一种具有纤溶活性昆虫提取液、制备方法及应用与流程

1.本发明属于天然提取物技术领域，尤其涉及一种具有纤溶活性昆虫提取液、 制备方法及应用。


背景技术：

2.目前，纤溶活性蛋白是一种非常重要的碱性类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶，其 拥有较好的纤溶活性，广泛存在于微生物、昆虫和动物中。经过几十年的研究， 在许多微生物、昆虫和动物中分离纯化得到纤溶活性蛋白酶。某些纤溶蛋白酶 已开发成为临床治疗血栓的重要药物，而且纤溶蛋白酶对抗肿瘤的新药开发也 在不断进行中。
3.正常生理状况下，血管受损后，会在损伤部位形成血栓，而当伤口愈合后， 形成的血栓又会被逐渐溶解。参与纤维蛋白降解或血栓溶解的是纤溶系统，它 与凝血系统相互拮抗，以防止血栓形成和保持血流畅通。人体对纤维蛋白的裂 解主要依靠纤溶酶。纤溶酶可以裂解单个的裂解纤维蛋白，也可以裂解网状的 纤维蛋白。自然界存在大量具有抗凝、溶栓效应的活性物质。从作用机理上纤 溶活性蛋白酶大体上可以分成两类：一类是纤溶酶原激活剂，如尿激酶、葡激 酶，其作用原理是纤溶酶原激活剂能将纤溶酶原激活为纤溶酶，而具有丝氨酸 蛋白酶活性的纤溶酶则能降解构成血栓骨架的纤维蛋白，从而引起溶栓的作用； 另一类是纤溶酶类物质，其作用不需通过激活纤溶酶原，直接降解血块中的纤 维蛋白。例如，溶栓药物链激酶先与纤溶酶原结合，形成sk-纤溶酶原复合物， 这复合物才具有酶催化的活性，使游离的纤溶酶原转变成纤溶酶，最后纤溶酶 溶解纤维蛋白。但是由于缺乏特异性，可导致广泛的纤溶系统激活，导致抗纤 溶酶缺乏，产生游离的纤溶酶，甚至导致严重出血现象。目前人们正在开发具 有提高纤维蛋白特异性和溶栓效率，减少颅内出血的危险的新型纤溶蛋白。
4.美洲大蠊，学名periplaneta americana(l.)俗名蟑螂、石姜、滑虫、偷油 婆、茶婆子，为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属。含有蛋白质、氨基酸、 肽类、糖类等多种有效成分，具有活血化瘀、解毒消疳、利水消肿等功效。《神 农本草经》记载，谓“味咸，寒。主血瘀、症坚、寒热，破积聚，喉咽痹，内 寒，无子”，用以治疗小儿疳积、疔疮、痈肿、喉蛾、无名肿毒、梅毒以及毒 蛇、蜈蚣咬伤等疾病。药用昆虫蚁狮(antlion)，属于脉翅目蚁岭科，又名称 为沙牛、沙王八、土牛、老倒等。成虫名为蚁岭，属脉翅目中分布最多、最广 泛的一种。蚁狮被视为一种名贵的中药材料。其功能主要有祛瘀消肿、平肝解 热、通便散结等，主治癫痫、脉管炎、便秘、结石等疑难杂症外用可医治中耳 炎等，并且蚁狮作为粉末状用处时，对于刀伤有很好的疗效。但是，现有技术 中关于从美洲大蠊和蚁狮中制备提取液的方法还尚未见报道。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于从美洲大 蠊和蚁狮中共同制备提取液的方法还尚未见报道。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：如何选择有效的配比，取得最佳的纤溶活 性和抑制人结肠癌细胞增殖。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：为从美洲大蠊和蚁狮中共同制备抗血栓活 性提取液提供理论支撑和推动了活性提取液的实际应用。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有纤溶活性昆虫提取液、 制备方法及应用。
9.本发明是这样实现的，一种具有纤溶活性昆虫提取液的制备方法，所述具 有纤溶活性昆虫提取液的制备方法包括以下步骤：
10.步骤一，将美洲大蠊1-3份和蚁狮1-3份混合物集中到一个烧杯中，用蒸馏 水进行冲洗，再用纸巾在桌面上进行滤干，滤干后将称重。
11.步骤二，称重结束后，加入没过混合物的pbs溶液，浸泡2小时。
12.步骤三，将浸泡之后的混合物倒入玻璃研钵中，加入0.5倍体积预冷的pbs 进行研磨，完全研磨直至溶液完全呈现黑色糊状为研磨完毕。
13.步骤四，将研磨好的匀浆倒入烧杯中，加入两倍体积的pbs进行24小时浸 泡，将浸泡24小时过后的匀浆进行离心管分装。
14.步骤五，在4℃、10000r/min的条件下进行离心15分钟，得到的离心粗提 液。将离心管中沉淀去除，留上清液即可。(保留了提取液的纤溶活性)
15.本发明的另一目的在于提供一种应用所述具有纤溶活性昆虫提取液的制备 方法制备得到的所述具有纤溶活性昆虫提取液，所述具有纤溶活性昆虫提取液 按质量份数计，由美洲大蠊1-3份和蚁狮1-3份组成。
