米糠活性肽在干预秀丽隐杆线虫衰老或肌肉损伤中的应用

1.本发明涉及蛋白领域，特别涉及米糠活性肽在干预秀秀丽隐杆线虫衰老或肌肉损伤上的应用。


背景技术：

2.米糠蛋白有优良的营养价值，但随着食物精细化，米糠成为了稻米加工过程的副产物。因此，对其进行深加工，对副产物进行增值再利用具有十分重要的意义。米糠活性肽是通过对米糠蛋白进行水解，从米糠中提取的具有一定生物活性的肽。米糠活性肽已经在清除体内活性氧、自由基及抗氧化方面取得了较好的效果。
3.秀丽隐杆线虫（c.elegans）是当今世界唯一一个身体中所有细胞都能被逐个盘点归类的生物，并且具有寿命短、身体透明易于观察、饲养成本低、容易获取大量同期化样本、可长期保存、实验可操作性强等优点，已经成为人们科研探索中常用的模式生物。
4.肌肉损伤是一种多见于老年人以及运动员的肌肉健康问题。它的特点是肌纤维横截面积、肌核数目的减少；蛋白质含量、肌肉强度的下降等，它也关联发病和死亡的风险增加。尽管进行了数十年的研究，但尚无有效的方法可预防肌肉质量下降。
5.经过查阅资料，未见我国有关于米糠活性肽对秀丽隐杆线虫衰老或肌肉损伤的相关文献研究，因此关于米糠活性肽在抗衰老或肌肉损伤方面的研究尚待探索。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供米糠活性肽在干预秀丽隐杆线虫衰老或肌肉损伤中的应用，为米糠活性肽的进一步开发利用与推广提供参考理论依据。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种米糠活性肽在干预秀丽隐杆线虫衰老或肌肉损伤上的应用，所述米糠活性肽序列为lys
‑
his
‑
asn
‑
arg
‑
gly
‑
asp
‑
glu
‑
phe。
8.所述的米糠活性肽干预线虫肌肉损伤的具体技术方案如下：游泳主要是对秀丽隐杆线虫体壁肌肉进行表征，通过游泳来判断米糠活性肽对体壁肌肉损伤的恢复作用。
9.实验分空白组、米糠活性肽低剂量组（0.05mm）、米糠活性肽中剂量组（0.1mm）、米糠活性肽高剂量组（0.3mm），每组30条线虫。l4期秀丽隐杆线虫挑至含有10μm地塞米松的ngm平板中（control组不含地塞米松）。地塞米松属于一种糖皮质激素。在这里我们将地塞米松作为一种构建肌肉损伤模型的损伤物。地塞米松作为构建肌肉损伤相关模型的药物最常见应用于细胞模型上，在近年来发表的文献中也有在小鼠上进行应用的。在实验过程中，我们以线虫的运动能力发生变化来评价造模的效果，为了证明其效果，我们从多个不同行为学指标来进行综合的判定，确定造模的成功。在造模过程中，为了说明该物质是造成一个群体范围的普遍损伤，因此我们不会选择性地挑选个别线虫。在20度下培养36h后，将线虫按组挑至只加了m9缓冲液的ngm平板中，其中m9缓冲液的配方如下：以1l计算，其中含有5g
氯化钠、3g磷酸二氢钾、6g磷酸氢二钠、0.12g硫酸镁。每组30条，待线虫适应5min后，将皿放置在荧光倒置显微镜下，40倍镜下用设备自带的摄像功能录制30s的视频，期间手动控制载物台操纵杆跟踪秀丽隐杆线虫的游泳。记录线虫游泳的频率，数据分析后绘图。游泳的频率计次按照其身体前半部分从左边摇晃到右边再晃回左边记为一次。
10.咽泵主要是对秀丽隐杆线虫咽部肌肉进行表征，通过咽泵来判断米糠活性肽对肌肉损伤的恢复作用。
