金线莲苷用于制备放射性肝纤维化药物的应用

1.本发明属于医药技术领域，涉及治疗肝脏疾病的药物，更具体地，具体涉及治疗放射性肝纤维化的药物，即金线莲苷用于制备放射性肝纤维化药物的应用。


背景技术：

2.放射治疗是包括肝细胞癌、胃癌和恶性淋巴瘤等在内的腹部恶性肿瘤的重要治疗方法之一。然而，由于放射治疗所导致的正常组织的放射性损伤往往会制约射线剂量以及放疗疗效，而且放射治疗伴随而来的器官迟发性损伤，例如放射性肝纤维化(radiation
‑
induced liver fibrosis rilf)，时常不可避免甚至在某些情况下是致死性的。与其他肝纤维化不同，放射性肝纤维化的发生与肝脏肿瘤的放射治疗息息相关。肝癌是放射敏感肿瘤，肝脏放疗是越来越多肿瘤患者的重要治疗途径，而放射性肝损伤是继发于肝脏放疗后并发的最严重、制约剂量递增的致死性并发症。因此，放射性肝纤维化的防治是对肝脏肿瘤放射治疗研究至关重要的一环。
3.放射性肝损伤在临床上一般划分为两个阶段：亚急性放射性肝病阶段和晚期的放射性肝纤维化，前者通常在放射治疗完成后4到8周内发生，而晚期放射性肝纤维化一般发生在放疗后三个月以上，其组织学特征主要包括肝脏实质细胞损耗，肝小叶结构破坏以及纤维结缔组织增生。目前随着肝癌治疗方式的改善，长期生存患者的数量也随之增加，因此，减轻治疗辐射导致的晚期肝脏纤维化成为放射生物学研究的主要方向之一。
4.金线莲(anoectochilus roxburghii)是一种中国传统中草药植物，它具有多种药理作用，包括抗肥胖，抗高血糖，抗骨质疏松等，其中护肝作用尤为显著。金线莲苷(kinsenoside(3
‑
(r)
‑3‑
β
‑
d
‑
glucopyranosyloxybutanolide)是从金线莲中提取分离出的生物活性化合物，据文献研究表明，金线莲苷具有降血糖以及抗高脂血症作用，并且对急性炎症反应具有减轻作用。此外，金线莲苷对四氯化碳处理过的小鼠以及患有肝脏疾病的病人样本都显示出良好的肝脏保护作用。目前尚无金线莲苷与放射性肝纤维化相关联的研究。建立与人类疾病相类似的动物模型非常重要，本实验建立了大鼠放射性肝纤维化的动物模型，模拟临床实际放疗，采用单剂量照射制备模型，且照射后24周进行纤维化相关检测，符合临床实际情况。因此基于以上已有的研究结果，本发明旨在探究金线莲苷干预放射性肝纤维化的作用。


技术实现要素：

5.本发明解决了现有技术中放射性肝纤维化药物治疗效果不佳的技术问题，本发明旨在提供一种干预放射性肝纤维化的药物，通过构建放射性肝纤维化大鼠模型，首次证明了金线莲苷能够治疗大鼠放射性肝纤维化，为临床防治放射性肝纤维化提供了候选药物。
6.根据本发明的目的，提供了金线莲苷用于制备能抑制结缔组织生长因子进而干预放射性肝纤维化药物中的应用。
7.优选地，所述放射性肝纤维化为辐照诱导的肝纤维化。
8.优选地，所述药物能够抑制肝星状细胞的激活。
9.优选地，所述药物能够抑制辐照后激活的转化生长因子β1、肝星状细胞激活标志蛋白smad和结缔组织生长因子ctgf信号通路。
10.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
11.(1)本发明通过构建放射性肝纤维化大鼠模型，首次证明了金线莲苷能够治疗大鼠放射性肝纤维化，为临床防治放射性肝纤维化提供了候选药物。
12.(2)本发明中金线莲苷作为金线莲的植物提取物在放射性肝纤维化过程中具有减轻纤维化程度的作用，为临床使用包括金线莲苷在内的植物提取物奠定了基础。
13.(3)本发明中金线莲苷干预放射性肝纤维化能够通过介导转化生长因子β1(tgf
‑
β1)/肝星状细胞激活标志蛋白smad/结缔组织生长因子(ctgf)通路，实现对促纤维化蛋白ctgf的调控，进而抑制放射性肝纤维化，表明tgf
‑
β1/smad/ctgf通路在放射性肝纤维化过程中具有重要作用，为防治放射性肝纤维化提供了可能的作用靶点。