16.本发明的另一目的在于提供一种具有纤溶活性昆虫提取液在制备抗血栓药 物中的应用。
17.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提 供的具有纤溶活性昆虫提取液具有较强的纤溶活性。研究表明，随着昆虫提取 液浓度的升高，提取物上清液冻干粉能够明显的促进人结肠癌细胞的凋亡，提 取物上清液冻干粉对结肠癌细胞增殖具有明显的抑制作用。
附图说明
18.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对本技术实施例中所 需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本技术 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下 还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1是本发明实施例提供的具有纤溶活性昆虫提取液的制备方法流程图。
20.图2是本发明实施例提供的提取物的纤溶平板检测结果示意图；
21.图2中：1：尿激酶(100u/ml)；2：提取物沉淀；3：提取物上清液；4： pbs。
22.图3是本发明实施例提供的温度对提取液纤溶活性的影响示意图。
23.图4是本发明实施例提供的ph对提取液纤溶活性的影响示意图。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
25.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有纤溶活性昆虫提取液、 制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
26.如图1所示，本发明实施例提供的具有纤溶活性昆虫提取液的制备方法包 括以下步骤：
27.s101，将美洲大蠊1-3份和蚁狮1-3份混合物集中到一个烧杯中，用蒸馏水 进行冲洗，再用纸巾在桌面上进行滤干，滤干后将称重。
28.s102，称重结束后，加入没过混合物的pbs溶液，浸泡2小时。
29.s103，将浸泡之后的混合物倒入玻璃研钵中，适当加入少许预冷的pbs进 行研磨，完全研磨直至溶液完全呈现黑色糊状为研磨完毕。
30.s104，将研磨好的匀浆倒入烧杯中，加入两倍体积的pbs进行24小时浸泡， 将浸泡24小时过后的匀浆进行离心管分装。
31.s105，在4℃、10000r/min的条件下进行离心15分钟，得到的离心粗提液； 将离心管中沉淀去除，留上清液即可。
32.本发明提供的具有纤溶活性昆虫提取液的制备方法业内的普通技术人员还 可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的具有纤溶活性昆虫提取液的制备 方法仅仅是一个具体实施例而已。
33.本发明实施例提供的具有纤溶活性昆虫提取液按质量份数计，由美洲大蠊 1-3份和蚁狮1-3份组成。
34.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
35.本发明提供的美洲大蠊和蚁狮提取物的提取方法为：将美洲大蠊1-3份和蚁 狮1-3份混合物集中到一个烧杯中，用蒸馏水进行冲洗，再用纸巾在桌面上进行 滤干，以确保水分对于蚁狮质量的影响，滤干后将称重，称重为6.55g。称重结 束后，加入没过混合物的pbs溶液，进行2小时的浸泡。将浸泡之后的溶液，倒 入玻璃研钵中，可适当加入少许预冷的pbs进行研磨，进行完全研磨直至溶液完 全呈现黑色糊状为研磨完毕，将研磨好的匀浆倒入烧杯中，加入两倍体积的pbs 进行24小时浸泡，将浸泡24小时过后的匀浆进行离心管分装，在4℃、10000r/min 的条件下进行离心15分钟，得到的离心粗提液。将离心管中沉淀去除，留上清 液即可。或采用新的技术方案如下：将美洲大蠊1-3份和蚁狮1-3份混合物清洗干 净，滤干，，
36.本发明得到的美洲大蠊和蚁狮提取液具有较强的纤溶活性，如图2所示。
37.由图2可知，尿激酶作为阳性对照，提取物上清液活性最强，pbs无活性。
38.另外，本发明还检测了提取物上清液冻干粉对结肠癌细胞增殖的抑制作用， 如表1所示。
39.表1不同浓度梯度下提取物上清液对癌细胞生长的影响结果
[0040][0041]
由表1可知，随浓度的升高，提取物上清液冻干粉能够明显的促进人结肠癌 细胞的凋亡，同时对其生长也有一定的抑制作用。
[0042]
下面结合具体实施例对本发明的技术效果作详细的描述：
[0043]
实施例1
