一种氟化聚乙烯亚胺在制备防治型RNA疫苗的制剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种氟化聚乙烯亚胺在制备防治型rna 疫苗的制剂中的应用。

背景技术：

1、信使核糖核酸(mrna)是一类单链核糖核酸，由脱氧核糖核苷酸(dna) 的一条链作为模板转录而来，携带遗传信息，且能够在细胞质中指导蛋白质合成。 mrna虽然发现于1961年，但关于mrna活体应用的第一份研究报告便于1990 年发表。与亚单位、灭活减毒病毒和dna疫苗相比，mrna疫苗有几个显著的特点：第一，由于mrna是一个非传染性、非整合性的平台，因此不存在感染或插入突变的潜在风险，安全性较高；第二，相对于dna疫苗，rna疫苗的不需要穿过核屏障来诱导蛋白质表达，仅在细胞质中就能完成，因而rna疫苗对载体要求更低。由于不需要跨越这一额外的生物屏障，mrna地转染效率高于质粒dna，特别是对于缓慢分裂的细胞。但是mrna入胞存在以下问题，第一，mrna带负电荷，无法自由通过细胞膜；第二，mrna容易被血浆和组织中rnase酶降解，被肝脏和肾脏快速清除并被免疫系统识别；第三，被内吞进入的mrna需从溶酶体中逃逸，待其进入细胞质后方可发挥功能。因此，如何快速地将mrna递送入胞并诱发其溶酶体逃逸是目前mrna疫苗面临的主要挑战。

2、现有的mrna载体递送技术包括鱼精蛋白载体技术、纳米颗粒脂质体载体技术和多聚体载体技术等。其中，纳米颗粒脂质体(lipid nanoparticles，lnps)被广泛应用于新型冠状病毒covid-19的mrna疫苗研究中。目前正在进行的mrna疫苗人体试验有8项，由biontech/辉瑞公司、莫德纳公司、curevac公司、赛诺菲公司/translatebio公司、新加坡的arcturus/duke-nus 医学院、伦敦帝国理工学院、泰国朱拉隆功大学和加拿大的providence therapeutics 公司牵头。lnps载体递送mrna的原理目前还不完全清楚，但是通常认为，lnp 通过非共价亲和力和细胞膜结合并通过内吞作用被摄取，进入细胞内涵体后，由于 ph值的下降，可离子化脂质被离子化并带正电荷，该正电荷脂质和内涵体膜中负电荷磷酸脂质结合，进而破坏内涵体膜，使mrna逃离内涵体进入细胞质中表达靶蛋白。除了尚未完全明了的机制之外，lnps还存在以下问题：

3、首先，lnps制备工艺较为复杂。lnps的制备中需要长时间和反复的减压蒸发以及真空干燥，以完全去除有机溶媒。lnps粉末在溶解为注射液体后仍需振荡分散才可形成lnps药液。因此，lnps的制备工艺及其使用仍较为复杂。

4、其次，lnps成分中含有诱发免疫反应风险的物质。lnps通常包含四种成分：可电离的阳离子脂质，可与带负电荷的遗传物质络合以促进自组装成纳米颗粒 (～100nm)，并帮助mrna逃离内涵体逃逸；聚乙二醇化脂质(peg)，以延长制剂的半衰期，改善稳定性和循环时间；胆固醇，用于稳定制剂和促进膜融合；天然产生的磷脂，以支持脂质双层结构。虽然peg此前从未在获批的其他疫苗中使用过，但部分含有该成分的药物偶尔会引起过敏反应。因此，lnps作为mrna的载体存在一定安全隐患。

5、另外，lnp的核心专利在国外，关键辅料不能国产。目前新冠mrna人体实验的8家公司中，仅辉瑞和莫德纳新冠mrna疫苗所用lnp的组成被公开披露。由于lnps是fda批准的最常见的纳米药物类别，使得lnp的核心专利基本都在国外。此外，lnps许多关键的辅料国内无法生产，导致目前lnps全球紧缺的情况下，国内基于lnps的mrna疫苗研究被卡脖子。

6、此前，人们发现聚乙烯亚胺(pei)具有刺激免疫反应的佐剂功能。pei可以很显著刺激骨髓来源树突状细胞(bmdc)表面cd86和mhc-ii的表达并在此过程中释放促炎细胞因子tnf-α和il-6。研究者发现，在tlr4敲除的小鼠体内，pei 杀伤肿瘤的免疫反应也有所下降。近些年，基于氟化修饰的阳离子高分子(如氟化 pei)作为核酸胞内的递送载体，被应用于高效核酸递送。一般来说pei分子量越大，所带正电荷越多，其具有更高的胞内递送效率，但是其于细胞及活体的毒性也随之增加；低分子量的pei毒性虽然较小，但其递送效果较差。本专利中出人意料地发现了氟化修饰的低分子量pei作为mrna递送载体具有高效的递送能力，并对不同的氟取代程度进行筛选，找到了mrna递送效果最优的氟化低分子量pei。