11.实验分空白组、米糠活性肽低剂量组（0.05mm）、米糠活性肽中剂量组（0.1mm）、米糠活性肽高剂量组（0.3mm），每组30条线虫。l4期秀丽隐杆线虫挑至含有10μm地塞米松的ngm平板中（control组不含地塞米松）。我们同样使用地塞米松来作为损伤造模物质，造模过程类似体壁肌肉损伤造模。咽部肌肉损伤与体壁肌肉损伤是本技术人从不同的部位去评价其损伤的作用以及使用米糠活性肽保护的效果。在20度下培养36h后，将造模成功的线虫按组挑无食物的ngm平板中，每组30条，待线虫适应5min后，将皿放置在荧光倒置显微镜下100倍镜下用设备自带的摄像功能录制10s的视频，期间手动控制载物台操纵杆跟踪秀丽隐杆线虫的运动。记录线虫咽部小球上下晃动的频率，数据分析后绘图。晃动频率按照其咽部小球从上到下再回上去记为一次。此处使用无食物的ngm平板，是因为线虫的食物op50会在ngm板上形成一层菌膜。在实验过程中，我们发现线虫在含有食物的ngm板上，针对它咽泵的观察会有一定的影响。因此，为了便于实验观察和实验结果的准确，均使用无食物的ngm板。
12.头部摆动主要是对秀丽隐杆线虫头部肌肉进行表征，通过头部摆动来判断米糠活性肽对肌肉损伤的恢复作用。
13.实验分空白组、米糠活性肽低剂量组（0.05mm）、米糠活性肽中剂量组（0.1mm）、米糠活性肽高剂量组（0.3mm），每组30条线虫。l4期秀丽隐杆线虫挑至含有10μm地塞米松的ngm平板中（control组不含地塞米松），在20度下培养36h后，将线虫按组挑无食物的ngm平板中，我们同样使用地塞米松来作为损伤造模物质，造模过程类似体壁肌肉损伤造模。咽部肌肉损伤与体壁肌肉损伤是本技术人从不同的部位去评价其损伤的作用以及使用米糠活性肽保护的效果。一方面，为了确保损伤和保护的时间在各组间一致，一定要将线虫转移到新的平板上。而另一方面，线虫在带有食物的板子上爬行会受到食物的影响。因此，为了保证实验尽可能控制单一变量，选择将其转移至无食物平板。每组30条，待线虫适应5min后，将皿放置在荧光倒置显微镜下100倍镜下用设备自带的摄像功能录制10s的视频，期间手动控制载物台操纵杆跟踪秀丽隐杆线虫的运动。记录线虫头部摆动的次数，数据分析后绘图。头部摆动按照线虫头部轻点一次计数一次。
14.所述的米糠活性肽干预线虫寿命的具体技术方案如下：实验分空白组、米糠活性肽低剂量组（0.01mm）、米糠活性肽中剂量组（0.03mm）、米糠活性肽高剂量组（0.1mm），每组90条线虫。l4期秀丽隐杆线虫挑至将秀丽隐杆线虫挑至含有150μm五氟尿嘧啶的ngm平板中（五氟尿嘧啶用来抑制线虫的产卵），在20度下培养。前5天，每天将线虫转移到对应给药的新皿中（产卵期线虫需要及时转移，避免由于幼虫成长为成虫影响最后实验结果）。从第6天开始，每隔一天将存活的线虫转移到对应标记的新皿上培养。上述的新皿依旧为ngm板，其成分按照1l总体积计量，含有3g氯化钠、2.5g胰蛋白胨、20g琼脂粉以及浓度为1m的磷酸钾缓冲液（ph=6.0）25ml。每天观察记录线虫存活、死亡和丢失数目，直到所有线虫死亡，结束实验。实验过程中，由于操作失误转移死亡的线虫以及爬
到皿壁上的线虫都以丢失计。在实验后期，线虫常常不动，用挑虫棒触碰线虫头部，以受到外界刺激后无反应判定为死亡计数。
15.本发明所提供的米糠活性肽在干预秀丽隐杆线虫衰老或肌肉损伤上的应用，可以作为在食品、药品或保健品中的应用。
16.在使用米糠活性肽制备抗衰老产品或者治疗肌肉损伤的药物时可以根据实际需要，将有效量的米糠活性肽和药学上可接受的载体制备成各种剂型，如片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉剂等。
17.本发明还要求保护一种药物组合物，其主要成分为米糠活性肽。
18.本发明还要求保护所述药物组合物在制备干预秀丽隐杆线虫衰老或肌肉损伤的药物上的应用。
19.本发明所述的秀丽隐杆线虫拥有60
‑
