护人体免受外部病原体的感染和细胞损伤。炎症的特征在于巨噬细胞的活化，促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(tnf)
‑
α，白介素(il)
‑
6，il
‑
1β，干扰素
‑
γ，一氧化氮和前列腺素的合成和释放增多。先前研究表明，系统性炎症增加了慢性疾病的风险，例如自身免疫性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、肥胖症、中枢胰岛素抵抗和癌症等。
3.toll样受体4(tlr4)蛋白是一种模式识别受体，并在脂多糖(lipopolysaccharide，lps)(革兰氏阴性细菌外壁的组成部分)的识别和信号启动中充当关键受体，能够在先天免疫应答的启动中起关键作用并调节炎症细胞因子的表达。tlr4活化导致髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,myd88)的激活，进而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,mapks)和核因子κb(nuclear factor
‑
κb,nfκb)信号通路，导致炎症基因及炎症介质的表达。仅需少量的lps即可启动tlr4信号通路，从而激活免疫系统以抵抗病原体的入侵。但是，过度刺激该途径会导致严重的炎症，例如急性呼吸窘迫综合征(ards)和急性肺损伤(ali)，其发病率和死亡率在世界范围内都很高。因此，筛选抑制tlr4活化以治疗炎症相关性疾病的天然药物引起了极大的兴趣。
4.人参皂苷ro是一种齐墩果酸型人参皂苷，在水中有较大的溶解度，主要分布在五加科植物人参、西洋参、三七等植物中，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗血小板聚集、抗肿瘤作用。基于其天然、安全的特性，目前，人参皂苷ro被广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品。但关于人参皂苷ro对toll样受体4(tlr4)的调控未见相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种人参皂苷ro在制备toll样受体4抑制剂上的应用，以解决上述现有技术存在的问题，能有效防治tlr4通路紊乱引起的，特别是响应于tlr4相关的病症，防治炎症相关性疾病。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种人参皂苷ro在制备tlr4抑制剂中的应用。
8.进一步地，所述人参皂苷ro通过抑制tlr4及其下游信号分子mapks/nfκb表达，用于tlr4通路紊乱引起的疾病。
9.进一步地，所述tlr4通路紊乱引起的疾病包括：自身免疫性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、肥胖症、中枢胰岛素抵抗和癌症。
10.本发明还提供一种预防和/或治疗tlr4通路紊乱引起的疾病的复方制剂，包括人
参皂苷ro和药学上可接受的药用辅料。
11.进一步地，所述药用辅料包括药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂中的一种或多种。
12.进一步地，所述复方制剂的剂型选自以下任一种：颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、口服液、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、搽剂、膏剂、乳剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、栓剂、丸剂、微球制剂或酊剂。
13.进一步地，所述tlr4通路紊乱引起的疾病包括：自身免疫性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、肥胖症、中枢胰岛素抵抗和癌症。
14.本发明还提供一种人参皂苷ro在制备预防急性肺损伤的药物中的应用。
15.本发明公开了以下技术效果：
16.本发明提供人参皂苷ro在制备toll样受体4(tlr4)抑制剂上的应用，通过实验证实其在小鼠巨噬细胞系(raw264.7)中具有抑制tlr4及其下游信号分子mapks/nfκb表达的作用，基于其天然、安全的特性，人参皂苷ro为因tlr4通路紊乱引起的疾病治疗提供了可能，特别是响应于tlr4相关的病症的药物中的应用。例如，所述的人参皂苷ro可以作为单一剂型、或与其他药物合用构成组合物，以达到预防急性呼吸窘迫综合症(ards)、急性肺损伤(ali)、慢性阻塞性肺病(copd)、慢性支气管炎、肺气肿等肺部疾病的目的。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为人参皂苷ro对tlr4抑制作用的分子对接图；
