羧甲基壳聚糖用于促进皮肤伤口愈合、修复皮肤屏障的用途的制作方法

1.本发明涉及一种羧甲基壳聚糖的新用途，具体涉及羧甲基壳聚糖在制备用于促进皮肤伤口愈合、修复皮肤屏障的用途。


背景技术：

2.羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，有许多特性，如抗菌性强，具有保鲜作用，是一种两性聚电解质等。在化妆品、保鲜、医药等方面有多种应用，也是近年来研究得较多的壳聚糖衍生物之一。
3.羧甲基甲壳素的羧甲基是在糖残基的c6
‑
oh上发生取代，有少量羧甲基在c3
‑
oh上发生取代，生成的是o
‑
羧甲基甲壳素。壳聚糖中，羧甲基既会在
‑
oh上发生取代，也会在
‑
nh上发生取代，生成o
‑
羧甲基和n
‑
羧甲基壳聚糖，实际上的取代情况有：c6
‑
o
‑
羧甲基、c2
‑
n
‑
羧甲基、c3
‑
o
‑
羧甲基、c6
‑
o、c2
‑
n
‑
羧甲基等。由于c3上的位阻效应以及c2和c3之间的分子内氢键，使c3位上的羧甲基化比较难发生，所以羟基上的羧甲基取代，c3
‑
o羧甲基较少一些，而以c6
‑
o羧甲基为主。对于c6
‑
oh与c2
‑
nh来说，在碱性条件下羧甲基在羟基上的取代活性要高于氨基，因此，当取代度小于1时，羧甲基的取代主要是在羟基上而不是氨基上，只有取代度接近1和高于1时，才会同时在氨基上发生羧甲基取代，形成o，n
‑
羧甲基壳聚糖。羧甲基壳聚糖的水溶性，除了因为它是一种羧酸钠盐而溶于水外，还有一个原因是羧甲基的导入，破坏了壳聚糖分子的二次结构，使其结晶度大大降低，几乎成为无定形。
4.现有技术中公开了羧甲基壳聚糖具有吸湿、保湿、抑菌的用途，但是其他用途均未被公开。
5.皮肤屏障是人体最大的组织，也是外环境与体内环境的界面，其用于保持人体内环境稳定，能够防止外界有害物质或不需要的物质入侵皮肤，防止机体内各种营养物质、水分和电解质的丧失；广义皮肤屏障包含微生物屏障、化学屏障、物理屏障以及免疫屏障等。皮肤屏障结构和功能异常会导致皮肤炎症和皮肤疾病的发生。
6.医美中光电治疗包括超声刀、光动力、射频、激光、可见光和强脉冲光等，可用于治疗疾病或者用于美容。其通过光热作用、光机械作用或光调作用能够针对皮肤损伤进行修复重建。
7.光电作用的靶标不同，对皮肤屏障的损伤结构不同，损伤程度亦不同。光电治疗会导致皮肤屏障功能破坏，并且可能会引起局部不良反应，如炎症、感染、瘢痕或色素。临床医生必须正确面对不同光电治疗引起的皮肤屏障损伤，熟悉各种光电治疗后的不良反应，并提供最佳、有效和及时的治疗后护理，这些会大大降低与治疗方式相关的风险。
8.但是，目前，还没有医美光电治疗术后护理的统一标准或者护理用品，而现有技术中也缺乏针对光电治疗术后的创面护理和修复的产品。


技术实现要素：

9.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种羧甲基壳聚糖的新用
途。
10.为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
11.本发明首先公开了羧甲基壳聚糖用于非治疗目的地促进皮肤伤口愈合的用途。
12.本发明还公开了羧甲基壳聚糖作为促进皮肤伤口愈合的有效成分在制备外用产品中的用途。
13.本发明还公开了羧甲基壳聚糖用于非治疗目的地修复皮肤屏障的用途。
14.本发明还公开了羧甲基壳聚糖作为修复皮肤屏障的有效成分在制备外用产品中的用途。
15.本发明还公开了羧甲基壳聚糖用于制备由医美光电治疗引起的皮肤问题的外用产品。
16.优选地，本技术中，所述外用产品是指外用于皮肤表面的产品。