80%的人类同源基因和至少42%的人类疾病相关基因，是探寻神经退行性疾病发生机制和治疗方法的理想模型。通过秀丽线虫寿命实验发现米糠活性肽可以干预秀丽线虫衰老，为其它天然来源活性肽的生物功能和分子机理以及其它抗衰老中药资源在抗衰老和治疗肌肉疾病药物领域的进一步开发利用提供了强有力的研发模型。
附图说明
20.图1为秀丽隐杆线虫游泳实验结果图，其中单因素方差分析，###：与con组相比，p<0.001；***：与dex组相比，p<0.001；图2为秀丽隐杆线虫咽泵实验结果图，单因素方差分析，###：与con组相比，p<0.001；***：与dex组相比，p<0.001；图3为秀丽隐杆线虫头部摆动实验结果图，单因素方差分析，###：与con组相比，p<0.001；***：与dex组相比，p<0.001；图4为秀丽隐杆线虫生存曲线结果图，单因素方差分析，*：与con组相比，p<0.05；**：与con组相比，p<0.01；图5为秀丽隐杆线虫寿命结果图，单因素方差分析，**：与con组相比，p<0.01；***：与con组相比，p<0.001；图6为对线虫进行活性氧ros测定结果图，独立样本t检验，*：与con组相比，p<0.05；图7为对线虫进行脂褐素测定结果图，独立样本t检验，**：与con组相比，p<0.01；图8为对线虫进行活性氧ros测定结果图，单因素方差分析，###：与con组相比，p<0.001；*：与dex组相比，p<0.05图9为对喂饲米糠活性肽的秀丽隐杆线虫和正常饲养的秀丽线虫进行转录组分析后得到下调基因的kegg代谢通路图；图10为对喂饲米糠活性肽的秀丽隐杆线虫和正常饲养的秀丽线虫进行转录组分析后得到上调基因的kegg代谢通路图；图11为klo
‑
1基因mrna相对表达量结果图，独立样本t检验，**：与con组相比，p<0.01；图12为klo
‑
1基因mrna相对表达量结果图，单因素方差分析，###：与con组相比，p<0.001；***：与dex组相比，p<0.001；
图13为klo
‑
1(ok2925)基因型秀丽隐杆线虫生存曲线结果图；图14为klo
‑
1(ok2925)基因型秀丽隐杆线虫活性氧ros测定结果图，独立样本t检验，**：与con组相比，p<0.01。
具体实施方式
21.实施例1米糠活性肽的提取米糠经过榨油获得剩余废渣，将废渣烘干后粉碎获得脱脂米糠粉末。将脱脂米糠粉末过60目筛后以料液比1:10加水并调节ph为9，恒温40度水浴4h。8000r/min离心15min后取上清将ph调节至4，同等条件离心后取沉淀。水洗三次后调节ph到7，冷冻干燥48h后分级提取获得谷蛋白。谷蛋白加水溶解后得到5%谷蛋白悬浮液，调节ph后恒温酶解。酶解完成后85度灭酶10min，3500r/min离心15min后取上清液真空浓缩冷冻干燥获得米糠蛋白酶水解产物。使用sp
‑
sephadex g
‑
25离子交换层析进一步洗脱米糠蛋白酶水解产物得到7个组分(pa
‑
pg),选择pf组分用sephadex g
‑
15凝胶层析将其分离得到pf1、pf2、pf3。利用制备rp
‑
hplc对pf3进一步分成5个组分后得到pf3
‑
γ，冷冻干燥后获得物质即为实验后续所用米糠活性肽。具体参数参考本发明人已经授权的专利文件：中南林业科技大学. 一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法:中国，cn106636274b[p].2021
‑
06
‑
11。
[0022]
实施例2线虫的复苏与常规培养从
‑
80 ℃超低温冰箱取出线虫冻存管，于室温自然解冻。完全解冻后，将其转移至离心管，以2000r/min离心2min，弃上清，剩下的液体混匀后用移液枪加到涂有e .coli op50的ngm平板上，旋转平板使其分布均匀，置于20
°