7、鉴于肿瘤免疫治疗具有更高的要求，目前并未有关于将氟化聚乙烯亚胺 (f-pei)用于mrna递送的相关报道。

8、中国发明专利(申请公布号cn 107556493 a)公开了一种核酸递送载体及其制备方法和应用，所述核酸递送载体为两亲性氟化材料的纳米自组装体，所述两亲性氟化材料为全氟辛烷基取代的寡聚聚乙烯亚胺，该核酸递送载体将寡聚聚乙烯亚胺与全氟辛烷基材料结合在一起实现提高核酸递送效率的功能。本发明与该专利的不同之处在于，该专利主要局限于利用含氟聚乙烯亚胺作为sirna的体外细胞层面的递送载体。而本发明对于核酸递送载体的结构从全氟支链长度和聚乙烯亚胺聚合度两个角度进行优化，得到了能够有效转染原代骨髓来源树突状细胞和骨髓来源巨噬细胞的载体，并且着重研究其在动物体内mrna的有效递送；同时，本发明中的载体还对免疫系统本身具有激活作用，这一特性能够使其成为一种更高效的肿瘤疫苗的组成部分。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种氟化聚乙烯亚胺在制备防治型rna疫苗的制剂中的应用，为增强疫苗递送效率、增强抗原特异性免疫反应提供一种胞内递送体系，氟化聚乙烯亚胺可同时作为抗原载体并能发挥免疫佐剂的功能。

2、本发明公开了一种氟化聚乙烯亚胺在制备防治型rna疫苗的制剂中的应用，尤其是氟化聚乙烯亚胺(f-pei)在制备mrna疫苗或防治病毒和/或细菌引起的疾病的制剂中的应用，氟化聚乙烯亚胺包括支化聚乙烯亚胺和与所述支化聚乙烯亚胺共价连接的氟化官能团，所述氟化聚乙烯亚胺f-pei为f7-pei或 f13-pei，所述f7-pei和f13-pei的分子式如下：

3、

4、其中，m1和m2为0以上的整数；

5、所述支化聚乙烯亚胺的分子量为1000-50000道尔顿。优选地，支化聚乙烯亚胺的分子量为1800-25000道尔顿。最佳地，支化聚乙烯亚胺的分子量为1800、 10000和25000道尔顿。

6、进一步的，当所述氟化聚乙烯亚胺在制备rna防治型疫苗时，氟化聚乙烯亚胺用于制备mrna疫苗载体和/或免疫佐剂。

7、进一步的，所述疫苗为防治肿瘤疫苗，优选地，所述疫苗为抗肿瘤疫苗。

8、氟化聚乙烯亚胺能够增强抗原呈递细胞对mrna的摄取和溶酶体逃逸，进一步诱发抗原的mhc-i类型呈递，并激活抗原特异性cd8免疫反应。

9、进一步的，所述疫苗的制备方法包括以下步骤，将氟化聚乙烯亚胺与抗原 rna在水溶液中混合孵育5-30分钟后，得到所述疫苗。

10、进一步的，所述孵育温度为20-30℃。

11、进一步的，所述rna为鸡卵清白蛋白(ova)和/或mc38结肠癌肿瘤新抗原mrna中的一种或几种。

12、进一步的，所述疫苗为防治病毒和/或细菌引起疾病的疫苗，当所述氟化聚乙烯亚胺在制备防治病毒和/或细菌引起的疾病的疫苗时，氟化聚乙烯亚胺用于制备病毒rna载体。针对covid-19，我国主要使用灭活病毒疫苗，而国外主要使用mrna疫苗(例如pfizer和moderna两款疫苗)，此类疫苗能够引起强烈特异性免疫反应。而其核心技术即为使用mrna载体，实现高效的病毒mrna递送和后续的免疫反应激活。因此，所述氟化聚乙烯亚胺可用于制备病毒rna载体，从而制备病毒和/或细菌引起的疾病的疫苗。

13、进一步的，所述病毒选自hiv、hpv、covid-19和h1n1中的一种或几种。所述细菌选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌中一种或几种。

14、本发明中氟化聚乙烯亚胺(f-pei)一方面可以作为各种类型抗原的载体，将抗体直接递送到抗原呈递细胞(apcs)的细胞质中，有利于抗原的呈递(如交叉呈递)。

15、本发明中氟化聚乙烯亚胺(f-pei)具有较高的表面活性，使其具有优异的自组装能力，并且其疏油疏水的特性使得其生物相容性好、细胞摄入水平高、细胞毒性小。抗原可以与氟化高分子通过疏水相互作用共组装成纳米颗粒。同时氟化功能基团既疏水又疏油的性质提高复合物细胞摄入及内涵体逃逸水平。其生物相容性好的特点使其不易使抗原变性。同时其不易与细胞膜融合也可以产生较小的细胞毒性。所以，f-pei可以提升抗原摄取并促进交叉呈递。

16、当用mrna抗原时，可以基于f-pei获得肿瘤疫苗。该基于f-pei的rna 疫苗不仅可以高效地将rna递送入抗原呈递细胞中，促使抗原呈递细胞对于 rna编码抗原的交叉呈递，激活机体对于rna编码抗原的cd8 t细胞免疫反应，同时也作为一种治疗型疫苗有效抑制肿瘤的生长，最终达到提升患者生活质量和生存率的目的。借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

17、(1)本发明公开了f-pei的新用途，其可以mrna的胞质递送，促进了抗原呈递细胞对mrna的摄取、表达和mrna编码蛋白的交叉呈递。

18、(2)f-pei显著增强了机体针对mrna编码蛋白的抗原特异性t细胞免疫反应。

19、(3)作为治疗型mrna疫苗，本发明对肿瘤生长很强的抑制作用并延长了小鼠的寿命。

20、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

21、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。