17.优选地，所述羧甲基壳聚糖为o
‑
羧甲基脱乙酰壳多糖。
18.优选地，所述羧甲基壳聚糖的数均分子量为1000～20000。
19.优选地，在用于非治疗目的地促进皮肤伤口愈合时，采用0.01wt％～0.2wt％的羧甲基壳聚糖。
20.优选地，在用于非治疗目的地修复皮肤屏障时，采用0.01wt％～0.2wt％的羧甲基壳聚糖。
21.优选地，在作为有效成分制备外用产品时，以外用产品的总质量为基准计，所述羧甲基壳聚糖的添加量不超过1wt％，优选为不超过0.5wt％。
22.优选地，在所述由医美光电治疗引起的皮肤问题的外用产品中，采用0.05wt％～1wt％的羧甲基壳聚糖。
23.本发明还公开了一种外用产品，至少包括羧甲基壳聚糖和水。
24.优选地，以外用产品的总质量的基准计，所述羧甲基壳聚糖的含量为不超过1wt％，优选为不超过0.5wt％。更优选地，0.05wt％～1wt％，更优选为0.05wt％～0.5wt％。
25.优选地，所述羧甲基壳聚糖为o
‑
羧甲基脱乙酰壳多糖。
26.优选地，所述羧甲基壳聚糖的数均分子量为1000～20000。
27.优选地，所述外用产品还包括增稠剂、防腐剂、保湿剂、乳化剂、皮肤调理剂、抗氧化剂、润肤剂、螯合剂和ph调节剂中的一种或多种中的一种或多种。
28.优选地，所述外用产品为喷雾、精华液、精华露、精华霜、乳液、面膜或医用湿性敷料。
29.具体地，所述o
‑
羧甲基脱乙酰壳多糖为羧甲基甲壳素脱乙酰化后或壳聚糖的6
‑
羟基氢被羧甲基取代后的部分羧甲基化的脱乙酰壳多糖。
30.更为优选地，所述o
‑
羧甲基脱乙酰壳多糖的结构式如下所示：
[0031][0032]
其中r1为ch2coona；r2为ch2coona或h；r3为ch2coona或h或coch3。
[0033]
现有技术中羧甲基壳聚糖的种类很多，但是并不是所有的羧甲基壳聚糖适合用外用于皮肤表面。具体地，所述羧甲基壳聚糖的数均分子量为1000～20000。所述数均分子量是按照《中华人民共和国药典(四部)》(2015年版)通则0401“紫外
‑
可见分光光度法”方法测定a
525
。其原理为：乙酰丙酮试剂与标准氨基葡萄糖、羧甲基脱乙酰壳多糖或其水解液的还原性端基反应产生色原；一定条件下，吸光度a
525
与相应糖的摩尔浓度具有线性关系。水解后比水解前增加的还原性端基的倍数就是该羧甲基脱乙酰壳多糖的平均聚合度n，结合分子中糖单元平均分子质量可以计算出该糖的数均分子质量。
[0034]
申请人意外发现本技术中这种具有良好亲肤性和生物相容性的羧甲基壳聚糖，可以作为有效成分用于制备用于修复皮肤的产品，通过相关试验结果表明，上述所述羧甲基壳聚糖具有显著的修复皮肤的功效，特别是能够明显修复受损伤皮肤屏障和促进皮肤伤口愈合，而且，由其作为有效成分形成的用于修复皮肤的产品，如用于皮肤表面护理的产品如化妆品，非常适合用于修复由医美光电治疗引起的皮肤问题。
附图说明
[0035]
图1为采用mha
‑
20的细胞毒性检测结果中细胞活力变化趋势图。
[0036]
图2显示为采用mha
‑
20的细胞毒性检测结果中形态学检测结果。
[0037]
图3显示为采用mha
‑
30的细胞毒性检测结果中细胞活力变化趋势图。
[0038]
图4显示为采用mha
‑
30的细胞毒性检测结果中形态学检测结果。
[0039]
图5显示为mha
‑
45的细胞毒性检测结果中细胞活力变化趋势图。
[0040]
图6显示为采用mha
‑
45的细胞毒性检测结果中形态学检测结果。
[0041]
图7显示为细胞增殖检测结果折线图。
[0042]
图8显示为正常皮肤组织形态照片。
[0043]
图9显示为空白伤口对照组的皮肤组织形态照片。
[0044]