c培养箱恒温培养，湿度控制在40
‑
60%。根据平板上食物以及实验需要进行传代。
[0023]
实施例3线虫同质化流程为保证实验的准确性，在进行每一批实验前，需要将线虫同质化处理，以保证其生长阶段的一致。准备2
‑
3个培养秀丽隐杆线虫的培养皿。待部分线虫进入产卵期，使用m9缓冲液将线虫全部洗下转移至离心管中，以2000r/min离心2min，弃上清后按照5m的氢氧化钠：次氯酸钠为1:2的比例进行配置，混匀后加入离心管中。上下颠倒混匀，使虫体与裂解液充分接触。过程中注意观察，待液体从浑浊变澄清即到达裂解终点。随即以2000r/min离心2min，弃上清，加入m9缓冲液混匀后离心洗涤虫卵，该过程重复3次。将沉淀吸出置于含有op50的ngm平板上，待14h左右虫卵孵化即得到同质化线虫。
[0024]
实施例4秀丽隐杆线虫游泳实验1、待虫卵孵化后培养约2天至l4期，将秀丽隐杆线虫挑至含有10μm地塞米松的ngm平板中（空白对照（control）组不含地塞米松）。灭活op50依次含有0、0.05mm、0.1mm、0.3mm的大米活性肽。在这里我们将地塞米松作为一种构建肌肉损伤模型的损伤物。地塞米松作为构建肌肉损伤相关模型的药物最常见应用于细胞模型上，在近年来发表的文献中也有在小鼠上进行应用的。在实验过程中，我们以线虫的运动能力发生变化来评价造模的效果，为
了证明其效果，我们从多个不同行为学指标来进行综合的判定，确定造模的成功。在造模过程中，发现该物质是造成一个群体范围的普遍损伤。
[0025]
2、在20度下培养36h后，将造模成功的线虫按组挑至只加了m9缓冲液的ngm平板中，其中m9缓冲液的配方如下：以1l计算，其中含有5g氯化钠、3g磷酸二氢钾、6g磷酸氢二钠、0.12g硫酸镁。每组30条，待线虫适应5min后，将皿放置在荧光倒置显微镜下，40倍镜下用设备自带的摄像功能录制30s的视频，期间手动控制载物台操纵杆跟踪秀丽隐杆线虫的游泳。
[0026]
3、录制完成后使用0.5倍慢速播放，记录线虫游泳的频率，数据分析后绘图。游泳的频率计次按照其身体前半部分从左边摇晃到右边再晃回左边记为一次。所有数据绘图均使用graphpad prism，数据分析使用spss。
[0027]
结果：如图1所示。游泳主要是对秀丽隐杆线虫体壁肌肉进行表征。与损伤组相比，0.05mm、0.1mm、0.3mm的米糠活性肽保护组分别将秀丽隐杆线虫游泳频次提高了28.8%、50.1%、54.4%。通过给予米糠活性肽，能够显著提高秀丽隐杆线虫的游泳次数，说明其对其体壁肌肉损伤具有较好的恢复作用，并且随着其浓度的升高，游泳次数随之增加，说明肌肉恢复能力更强。而米糠活性肽保护中剂量组和高剂量组相较于空白对照组，游泳频次提高了5.84%和8.84%。说明米糠活性肽能够将肌肉恢复的比正常的空白对照组还要好，说明其效果显著。
[0028]
实施例5秀丽隐杆线虫咽泵实验1、待虫卵孵化后培养约2天至l4期，将秀丽隐杆线虫挑至含有10μm地塞米松的ngm平板中（空白对照（control）组不含地塞米松）。灭活op50依次含有0、0、0.05mm、0.1mm、0.3mm的大米活性肽。
[0029]
2、在20度下培养36h后，将造模成功的线虫按组挑至无食物的ngm平板中，每组30条，待线虫适应5min后，将平板放置在荧光倒置显微镜下，100倍镜下用设备自带的摄像功能录制10s的视频，期间手动控制载物台操纵杆跟踪秀丽隐杆线虫的运动。
[0030]
3、录制完成后使用0.25倍慢速播放，记录线虫咽部小球上下晃动的频率，数据分析后绘图。晃动频率按照其咽部小球从上到下再回上去记为一次。
[0031]