附图说明
14.图1是放射线照射(ir)，kd以及ir和kd联用对肝脏指数的影响，在对照组(con)，ir(30gy)，kd(20mg/kg)，以及ir+kd中，可发现kd能明显降低ir造成的肝脏指数上升。
15.图2是肝脏外观，he染色及masson染色。在对照组(con)，ir(30gy)，kd(20mg/kg)，以及ir+kd中，kd可减少ir造成的肝脏损伤，显著减轻放射性肝纤维化。
16.图3是肝脏组织纤维化metavir评分与肝脏羟脯氨酸含量测定；其中a为肝脏metavir纤维化评分结果显示照射后金线莲苷给药能够改善辐射导致的肝脏组织纤维化；b为照射后金线莲苷给药组肝脏羟脯氨酸含量较单纯照射组明显下降。
17.图4是大鼠肝脏组织α
‑
sma免疫组化，α
‑
sma的表达量高低是肝星状细胞激活的重要标志，也是判断肝纤维化程度的重要指标之一。照射后加金线莲苷给药组(ir+kd)的表达量相较于单纯照射组则显著降低。图4中的a为α
‑
sma免疫组化染色结果，显示照射后金线莲苷给药能够显著减少染色呈棕色的α
‑
sma蛋白的表达。放大倍数分别为40
×
和200
×
。图4中的b为组化评分结果，表明照射后金线莲苷给药组α
‑
sma的表达量较单纯照射组明显下降。n＝5，***p<0.001，****p<0.0001。图4中的c为组织蛋白的免疫印迹结果。照射后金线莲苷给药组的纤连蛋白fn以及α
‑
sma表达量均较单纯照射组显著减少。
18.图5是肿瘤大体观和肿瘤体积时间生长曲线；其中a为肿瘤大体观显示单纯照射组以及照射后金线莲苷给药组的肿瘤大小相对于对照组均显著减小；b为肿瘤体积
‑
时间生长曲线显示单纯照射组和照射后金线莲苷给药组的肿瘤体积较对照组均增长缓慢，且两者之间的肿瘤体积没有差异。
19.图6是肿瘤重量和裸鼠体重测定结果；其中a为肿瘤重量结果显示单纯照射组及照射后金线莲苷给药组的肿瘤重量相比于对照组均显著降低，但两照射组之间的肿瘤重量未见差异；b为裸鼠体重测定结果显示单纯照射组和照射后金线莲苷给药组之间未见差异。
20.图7是金线莲苷抑制照射后α
‑
sma mrna和蛋白的表达情况。a为照射后金线莲苷给药与单纯照射组相比α
‑
sma mrna表达量显著降低。b为α
‑
sma蛋白的表达和定位情况。
21.图8为金线莲苷改善放射性肝纤维化的重要靶基因检测。a为转录组高通量测序的
差异基因热图显示ctgf基因在射线照射后高表达，在照射后金线莲苷给药后低表达。b为real
‑
time pcr显示照射后金线莲苷给药组相对于单纯照射组ctgf mrna表达降低。c为蛋白免疫印迹表明照射后金线莲苷给药组的ctgf蛋白表达量较单纯照射组减少。*p<0.05。
22.图9为金线莲苷抑制照射后激活的tgf
‑
β1/smad/ctgf通路。a为外源性tgf
‑
β1促进肝星状细胞纤维化相关蛋白ctgf、胶原蛋白及α
‑
sma、、表达。b为肝星状细胞上清中活化型tgf
‑
β1含量的测定结果。6gy照射后肝星状细胞分泌活化型tgf
‑
β1较对照组明显增多，照射后金线莲苷给药组相对于单纯照射组分泌活化型tgf
‑
β1减少。c为tgf
‑
β1及其下游smad通路蛋白的表达结果。照射后金线莲苷给药组与单纯照射组相比，tgf
‑
β1及其下游总smad2/3和磷酸化smad2/3表达均降低。
具体实施方式
23.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
24.本发明中的金线莲苷的结构式如式1所示：
[0025][0026]