图10显示为采用本技术中mha
‑
20涂抹后的皮肤组织形态照片。
[0045]
图11显示为正常皮肤表皮角质层的组织形貌照片。
[0046]
图12显示为空白对照组中空
‑
1的皮肤表皮角质层的形貌照片。
[0047]
图13显示为样品组1中样品1
‑
1的皮肤表皮角质层形貌照片。
[0048]
图14显示为样品组2中2
‑
1样品对应的皮肤表皮角质层形貌照片。
[0049]
图15显示为对比组3中3
‑
1的皮肤表皮角质层的形貌照片。
具体实施方式
[0050]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0051]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0052]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0053]
申请人基于对羧甲基壳聚糖的应用拓展及研究，意外发现，羧甲基壳聚糖在外用于皮肤表面时，还具有显著的修复皮肤的效果，并且是能够作为唯一有效成分制备用于修复皮肤的产品。
[0054]
基于对人成纤维细胞增殖实验及实验结果，申请人发现，采用本技术中羧甲基壳聚糖在安全给药浓度内，并不具有细胞毒性，且能够显著促进人成纤维细胞增殖。
[0055]
展开的动物实验及效果证明，所述羧甲基壳聚糖能够促进伤口肉芽组织形成，激活上皮组织，缓解成纤维细胞及疤痕增殖，减少或避免疤痕，使皮损恢复平整，加快伤口愈合能够促进皮肤伤口愈合。由此，可以明确说明本技术中的羧甲基壳聚糖作为化妆品原料，用于皮肤护理，其能够起到良好的促进皮肤伤口愈合效果，尤其对于由医美光电治疗引起的皮肤问题有良好的治疗效果。
[0056]
展开的动物实验及效果证明，所述羧甲基壳聚糖能够促进皮肤表皮角质层的恢复，从而能够用于修复受损伤皮肤屏障。由此，可以说明本技术中的羧甲基壳聚糖作为化妆品原料，用于皮肤护理，其能够起到良好的修复受损伤皮肤屏障的效果，对于由医美光电治疗引起的皮肤问题也有良好的治疗效果。
[0057]
现有技术中已经公开本技术中的羧甲基壳聚糖具有抗菌抗炎功效，并且羧甲基壳聚糖的亲肤性和生物相容性效果好，这都能避免在使用羧甲基壳聚糖作为修复功效成分过程中引起的其他皮肤安全性问题，由此，本技术中的羧甲基壳聚糖非常适合用于作为皮肤修复类化妆品的原料使用。
[0058]
由此，申请人首先提供了一种羧甲基壳聚糖用于非治疗目的地促进皮肤伤口愈合的用途。
[0059]
在一个具体的实施方式中，还提供了羧甲基壳聚糖作为促进皮肤伤口愈合的有效成分用于制备外用产品的用途。羧甲基壳聚糖作为原料成分用于修复皮肤的产品中，此时，羧甲基壳聚糖为用于修复皮肤的唯一有效成分或有效成分之一。
[0060]
在一个具体的实施方式中，申请人公开了羧甲基壳聚糖用于非治疗目的地修复皮
肤屏障的用途。
[0061]
在一个具体的实施方式中，还提供了羧甲基壳聚糖作为修复皮肤屏障的有效成分用于制备外用产品的用途。
[0062]
在一个具体的实施方式中，还提供了所述羧甲基壳聚糖用于制备适用于医美光电治疗引起的皮肤问题的外用产品的用途。
[0063]
在一个优选的实施方式中，所述外用产品是指外用于皮肤表面的产品。如化妆品、护肤品、药妆等均包含在内。由于羧甲基壳聚糖的良好水溶性，所述用于修复皮肤的产品可以为喷雾、精华液、或者精华露、精华霜，也可以是面膜或医用湿性辅料等。
[0064]
在一个优选的实施方式中，在用于非治疗目的地促进皮肤伤口愈合时，采用0.01wt％～0.2wt％的羧甲基壳聚糖。
[0065]