结果：如图2所示。咽泵主要是对秀丽隐杆线虫咽部肌肉进行表征，与损伤组相比，0.05mm、0.1mm、0.3mm的米糠活性肽保护组分别将秀丽隐杆线虫咽泵频率提高了18.0%、36.6%、34.6%。甚至与空白对照相比，三个组依次提高咽泵频率8.3%、25.3%和23.5%。说明通过给予米糠活性肽，能够显著提高秀丽隐杆线虫的咽泵频率，且效果还优于未损伤的空白对照组。证明米糠活性肽对其咽部肌肉损伤具有较好的恢复作用，并且0.1mm的浓度下效果最佳。而0.3mm的米糠活性肽保护组的效果相比0.1mm的米糠活性肽组有所下降，说明对于咽部肌肉而言，米糠活性肽的作用效果并不是随着浓度增加而持续升高，在某一浓度的作用效果达到最佳后，后面更高浓度反而略显下降趋势。产生这种现象，可能是与米糠活性肽结合的位点有限，在所有可结合位点都已经结合后。多余的米糠活性肽不能再被利用，从而成为一种过量状态。
[0032]
实施例6秀丽隐杆线虫头部摆动实验
1、待虫卵孵化后培养约2天至l4期，将秀丽隐杆线虫挑至含有10μm地塞米松的ngm平板中（control组不含地塞米松）。灭活op50依次含有0、0、0.05mm、0.1mm、0.3mm的大米活性肽。
[0033]
2、在20度下培养36h后，将造模成功的线虫按组挑至无食物的ngm平板中，每组30条，待线虫适应5min后，将皿放置在荧光倒置显微镜下，40倍镜下用设备自带的摄像功能录制30s的视频，期间手动控制载物台操纵杆跟踪秀丽隐杆线虫的头部摆动。
[0034]
3、录制完成后使用0.5倍慢速播放，记录线虫头部摆动的次数，数据分析后绘图。头部摆动按照线虫头部轻点一次计数一次。
[0035]
结果：如图3所示。头部摆动主要是对秀丽隐杆线虫头部肌肉进行表征。与损伤组相比，0.05mm、0.1mm、0.3mm的米糠活性肽保护组分别将秀丽隐杆线虫头部摆动频率提高了23.9%、52.7%和37.2%。而米糠活性肽保护中剂量组和高剂量组相较于空白对照组，头部摆动频率提高了13.8%和2.24%。通过给予米糠活性肽，能够显著提高秀丽隐杆线虫的头部摆动次数，说明米糠活性肽对其头部肌肉损伤具有较好的恢复作用，且在0.1mm的浓度下米糠活性肽效果最佳，比未受损伤的空白对照组更好。而0.3mm的米糠活性肽保护组的效果相比0.1mm的米糠活性肽组有所下降，说明对于头部肌肉而言，类似咽部肌肉，米糠活性肽的作用效果并不是随着浓度增加而持续升高，在某一浓度的作用效果达到最佳后，后面更高浓度反而略显下降趋势。
[0036]
实施例7秀丽隐杆线虫寿命实验1、实验分空白组、米糠活性肽低剂量组（0.01mm）、米糠活性肽中剂量组（0.03mm）、米糠活性肽高剂量组（0.1mm），每组90条线虫。l4期秀丽隐杆线虫挑至将秀丽隐杆线虫挑至含有150μm五氟尿嘧啶的ngm平板中（五氟尿嘧啶用来抑制线虫的产卵），在20度下培养。
[0037]
2、每组60条，在20度下恒温培养。前5天，每天将线虫转移到对应给药的新皿中（产卵期线虫需要及时转移，避免由于幼虫成长为成虫影响最后实验结果）。从第6天开始，每隔一天将存活的线虫转移到对应标记的新皿上培养，上述的新皿依旧为ngm板，其成分按照1l总体积计量，含有3g氯化钠、2.5g胰蛋白胨、20g琼脂粉以及浓度为1m的磷酸钾缓冲液（ph=6.0）25ml。每天观察记录线虫存活、死亡和丢失数目，直到所有线虫死亡，结束实验。
[0038]
3、实验过程中，由于操作失误转移死亡的线虫以及爬到皿壁上的线虫都以丢失计。在实验后期，线虫常常不动，用挑虫棒触碰线虫头部，以受到外界刺激后无反应判定为死亡计数。
[0039]