金线莲苷是传统中草药植物金线莲的一种提取物，具有多种药理作用，其中护肝效果尤为显著,已有研究表明金线莲苷对自身免疫性肝炎具有改善作用，此外对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤也显示出肝脏保护活性。本发明人研究表明金线莲苷在动物水平对于辐射诱导的肝纤维化具有良好的干预作用，为解决放射性肝纤维化的临床防治问题提供了理论依据。此外，放射治疗的主要目的是治疗恶性肿瘤，因此寻求防治放射性肝纤维化的方案时，必须确保是在不影响肿瘤放疗疗效的前提下，而放疗后金线莲苷不会对肿瘤放疗疗效产生不良影响。
[0027]
本发明人采用大鼠建立了放射性肝纤维化动物模型，发现金线莲苷对于放射性肝纤维化具有显著改善作用，表明采用金线莲苷干预放射性肝纤维化具有一定依据。
[0028]
本发明通过肝星状细胞照射及金线莲苷药物处理，证实了金线莲苷抑制肝星状细胞的激活及增殖，减少纤维化关键蛋白表达，并通过细胞水平转录组高通量测序筛选出了金线莲苷干预作用的重要靶基因ctgf，表明金线莲苷通过抑制ctgf的表达进而改善放射性肝纤维化。
[0029]
最后，通过信号通路富集筛选ctgf上游通路，并采用肝脏组织免疫组化验证后考虑tgf
‑
β1及其下游通路在金线莲苷干预放射性肝纤维化的机制中起到重要作用。随后本发
明人采用外源性tgf
‑
β1刺激肝星状细胞，随着浓度梯度增加，ctgf、胶原蛋白及α
‑
sma蛋白表达量均呈现梯度增加，且6gy照射后肝星状细胞分泌活化型tgf
‑
β1明显增多，而照射后金线莲苷给药组相对于单纯照射组分泌活化型tgf
‑
β1减少，表明活化型tgf
‑
β1浓度增高导致肝星状细胞激活并表达胶原增加，产生促纤维化作用，而金线莲苷则减少照射后活化型tgf
‑
β1分泌。本发明人进一步通过蛋白免疫印迹分析细胞照射及给药后tgf
‑
β1及其下游通路的改变，发现金线莲苷能够抑制肝星状细胞照射后被激活的tgf
‑
β1/smad/ctgf通路，从而抑制肝纤维化。本发明人首次发现金线莲苷能够通过tgf
‑
β1/smad/ctgf通路显著改善由辐射诱导的放射性肝纤维化，为临床防治放射性肝纤维化提供了新的方向和思路。
[0030]
本发明采用转录组高通量测序后筛选出关键靶基因结缔组织生长因子(ctgf)，并验证了ctgf在射线照射后明显增加，在放疗后金线莲苷给药组则显著减少。ctgf是一种在肝纤维化组织中常见上调的基质细胞蛋白，在肝纤维化中起关键作用，被称为肝纤维化的“主要开关”。肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞等多种细胞在纤维化肝脏中表达和分泌ctgf蛋白。本发明也通过转录组测序筛选及real
‑
time pcr和蛋白免疫印迹法发现了金线莲苷能抑制ctgf的产生进而干预放射性肝纤维化，同样表明了ctgf在纤维化相关疾病中的重要作用。
[0031]
实施例1：金线莲苷干预放射性肝纤维化的动物水平研究。
[0032]
金线莲苷粉末由华中科技大学同济医学院药学院提供。将sprague
‑
dawley大鼠随机分成4组，正常对照组、单纯给药组、单纯照射组以及照射后金线莲苷给药组。给予照射组30gy单次右侧部分肝脏照射，给药组每日金线莲苷溶液灌胃一次(20mg/kg)，共给药8周。在照射24周后通过he染色、masson染色、纤维化评分、胶原蛋白免疫荧光检测、羟脯氨酸含量测定、α
‑
sma免疫组化及组织蛋白免疫印迹法(western blot)等方法比较肝脏纤维化程度。此外，为裸鼠接种肝癌细胞后随机分成同上4组，评估金线莲苷是否对肿瘤放疗疗效产生影响。结果显示，照射24周后大鼠肝脏组织纤维化评分(图1)、he和masson染色(图2)均显示照射后给药能够改善放射性肝纤维化(p<0.01)。此外，照射后给药组与单纯照射组相比，组织胶原蛋白表达减少、羟脯氨酸含量降低(p<0.01)(图3)、α
‑
sma免疫组化评分降低(p<0.001)(图4中的a
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b)，组织蛋白免疫印迹结果显示，照射后金线莲苷给药组的纤连蛋白fn以及α