在一个优选的实施方式中，在用于非治疗目的地修复皮肤屏障时，采用0.01wt％～0.2wt％的羧甲基壳聚糖。
[0066]
在一个优选的实施方式中，在作为有效成分制备外用产品时，以外用产品的总质量为基准计，所述羧甲基壳聚糖的添加量不超过1wt％，优选为不超过0.5wt％。
[0067]
在一个更优选的实施方式中，在制备外用产品时，以外用产品的总质量为基准计，所述羧甲基壳聚糖的添加量为0.05wt％～1wt％，在一个更优选的实施方式中，所述羧甲基壳聚糖的添加量为0.05wt％～0.5wt％，在一个更优选的实施方式中，所述羧甲基壳聚糖的添加量为0.1wt％～0.5wt％，如在更具体的实施方式中，可以为0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％或0.5wt％。
[0068]
在一个具体的实施方式中，所述羧甲基壳聚糖为o
‑
羧甲基脱乙酰壳多糖。所述o
‑
羧甲基脱乙酰壳多糖为羧甲基甲壳素脱乙酰化后或壳聚糖的6
‑
羟基氢被羧甲基取代后的部分羧甲基化的脱乙酰壳多糖。
[0069]
在一个更具体的实施方式中，所述o
‑
羧甲基脱乙酰壳多糖的结构式如下所示：
[0070][0071]
其中r1为ch2coona；r2为ch2coona或h；r3为ch2coona或h或coch3。
[0072]
在一个具体的实施方式中，所述羧甲基壳聚糖的数均分子量为1000～20000，如分子量可以为5000、10000、15000或20000。所述数均分子量是按照《中华人民共和国药典(四部)》(2015年版)通则0401“紫外
‑
可见分光光度法”方法测定a
525
。其原理为：乙酰丙酮试剂与标准氨基葡萄糖、羧甲基脱乙酰壳多糖或其水解液的还原性端基反应产生色原；一定条件下，吸光度a
525
与相应糖的摩尔浓度具有线性关系。水解后比水解前增加的还原性端基的倍数就是该羧甲基脱乙酰壳多糖的平均聚合度n，结合分子中糖单元平均分子质量可以计算出该糖的数均分子质量。本技术中还具体公开了如上述所述羧甲基壳聚糖的一种制备方法，包括将数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料通过双氧水降解。更为优选地，所述数均分
子量较高的羧甲基壳聚糖原料中羧甲基壳聚糖的数均分子量30～70万。更为优选地，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料中羧甲基取代度为0.8～1.3。更为优选地，所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料中羧甲基o位取代度为0.7～1.0，n位取代度不超过0.3。
[0073]
所述数均分子量较高的羧甲基壳聚糖原料为由国内申请号为2013105362023的发明专利公开的方法制备获得，其公开了一种制备羧甲基壳聚糖的方法，所述的方法是以甲壳素为原料，先将甲壳素碱化，使用冷热交替法进行脱乙酰化反应，生产壳聚糖钠盐，再在碱性条件下进行羧化反应，获得数均分子量较高的羧甲基壳聚糖产品。本发明方法工艺简单且易于控制，避免了壳聚糖分子链脱乙酰化反应时因长期高温反应出现的断链现象，从而获得了一种高粘度、高取代度和水溶性更好的羧甲基壳聚糖，适合大规模工业化生产。所述分子量较高的羧甲基壳聚糖溶解的ph范围为4.5～14.0。所述的数均分子量较高的羧甲基壳聚糖可以溶解在ph为4.5～6.5的酸性溶液中。与传统工艺获得的羧甲基壳聚糖溶解的ph范围为7.0～14.0相比，上述专利方法获得的数均分子量较高的羧甲基壳聚糖溶解的ph范围更宽，拓宽了其应用领域。
[0074]