结果：如图4所示。秀丽隐杆线虫的寿命是其健康生理状态的表征，通过给予秀丽隐杆线虫米糠活性肽的保护，能够发现同一天数下，米糠活性肽处理的线虫存活率显著提升。以第18天为例，空白对照组存活率为71%，米糠活性肽低剂量组与其存活率一致，而中剂量组与高剂量组依次为76%和91%。与空白对照组相比，中、高剂量组分别提高5%和20%。并且线虫的寿命得以延长，根据每组中线虫的最长寿命，空白组、米糠活性肽低剂量组（0.01mm）、米糠活性肽中剂量组（0.03mm）、米糠活性肽高剂量组（0.1mm）的线虫的寿命分别为24天、25天、27天和28天。经过数据分析得到各组线虫半数存活率依次为20、20、21、22，再次强化验证线虫生存天数的增加。
[0040]
对每组每条线虫的寿命进行统计，得到结果如图5所示。四个组线虫平均寿命依次
为19.04天、19.46天、20.39天和22.27天。与空白对照组相比，米糠活性肽低、中、高三个剂量组的平均寿命，依次提高了2.23%、7.08%和16.94%。以上数据充分说明了米糠活性肽对延长秀丽隐杆线虫的寿命具有较好的效果。
[0041]
实施例8对线虫进行活性氧ros测定将同期化的秀丽隐杆线虫正常培养至l4期。将秀丽隐杆线虫挑至ngm平板中。空白和保护组分别在灭活op50中含有0和0.1mm的大米活性肽，在20度下培养48h后，使用挑虫针将线虫转移到含有100μlm9缓冲液的ep管中，上下晃匀后离心弃上清。重复该过程2次进行清洗。弃去上清后加入100μl的ros荧光探针即dcfh
‑
da(购自biosharp)，25度孵育30min，孵育过程中上下颠倒充分混合。孵育完成后离心弃上清，使用m9缓冲液清洗2次。后使用移液枪将虫体与液体混匀后吸出滴加在琼脂垫片上，同时在有虫子区域滴加2%左旋咪唑麻醉线虫。将琼脂垫片放置在荧光倒置显微镜下，4倍镜下用设备拍摄。后使用image j进行处理分析。
[0042]
活性氧是氧化应激最直接的表征指标。对线虫进行活性氧检测，通过对荧光强度进行定量分析，结果如图6所示，可以发现：与空白对照组相比，喂饲浓度0.1mm米糠活性肽的组活性氧产生量下降了11.4%。说明喂饲米糠活性肽能够显著降低线虫体内活性氧水平，证实米糠活性肽确实在氧化应激方面发挥了一定的作用。
[0043]
实施例9对线虫进行脂褐素测定将同期化的秀丽隐杆线虫正常培养至l4期。将秀丽隐杆线虫挑至ngm平板中。空白和保护组分别在灭活op50中含有0和0.1mm的大米活性肽，在20度下培养48h后，使用挑虫针将线虫转移到含有100μlm9缓冲液的ep管中，上下晃匀后离心弃上清。重复该过程2次进行清洗。后使用移液枪将虫体与液体混匀后吸出滴加在琼脂垫片上，同时在有虫子区域滴加2%左旋咪唑麻醉线虫。将琼脂垫片放置在荧光倒置显微镜下，4倍镜下用设备拍摄。后使用image j进行处理分析。
[0044]
脂褐素是表征衰老相关的指标。通过对其进行测定后的定量分析，结果如图7所示，喂饲浓度0.1mm米糠活性肽组相较于空白对照组脂褐素产生量下降了20.7%，说明米糠活性肽能够极显著的降低脂褐素的产生，证实米糠活性肽在抵抗衰老方面有良好的效果。而脂褐素的结果也与线虫在延长衰老的作用上一致。
[0045]
实施例10对线虫进行活性氧ros测定将同期化的秀丽隐杆线虫正常培养至l4期。将秀丽隐杆线虫挑至依次含有10μm地塞米松的ngm平板中（control组不含地塞米松）。灭活op50依次含有0、0、0.1mm的大米活性肽，在20度下培养36h后，使用挑虫针将线虫转移到含有100μlm9缓冲液的ep管中，上下晃匀后离心弃上清。重复该过程2次进行清洗。弃去上清后加入100μl的ros荧光探针即dcfh
‑
da，25度孵育30min，孵育过程中上下颠倒充分混合。孵育完成后离心弃上清，使用m9缓冲液清洗2次。后使用移液枪将虫体与液体混匀后吸出滴加在琼脂垫片上，同时在有虫子区域滴加2%左旋咪唑麻醉线虫。将琼脂垫片放置在荧光倒置显微镜下，4倍镜下用设备拍摄。后使用image j进行处理分析。