[0044]
本发明实施例具有纤溶活性昆虫提取液酶学性质研究(1)温度对酶活性的 影响取提取液冻干粉，用生理盐水稀释至一定浓度，分别于4℃、25℃、35℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃的水浴锅条件下，培养15分钟后进行纤维平板 法检测其活力。
[0045]
打开超净工作台，将所需培养皿、枪头盒、移液枪、无菌水、无菌pbs， 空烧杯均放入，打开紫外灯照射灭菌半小时左右。将预先灭好菌的培养基熔化 (微波炉加热)后，置50℃恒温水浴锅中，水浴10min后取出，加入预先配制 好的牛血纤维蛋白原3ml,凝血酶120ul,迅速摇匀并倒平板。取出预先制备好的 粗提液及尿激酶，置于冰水浴中解冻，解冻完成后，置于冰袋上，放入超净工 作台上，准备加样。用灭局后的打孔器均匀地在平板上打孔。加样：每孔加入 20ul待测样品及uk标准品、pbs对照品，并做好标记。培养：将加样完毕的 平板用保鲜膜封存，放入37℃培养箱进行24小时培养。于37℃恒温培养箱中 取出已24h培养的纤维平板，加入预先配置好的考马斯亮蓝染色液进行染色； 15分钟后，处理掉染色液，加入脱色液进行洗脱。前3次每10min更换一次脱 色液，后每20min更换一次脱色液，经过多次洗脱后，至观察到明显的溶圈为 止。观察样品溶圈大小与标准品(uk)溶圈大小，测量溶圈直径，并拍照记录 实验结果。将观察后的平板表面加入少量蒸馏水，置于4℃冰箱中保存。
[0046]
结果显示：不同温度对酶活力的影响如图3所示，最适温度是45℃，超过 65℃，随着温度的升高，酶活力迅速下降，该纤溶酶可以耐受的温度为65℃。
[0047]
ph值对酶活性的影响将等量的提取液溶液溶于等量不同ph值的缓冲液中 (ph6—8的用磷酸盐缓冲液配制，ph8—8.5的用tris-hcl缓冲液配制， ph9—10.0的生理盐水用naoh调节)，4℃放置半小时，然后用纤维蛋白平板法 测定其酶活力。
[0048]
结果显示：不同ph对酶活力的影响如图4所示，随着ph的升高，酶活 力随之增大，但ph为10时，酶活力略有下降，纤溶酶的最适ph为9.0。
[0049]
金属离子、变性剂及抑制剂对提取液酶活性的影响配制好0.1mol/l的 nacl、bacl2、fecl3、edta、巯基乙醇(bme)，分别取等量上述试剂(80ul) 与等量的提取液溶液混合，4℃放置半小时后，用纤维蛋白平板法测定其酶活力。
[0050]
结果显示：edta溶液和ba
2+
对其纤溶活性基本上无影响，na
+
和变性剂bme (巯基乙醇)并没有完全抑制其活性。而fe
3+
几乎完全抑制了提取液纤溶活性 (表2)。
[0051]
表2金属离子和变性剂对提取液纤溶活力的影响
[0052][0053]
实施例2：具有纤溶活性昆虫提取液抑癌活性研究取对数生长期人结肠 癌细胞caco-2，胰酶消化，细胞计数板计数后，用培养液调细胞浓度至1.3
×
105个/ml，取96孔板，每孔加细胞悬液40ul、培养液200ul，取两个实验组与一个 对照组，共三组，每组设四个平行孔，共计12个孔。将加完细胞的96孔板放 入培养箱中培养10-12h后，实验组加入各浓度提取液5.5ul、pbs溶液10ul，对 照组加入15.5ul的pbs，放入培养箱中继续培养24h，于培养结束前4h取出， 吸去上清，用pbs清洗两遍后，加100ul不含血清的培养基，避光操作，各孔 加入配制好的mtt溶液(5mg/ml)20ul，4h避光培养后取出，小心吸去上清液， 各孔加入dmso溶液150ul，使紫色结晶溶解，酶标仪测定在490nm下的a值。 根据公式：细胞抑制率＝(1-a用药组/a对照组)x100％
[0054]
即可得提取液对人结肠癌细胞增殖的抑制作用
[0055]
表3抑癌实验梯度设置及加样表
[0056][0057][0058]
结果显示，提取液对癌细胞生长的影响结果。由表中细胞吸光度值利用公 式：viability(％)＝a
test
/a
control
；
[0059]
inhibition(％)＝(1-a
test
)/a
control
[0060]
即可计算出细胞存活率及抑制率如表4。
[0061]
表4加提取液后ovcar-3吸光值变化表
[0062][0063]
由表5数据可知，随蛋白浓度的升高，美洲大蠊纤溶活性粗蛋白能够明显 的促进人软巢癌细胞的凋亡，同时对其生长也有一定的抑制作用。
[0064]
表5不同浓度蛋白下癌细胞存活率
[0065][0066]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。