在一个更优选的实施方式中，双氧水降解的工艺为：将双氧水在搅拌条件下加入数均分子量较高的羧甲基壳聚糖中进行降解反应，降解反应过程中加碱使得反应体系的ph为8.0～8.5，直至反应体系的粘度为80～120cp时加入亚硫酸钠停止反应。更优选地，降解反应中，反应温度为25～45℃。由上述降解反应即获得降解后的羧甲基壳聚糖。
[0075]
在一个更优选的实施方式中，所述羧甲基壳聚糖的制备方法包括对双氧水降解后的羧甲基壳聚糖进行酸析洗涤。所述酸析洗涤是指用酸调整双氧水降解后的羧甲基壳聚糖料体至ph为6～7，加入乙醇至淡黄色晶体析出，再用酒精反复洗涤，甩干，干燥获得羧甲基壳聚糖。
[0076]
在一个具体的实施方式中，本技术中提供的含有羧甲基壳聚糖的产品，不仅具有显著的促进人成纤维细胞增殖、促进伤口肉芽组织形成、促进皮肤表皮角质层的恢复的新效果，而且结合其具有的抗菌抗炎功效，以及易溶于水形成湿性辅料的特征，其非常适合应用于医美术后皮肤的修复，不仅能有助于修复皮肤屏障、促进伤口愈合，也避免了在湿性环境或者修复过程中炎症和感染等现象。
[0077]
本技术中为了进一步说明羧甲基壳聚糖能够作为唯一有效成分用于外用产品中，还提供了一种具体的外用产品，所述用于修复皮肤的产品至少包括羧甲基壳聚糖和水。
[0078]
在一个优选的实施方式中，所述外用产品还包括包括增稠剂、防腐剂、保湿剂、乳化剂、皮肤调理剂、抗氧化剂、润肤剂、螯合剂和ph调节剂。这些成分是皮肤外用化妆品领域常用于形成喷雾、精华液、精华露、乳液、面霜或医用湿性敷料所用的原材料。
[0079]
在一个更优选的实施方式中，所述增稠剂可以选自透明汉生胶(dsm)、ez
‑
4u、blv、卡波姆、simulgel ns、鲸蜡硬脂醇、tr
‑
2、simulgel eg和stabylen 30中的一种或多种。
[0080]
在一个更优选的实施方式中，所述防腐剂可以选自戊二醇、馨鲜酮、己二醇、乙基己基甘油(sc50)和辛甘醇中的一种或多种。
[0081]
在一个更优选的实施方式中，所述保湿剂可以选自戊二醇、1,3
‑
丁二醇、己二醇、乙基己基甘油(sc50)、辛甘醇和甘油中的一种或多种。
[0082]
在一个更优选的实施方式中，所述乳化剂可以选自sse
‑
20、烷基糖苷类乳化剂(如montanov 68)和自乳化单甘脂乳化剂(如tegocare 165)中的一种或多种。
[0083]
在一个更优选的实施方式中，所述皮肤调理剂可以选自羧甲基壳聚糖、精氨酸、聚
‑
谷氨酸钠、透明质酸钠、红没药醇和生育酚乙酸酯中的一种或多种。
[0084]
在一个更优选的实施方式中，所述抗氧化剂可以选自馨鲜酮。
[0085]
在一个更优选的实施方式中，所述润肤剂可以选自角鲨烷、乳木果油、硅油(如silsoft 034)、辛酸甘油三酯、奎酸甘油三酯、中的一种或多种。
[0086]
在一个更优选的实施方式中，所述ph调节剂选自精氨酸。
[0087]
在一个更优选的实施方式中，所述螯合剂选自edta
‑
2na。
[0088]
以下为具体实验及实施效果数据，通过以下实验及实施效果数据对本技术实施例中上述所述的具体方案及其达到的效果进行说明和支撑。
[0089]
以下为具体实验及实施效果数据。
[0090]
本技术中，采用的mha
‑
20为数均分子量为10000的羧甲基壳聚糖，采用的mha
‑
30为数均分子量为15000的羧甲基壳聚糖，采用的mha
‑
45为数均分子量为20000的羧甲基壳聚糖。
[0091]
一、基于成纤维细胞的促增值检测。
[0092]
1.1、测试用原料及主要设备说明
[0093]
待测羧甲基壳聚糖样品包括：mha
‑
20、mha
‑
30和mha
‑
45，均为固体粉末，颜色为白色，具有水溶性，干燥避光保存。