[0046]
同样的，在对线虫进行活性氧检测，通过对荧光强度进行定量分析后，结果如图8所示，可以发现：与空白对照组相比，地塞米松的损伤会导致活性氧的急速增加，其相对荧光强度从19.1上升至37.7。而损伤同时通过喂饲浓度0.1mm米糠活性肽的线虫组活性氧产生量从37.7降低至31.6，但还是远高于空白对照组。说明米糠活性肽确实在地塞米松损伤后所导致的氧化应激方面发挥了一定的作用，但降低活性氧的水平略低，说明米糠活性肽并非通过抗氧化应激来达到降低肌肉损伤。
[0047]
实施例11对喂饲米糠活性肽的秀丽隐杆线虫和正常饲养的秀丽线虫进行转录组分析待虫卵孵化后培养约2天至l4期，将秀丽隐杆线虫用m9缓冲液洗下，以2000r/min离心2min后弃上清，使线虫悬浮在液体中，使用移液枪滴加到含有150μm五氟尿嘧啶的ngm平板上（五氟尿嘧啶用来抑制线虫的产卵），在20度下培养。由于前期实验综合考虑发现0.1mm浓度效果最佳。因此实验分空白组、米糠活性肽高剂量组（0.1mm），培养2天后使用m9缓冲液将线虫洗至离心管中，以2000r/min离心2min后弃上清。将液体转移至无菌无酶管中。管子保存在干冰中送样寄出，后续检测以及分析报告由武汉康测公司完成。
[0048]
对差异表达基因分布以及集中通路分析后，结果如图9
‑
图10所示，图9为下调基因的kegg代谢通路图。通过因子关联紧密程度和富集程度综合评价，从上而下富集的通路依次为淀粉和蔗糖代谢、鞘脂代谢、视黄醇代谢、嘌呤代谢和卟啉和叶绿素代谢。而图10为上调基因的kegg代谢通路图。自上而下富集通路依次为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的降解、色氨酸代谢、rna降解、丙酮酸代谢和苯丙氨酸代谢。综合两张图说明大米活性肽喂饲能够延长线虫寿命，更多可能是由代谢途径中的因子发生变化所导致。对差异表达基因的kegg pathway富集分析发现，发生变化的调控基因位点如klo
‑
1、tre
‑
3主要分布于代谢途径，特别是糖代谢途径。
[0049]
实施例12klo
‑
1基因mrna相对表达量实验组所有线虫被m9 缓冲液洗下，沉淀后去上清，重复洗涤3次。尽可能吸走离心管中的m9缓冲液。每管加入1ml rnaex 裂解液（rnaex提取试剂，购自湖南艾科瑞生物有限公司），放入液氮中速冻，室温下溶解，反复冻融4
‑
5次，待虫子完全破碎后8000r/min 离心5min，小心吸取取上清液，注意不要吸取到下层有机相。后续rnaex提取试剂说明书进行操作。提取的总rna进行逆转录，按照反转录试剂盒（购自湖南艾科瑞生物有限公司）说明书操作。未使用完毕的rna溶液可保存在
‑
80℃，cdna保存于
‑
20℃。提取的cdna按照sybr试剂盒（购自湖南艾科瑞生物有限公司）说明书进行逆实时定量操作。
[0050]
经过转录组数据分析，先前发现米糠活性肽发挥作用主要是在糖代谢方面。因此，我们通过rt
‑
pcr对其中的klo
‑
1基因进行验证。线虫的处理过程同实施例11一致。如图11，通过对未损伤的线虫的空白组、米糠活性肽高剂量组（0.1mm）保护组定量分析，可以发现klo
‑
1的表达量在保护组中有显著的下降。与未损伤的对照组相比，保护组下降了30.1%，说明米糠活性肽对于延长寿命、抵抗衰老的作用更与糖代谢通路关系更为密切，这与转录组测序结果也具有一致性。
[0051]
由于先前发现米糠活性肽发挥作用主要是在糖代谢方面。因此，我们也同样在地塞米松损伤后的线虫中对其中的klo
‑
1基因进行验证。线虫的处理过程同实施例10一致。通