19.图2为人参皂苷ro与tlr4的体外结合亲和力的表面等离子共振成像图；
20.图3为人参皂苷ro对alexa fluor 488conjugated lps结合细胞膜的影响；
21.图4为人参皂苷ro显著抑制小鼠巨噬细胞raw264.7细胞tlr4及其下游mapks(jnk、erk、p38)、nfκb的磷酸化水平(其中：*与lps相比，p＜0.05，有统计学差异；**与lps相比，p＜0.01，有统计学差异)；
22.图5为小鼠肺组织的he染色。
具体实施方式
23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
26.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
27.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
28.本发明涉及的人参皂苷ro分子式为c
48
h
76
o
19
，分子量为957.11，结构式如下所示：
[0029][0030]
实施例1分子模拟虚拟筛选
[0031]
使用sybyl
‑
x2.1软件对人参皂苷ro与tlr4之间的相互结合进行模拟生成最优构象。分子动力学软件yasara用于执行md模拟，结果显示，图1a和图1b分别显示了tlr4
‑
md2
‑
lps复合物和tlr4
‑
md2
‑
gro复合物的三维构象。tlr4/md2和gro之间的结合能为
‑
9.285kcal/mol。此外，图1c显示了在0ns和100ns处tlr4
‑
md2
‑
gro复合物的表面可视化模型,在md模拟的整个过程中，gro紧密绑定到tlr4/md2绑定位点中心。此外，图1d为d2
‑
gro结合部分(下面)和未结合部分(上面)的均方根偏差(rmsd)，如图所示，d2
‑
gro结合部分的rmsd稳定在左右。这些均提示人参皂苷ro与tlr4之间具有较强的结合能力。
[0032]
实施例2表面等离子体共振成像(spri)分子互作实验分析人参皂苷ro与tlr4之间的体外结合能力
[0033]
选择3d dextran芯片(plexera bioscience,北京)进行点样固定。具体操作流程如下：
[0034]
(1)分别盛放0.765g edc(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)及0.115g nhs(n
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺)于两支50ml专用离心管中，随后向离心管中各加入10ml双蒸水使其充分溶解混匀，使用时将两种溶液倒入方形盒中，使溶液没过需要活化芯片的表面，接着置于摇床上反应15min。
[0035]
(2)tlr4/md2蛋白(r&d systems，minneapolis，mn，usa)点样，根据生物点样仪的操作流程将芯片放置于点样仪上设置好程序后即可进行点样操作，将点样完成的芯片贴上cover的同时，标记好芯片编号后，放置于生化试剂盒内(湿度应大于50％)，4℃冰箱孵育过夜。
[0036]
(3)在spr仪器上装载孵育完成的芯片，准备流通小分子化合物。
[0037]
(4)将母液浓度为100mm的人参皂苷ro用pbs分别配制成浓度为50μm，100μm，100μm的，体积为各1ml的不同浓度梯度的流通相。
[0038]
(5)将固定好靶标蛋白tlr4样品的芯片，不同浓度梯度人参皂苷ro的流通样品及缓冲液、重生液在plexarray ht a100生物分子相互作用仪上加载安放好后，参照《plexarray ht高通量分子间相互作用筛选系统使用sop》操作流程，进行生物分子间相互作用实验。
[0039]
由tlr4和人参皂苷ro结合和解离过程可见，不同浓度人参皂苷ro可以跟tlr4蛋白迅速结合，如图2所示(图2x轴显示时间，y轴显示标准的折射率(refractive units,ru)的变化)。人参皂苷ro与tlr4间相互作用的动力学参数，k
d
＝5.62
×
10
‑8(m)。分子间结合能力的大小由kd值表示，kd越小，表明结合力或亲和力越大。由kd值可看出，tlr4与人参皂苷ro具有强的亲和力。
[0040]
实施例3lps binding染色实验
[0041]
将细胞培养在15μm的共聚焦培养皿中，放于37℃培养箱中培养，分为4组：模型组，人参皂苷ro低、中、高剂量组，人参皂苷ro给药24小时后，加入10μg/ml的alexa fluor 488conjugated lps染色剂，刺激12h。12h后用pbs避光室温清洗3次，每次5min，再滴入100μl 10μg/ml dapi染液，室温避光孵育10min。接着继续用pbs避光室温清洗3次，每次5min。使用倒置激光共聚焦显微镜观察。
[0042]