[0094]
测试模型：测试中采用细胞为人成纤维细胞，细胞批号为fb19052002。
[0095]
主要试剂：pbs、mtt、dmso、dmem和新生牛血清。其中，具体地，pbs由索莱宝提供，mtt和dmso由sigma提供、dmem由gibco提供，新生牛血清为兰州荣晔提供。
[0096]
主要设备：co2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、酶标仪、微量振荡器、天平。其中，具体地，co2培养箱为thermo 150i，倒置显微镜为olympus ckx41,酶标仪为biotekepoch，微量振荡器为其林贝尔mm
‑
1,天平为赛多利斯bsa124s。
[0097]
1.2、测试方法
[0098]
1.2.1细胞毒性检测及检测结果
[0099]
1.2.1.1 mtt检测
[0100]
细胞接种：按1
×
104个/孔的密度接种人成纤维细胞至96孔板，孵育过夜。孵育采用培养箱，在37℃和5％co2浓度下进行。
[0101]
实验分组：实验设置调零组、溶剂对照组(control)、阳性对照组(pc)与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
[0102]
配液：按照测试浓度设定如表1来配置不同浓度的样品工作液。
[0103]
表1 测试浓度设定表
[0104][0105]
给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μl培养液；阳性对照组每孔加入200μl含10％dmso的培养液；样品组每孔加入200μl含相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μl细胞培养液。给药完成后将96孔板
放置在培养箱中培养，培养条件为37℃、5％co2。
[0106]
检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上层清液，加入0.5mg/ml mtt工作液，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上层清液，每孔加150μldmso，在490nm处读取od值。
[0107]
细胞活力计算：根据公式计算，
[0108]
1.2.1.2形态学检测
[0109]
细胞接种：设立样品组与溶剂对照组(sc)，每组设两个复孔。按相应的接种密度接种细胞至24孔板中，在培养箱中孵育过夜，孵育温度为37℃，co2为5％。
[0110]
配液：根据mtt检测结果，选取细胞活力拐点附近浓度，进行形态学观察，确定检测样品的形态学观察浓度。
[0111]
给药：待24孔板细胞铺板率达到40％～60％时，进行给药，样品组加入不同浓度的受试物，溶剂对照组加入培养液，培养箱中孵育24h，条件为37℃、5％co2。
[0112]
细胞观察：孵育结束后，显微镜下观察细胞形态并拍照。
[0113]
1.2.1.3细胞毒性检测结果：
[0114]
对样品mha
‑
20设定8个给药浓度，在人成纤维细胞上开展细胞毒性检测实验，mtt检测结果见表2，细胞活力变化趋势如图1所示。基于mtt实验结果，选择5个浓度进行形态学检测，形态学检测结果如图2所示。
[0115]
根据mtt和形态学结果，认为样品mha
‑
20基于人成纤维细胞，在2mg/ml的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。
[0116]
表2 mha
‑
20mtt检测结果