过定量分析，结果如图12所示，可以发现klo
‑
1的表达量在损伤组具有明显的升高。相较于对照组，损伤组ko
‑
1表达量上升了25.3%，而经过米糠活性肽保护后下降了16.7%。米糠活性肽保护组恢复到与对照组无差异的水平。这进一步验证了米糠活性肽对于地塞米松所导致的肌肉损伤的作用更可能是与糖代谢通路相关。
[0052]
实施例13klo
‑
1基因敲除型秀丽隐杆线虫寿命实验实验分为两组，空白对照组和0.1mm米糠活性肽保护组，每组90条线虫。两组均使用klo
‑
1(ok2925)（线虫名称vc2175，购自美国cgc秀丽隐杆线虫遗传中心)基因敲除型线虫。l4期秀丽隐杆线虫挑至将秀丽隐杆线虫挑至含有150 μm五氟尿嘧啶的ngm平板中（五氟尿嘧啶用来抑制线虫的产卵），在20℃下培养。后续步骤同上实施例7.通过使用klo
‑
1基因敲除的秀丽隐杆线虫株klo
‑
1（ok2925）来验证对线虫寿命的影响。如图13，在klo
‑
1基因敲除后，对照组与0.1mm的米糠活性肽保护组在平均寿命上分别为7.99天和8.19天，分析后并无差异，说明klo
‑
1基因敲除后，米糠活性肽无法对线虫的寿命产生有益的作用。由此可以证明米糠活性肽发挥延长寿命的作用是通过klo
‑
1基因调控的。
[0053]
实施例14对klo
‑
1基因敲除型线虫进行活性氧ros测定将同期化的klo
‑
1线虫正常培养至l4期。实验设空白对照组和0.1mm米糠活性肽保护组，将秀丽隐杆线虫挑至ngm平板中。在20℃下培养48h后，使用挑虫针将线虫转移到含有100μlm9缓冲液的ep管中，上下晃匀后离心弃上清。重复该过程2次进行清洗。后续步骤同上实施例8。
[0054]
通过对荧光强度进行定量分析，结果如图14所示，可以发现：与正常饲养的klo
‑
1线虫对照组相比，对klo
‑
1线虫喂饲浓度0.1mm米糠活性肽的组活性氧降低，下降了7.34%，与未敲除klo
‑
1基因的线虫的活性氧的下降程度类似。说明klo
‑
1基因与米糠活性肽对氧化应激的有益作用无关。
[0055]
综上，米糠活性肽能够对由地塞米松所构建的肌肉损伤秀丽隐杆线虫运动能力恢复起到显著的效果，并且只喂饲米糠活性肽能够延长线虫的寿命。说明米糠活性肽在干预肌肉损伤和延长寿命方面均具有良好效果。通过对线虫进行脂褐素测定发现喂饲米糠活性肽确实能够极显著的降低其含量，这与线虫寿命延长的结果相对应。而通过对两种不同情况下进行活性氧测定，均发现米糠活性肽在氧化应激方面也能起到一定的作用，但效果较小。经过转录组分析发现，喂饲米糠活性肽对线虫发挥作用的途径主要集中在代谢通路。从中选取与糖代谢相关的klo
‑
1基因进一步验证发现，klo
‑
1基因在给予米糠活性肽保护后出现非常明显的下降，这与转录组分析数据结果一致。而后通过使用klo
‑
1基因敲除型线虫验证在寿命与活性氧的效果发现，klo
‑
1敲除后喂饲米糠活性肽无法再起到延长寿命的作用，而klo
‑
1敲除对活性氧的产生上却并没有什么影响。也能更强力地说明米糠活性肽在干预肌肉损伤和延长寿命方面的作用更可能是经由糖代谢途径发挥，而非氧化应激。
[0056]
综上实验结果发现，未损伤的线虫用米糠活性肽进行处理后测了ros和脂褐素，发现降低脂褐素效果明显但降低ros效果不明显。同时，经过损伤造模的线虫用米糠活性肽进行处理后，其降低ros效果也不明显，明显达不到修复的效果。送样检测，发现表达通路集中
在代谢途径中，根据结果选择衰老相关基因和损伤相关基因进行验证，说明米糠活性肽的恢复肌肉损伤或延长寿命方面作用发挥与糖代谢途径关系更密切。
[0057]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。