结果：如图3所示，与模型组相比，人参皂苷ro能够浓度依赖性抑制lps与raw264.7细胞膜结合的作用。
[0043]
实施例4人参皂苷ro显著抑制小鼠巨噬细胞raw264.7细胞tlr4及其下游mapks、nfκb的磷酸化水平
[0044]
1.材料和方法
[0045]
1.1实验原料
[0046]
人参皂苷ro购自成都曼思特生物科技有限公司，溶于无菌二甲基亚砜dmso中，配置成所需浓度。
[0047]
1.2细胞株
[0048]
小鼠腹腔单核巨噬细胞系(raw264.7)，由中国科学院上海生命科学院细胞库提供。培养条件：含10％fbs(gibco)的dmem高糖型培养基(gibco公司)，37℃、5％co2饱和湿度培养箱。
[0049]
1.3western blot
[0050]
用含有pmsf(碧云天生物技术有限公司)和磷酸酶抑制剂(碧云天生物技术有限公司)的ripa裂解液(碧云天生物技术研究所)裂解细胞或组织后，提取总蛋白。细胞蛋白取15ug，经10％sds
‑
page凝胶电泳后，转移至pvdf膜，该膜与特异性抗体4℃孵育过夜。洗涤3遍，与过氧化物酶标记的二抗(anti
‑
rabbit igg 1:2000浓度)稀释，室温孵育1小时后，洗涤3遍，浸泡于hrp
‑
ecl化学发光液(美国millipore公司，将a液、b液以1：1比例充分混匀)后放入曝光仪中拍摄成像。
[0051]
所用一抗如下：
[0052]
rabbit anti
‑
tlr4 antibody(1:1000浓度稀释；美国abcam公司)；
[0053]
mouse anti
‑
p
‑
ikbαantibody(1:1000浓度稀释；美国cell signaling公司)；
[0054]
rabbit anti
‑
p
‑
p65,p65,p
‑
jnk,jnk,p
‑
p38,p38,p
‑
erk,erk(1:1000浓度稀释；美国cell signaling公司)；
[0055]
rabbit anti
‑
gapdh antibody(1:3000浓度稀释；美国affinity公司)。
[0056]
1.4image j图像分析软件分析
[0057]
用image j图像分析软件对曝光后条带的灰度值进行分析，计算tlr4,p
‑
ikbα,p
‑
p65,p
‑
jnk,p
‑
p38,p
‑
erk分别与相应的总蛋白的灰度值比。
[0058]
1.5统计分析
[0059]
采用spss 22.0统计软件进行分析，结果均采用以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示。多组间比较使用one
‑
way anova，方差齐时采用lsd法，方差不齐时采用welch稳健估计，再用tamhane t3法两两比较，以p＜0.05认为有统计学意义。
[0060]
结果提示如图4a、图4b和图4c所示，与lps对照组比，人参皂苷ro能浓度依赖性地抑制tlr4及其下游mapks、nfκb的磷酸化水平，而不会改变mapks、nfκb的总蛋白水平(p＜0.05)。
[0061]
实施例5人参皂苷ro体内预防急性肺损伤的作用
[0062]
方法：选用5～6周龄的雄性c57bl/6小鼠(清洁级)，每只小鼠体重在18
‑
22g，在实验前安排大约1周适应饲养环境。饲养条件：室温(22
±
1)℃，湿度(50
±
10)％，每天定时换气，12h光暗照明，食物、饮用水不限。将50只小鼠随机分为对照组、模型组、人参皂苷ro低、中、高剂量组，每组10只。在造模前5天灌胃给药，低剂量组给予50mg/kg人参皂苷ro溶液，中剂量组给予100mg/kg人参皂苷ro溶液，高剂量组给予200mg/kg人参皂苷ro溶液，对照组和模型组给予等量生理盐水，每天每只0.2ml，连续灌胃给药5天。并称取10mg的lps溶解于10ml生理盐水，调整lps浓度为1mg/ml，取模型组、人参皂苷ro低、中、高剂量组小鼠实施腹腔注射制备急性肺损伤模型，每只小鼠注射200μl lps溶液(10mg/kg)，对照组注射200μl等量的生理盐水，lps腹腔注射后12h脱颈椎处死，取肺脏做he染色。将解剖后取小鼠的肺组织放置于4％多聚甲醛固定48h后，蒸馏水清洗，脱水、透明后4μm切片，脱蜡、复水后he染色，在200倍光镜下观察小鼠肺组织病理变化。
[0063]
结果：如图5所示，对照组小鼠肺泡结构完好，肺泡间隔纤细，组织结构完整，未见炎性细胞浸润。lps组镜下可见大量炎性细胞浸润，肺泡壁明显增厚，肺泡间质充血、出血。与lps组相比，人参皂苷ro预处理后能有效缓解肺组织炎性细胞浸润，肺组织趋于正常。
[0064]
上述实验证明：人参皂苷ro能显著地抑制toll样受体4(tlr4)的表达，进而抑制mapks及nfκb的磷酸化水平，是潜在的tlr4抑制剂。
[0065]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。