[0117][0118][0119]
对样品mha
‑
30设定8个给药浓度，在人成纤维细胞上开展细胞毒性检测实验，mtt检测结果见表3，细胞活力变化趋势如图3所示。基于mtt实验结果，选择5个浓度进行形态学检测，形态学检测结果如图4所示。
[0120]
根据mtt和形态学结果，认为样品mha
‑
30基于人成纤维细胞，在2mg/ml的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。
[0121]
表3 mha
‑
30mtt检测结果
[0122][0123]
对样品mha
‑
45设定8个给药浓度，在人成纤维细胞上开展细胞毒性检测实验，mtt检测结果见表4，细胞活力变化趋势如图5所示。基于mtt实验结果，选择5个浓度进行形态学检测，形态学检测结果如图6所示。
[0124]
根据mtt和形态学结果，认为样品mha
‑
45基于人成纤维细胞，在2mg/ml的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。
[0125]
表4 mha
‑
20mtt检测结果
[0126][0127]
1.2.2细胞增殖检测及检测结果。
[0128]
1.2.2.1细胞增殖检测
[0129]
细胞接种：按4
×
103个/孔的密度接种人成纤维细胞至96孔板，孵育过夜。孵育采用培养箱，在37℃和5％co2浓度下进行。
[0130]
配液：按照如表5中实验设计配置样品工作液。其中，表中及下属所述的样品浓度中羧甲基壳聚糖的浓度，为羧甲基壳聚糖水溶液的质量百分浓度。
[0131]
表5 实验设计
[0132][0133]
给药：根据表5实验分组设计，待96孔板中细胞的铺板率达到20％～30％时，进行分组给药，每孔给药量为200μl，每组设3个复孔。在培养箱中以37℃、5％co2分别培养24h、48h、72h。对需要孵育培养48h和72h组别每天进行半换液处理。
[0134]
检测：待孵育完成后，弃掉上层清液，加入0.5mg/ml mtt工作液，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上层清液，每孔加150μldmso，在490nm处读取od值。同时，48h和72h后，进行上述mtt检测操作。
[0135]
细胞活力计算：根据公式计算，
[0136]
1.2.2.2细胞增殖检测结果。
[0137]
基于测试方法，进行细胞增殖作用检测，检测结果汇总如表6所示，增殖折线图如图7所示。
[0138]
与sc组相比，pc组的相对细胞活力上升，具有显著促增殖作用(p＜0.01)，说明实验体系有效。
[0139]
与sc组相比，样品组mha
‑
20
‑
0.01％、mha
‑
20
‑
0.025％、mha
‑
20
‑
0.05％、mha
‑
30
‑
0.025％及mha
‑
45
‑
0.025％在24h和48h均具有促进成纤维细胞增殖的作用。
[0140]
本技术中，应用graphpad prism program软件作图，各组间采用t
‑
test统计分析，
p＜0.05表示差异显著，p＜0.01表示差异极显著。
[0141]
表6 细胞增殖检测结果汇总
[0142][0143][0144]
由上述细胞增殖实验及结果可以得出:
[0145]
与sc组相比，样品mha
‑
20在0.01％、0.025％和0.05％，以及mha
‑
30和mha
‑
45在0.025％浓度下，作用24h和48h时，均表现出显著促进人成纤维细胞增殖的作用。
[0146]
二、检测羧甲基壳聚糖对伤口愈合的促进作用实验及效果。
[0147]