‑
sma表达量均较单纯照射组显著减少(图4中的c)。此外，裸鼠模型照射后给药与照射组的肿瘤体积
‑
时间曲线、肿瘤大小、肿瘤重量等均未见差异(图5，图6)，表明金线莲苷在改善肝纤维化的同时，对肝癌细胞的放射治疗疗效无不良影响。
[0033]
实施例2：金线莲苷干预放射性肝纤维化的细胞水平研究。
[0034]
将hsc分为正常对照组、单纯给药组、单纯照射组和照射后金线莲苷给药组，以6gy射线处理照射组。α
‑
sma是肝星状细胞激活的指标，即表明射线照射导致肝星状细胞在转录水平被激活，而照射后金线莲苷给药则抑制该基因激活，与单纯照射组相比α
‑
sma mrna表达量下降且两者差异具有统计学意义(p<0.01)(图7中的a)。蛋白免疫荧光结果显示，与单纯照射组相比，照射后金线莲苷给药组的α
‑
sma蛋白表达量显著减少(图7中的b)。采用转录组高通量测序、差异基因筛选以及聚类图分析，发现金线莲苷干预放射性肝纤维化的关键靶基因是结缔组织生长因子(ctgf)基因，real
‑
time pcr表明与单纯照射组相比，照射后给药组的ctgf基因表达降低(p<0.05)，western blot表明照射后给药组的ctgf蛋白表达减少(图8)。ctgf是tgf
‑
β下游重要的促纤维化介质，是活化后成纤维细胞的标志蛋白，在多种纤
维化模型中均起到关键作用，由此我们考虑ctgf基因是金线莲苷改善放射性纤维化的重要靶基因。
[0035]
实施例3：金线莲苷通过tgf
‑
β1/smad/ctgf通路干预放射性肝纤维化。
[0036]
tgf
‑
β1是产生纤维化的关键性驱动因子，它能通过多种信号通路以及多种细胞相互作用最终诱导纤维化，ctgf作为一种促纤维化基质细胞蛋白，位于其下游，是导致细胞外基质堆积的最终环节。采用外源性转化生长因子
‑
β1(tgf
‑
β1)处理hsc细胞并检测纤维化关键蛋白的表达情况。采用酶联免疫吸附试验(elisa)法检测hsc上清中活化型tgf
‑
β1含量。采用蛋白免疫印迹分析细胞照射后tgf
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β1及其下游通路蛋白的表达情况。结果显示，外源性tgf
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β1诱导hsc产生ctgf，同时α
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sma及胶原蛋白表达均增多(图9中的a)。6gy照射后肝星状细胞分泌活化型tgf
‑
β1较对照组明显增多，照射后金线莲苷给药组相对于单纯照射组分泌活化型tgf
‑
β1减少。*p<0.05，****p<0.0001(图9中的b)。金线莲苷降低照射后tgf
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β1蛋白的表达。hsc上清中活化型tgf
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β1含量在照射后金线莲苷处理后减少(p<0.05)。免疫印迹结果显示，照射后tgf
‑
β1、磷酸化smad2/3和smad2/3蛋白表达均增加，金线莲苷给药后表达均减少(图9中的c)。综合上一步采用外源性tgf
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β1刺激肝星状细胞后，ctgf蛋白表达量增加的结果，即表明金线莲苷能够抑制肝星状细胞照射后被激活的tgf
‑
β1/smad/ctgf通路，从而抑制放射性肝纤维化。
[0037]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。