基于小鼠实验，评价本技术中羧甲基壳聚糖对伤口愈合的促进作用。
[0148]
2.1、测试材料
[0149]
2.1.1试验动物
[0150]
豚鼠(雌/雄)。
[0151]
2.1.2试验条件
[0152]
实验室温度20～25℃，相对湿度60～70％。
[0153]
2.2、试验方法及结果。
[0154]
选健康白色豚鼠5只，剃去每只动物背部脊柱二侧5cm
×
5cm左右范围的被毛，用手术刀作无菌操作，在两侧皮肤作“一”字形切口，切口以渗血为度，然后涂抹0.025wt％mha
‑
20水溶液。每天1次，连续5天后处死动物，解剖，取皮肤切口试验区作病理切片，进行组织学观察。
[0155]
测试结果如图8、图9和图10所示，其中，图8为正常皮肤组织形态照片，图9为空白伤口对照组的皮肤组织形态照片，图10为采用本技术中mha
‑
20涂抹后的皮肤组织形态照片。
[0156]
由图上的组织形态图片可以明显看出，羧甲基壳聚糖mha
‑
20具有促进伤口肉芽组织形成，激活上皮组织，环节成纤维细胞和疤痕增殖，减少或避免疤痕，使皮损恢复平整，加快伤口愈合。
[0157]
三、基于含有羧甲基壳聚糖的作为原料组分之一的乳液进行试验，以评估羧甲基壳聚糖对皮肤屏障损伤的修复情况。
[0158]
3.1、测试材料
[0159]
本实施例中基于羧甲基壳聚糖形成了一款乳液，包括如下重量百分含量的各原料物质：0.05wt％edta
‑
2na、0.2wt％tr
‑
2、3wt％1,3
‑
丁二醇、5wt％甘油、0.1wt％透明汉生胶dsm、0.1wt％γ
‑
pga、0.1wt％透明质酸钠、0.25wt％mha
‑
20、3wt％montanov l、0.5wt％tegocare 165、1wt％鲸蜡硬脂醇、5wt％辛酸甘油三酯、5wt％乳木果油、0.5wt％红没药醇、5wt％角鲨烷、0.2wt％精氨酸、3wt％simulgel ns、防腐剂适量(戊二醇5wt％)，其余为水。
[0160]
制备时，可以先将mha
‑
20溶于戊二醇水溶液中，然后与其他原料组分混合均匀。
[0161]
3.2、修复试验及效果数据。
[0162]
选取12只雄性裸鼠，8～10周大小，随机分3个样品组及一个空白对照组，先在裸鼠左右二侧皮肤3cm
×
3cm试验部位，用胶带连续粘贴快速撕下数次，直到皮肤出现小血点，停止黏撕即分别涂抹各个样品组，每天涂抹一次，连续涂抹5天后，将动物处死解剖取试验部位的皮肤组织，做病理切片镜检拍照。
[0163]
试验时，实验室温度为20～24℃，相对湿度为60～70％。
[0164]
试验结果如表7、图11、图12、图13、图14和图15所示。
[0165]
表7
[0166][0167]
表7中，样品组1采用如上述所述的含有mha
‑
20的乳液涂抹。样品组2采用rgf3000u/g的乳液涂抹。而对比组3采用不含有mha
‑
20的乳液涂抹，而是将0.25wt％mha
‑
20替换为0.25wt％的水。空白对照组中未涂抹任何物质。其中，rgf为表皮生长因子。
[0168]
图11为正常皮肤表皮角质层的组织形貌照片；图12为空白对照组中空
‑
1的皮肤表皮角质层的形貌照片，可以看出皮肤表皮角质层未见恢复；图13为样品组1中样品1
‑
1的皮肤表皮角质层形貌照片，可以看到，皮肤表皮角质层已经恢复。图14为样品组2中2
‑
1样品对应的皮肤表皮角质层形貌照片，由图14可以看出皮肤表皮角质层恢复。图15为对比组3中3
‑
1的皮肤表皮角质层的形貌照片，可以看出皮肤表皮角质层未见恢复。
[0169]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。