DUSP6抑制剂BCI在制备骨质疏松药物中的应用

dusp6抑制剂bci在制备骨质疏松药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及dusp6抑制剂特别是化合物bci在制造预 防和治疗骨质疏松药物中的用途。


背景技术：

2.骨质疏松症已成为我国50岁以上人群的重要健康问题，中老年女性骨质疏松 问题尤为严重。2018年10月19日，国家卫健委首次发布的中国骨质疏松症流行病 学调查结果显示，我国65岁以上女性逾半数患有骨质疏松症；近半数50岁以上人 群表现为低骨量和密度，是骨质疏松症的高危人群，而居民对骨质疏松症的认知普 遍不足。骨质疏松症是影响居民健康最常见的骨骼疾病，疾病早期通常没有明显的 临床表现，如果不引起重视，随着病情的进展可导致疼痛、脊柱变形和骨折等情况， 致残致死率高，严重影响患者生活质量，也导致巨大的医疗和护理成本。
3.目前治疗骨质疏松症双膦酸盐类、降钙素类、选择性雌激素受体调节剂、雌激 素类和活性维生素d类药物。尽管抗骨质疏松治疗取得了较大的进展，但由于上述 传统药物有害的副作用，其远期效果仍不令人满意。
4.骨质疏松症是一种常见和多发的骨骼疾病，其原因是骨重塑失衡，与破骨细胞 骨吸收活动增强和成骨细胞骨生成能力不足有关。破骨细胞前体来源于造血干细胞 的单核细胞/巨噬细胞谱系，在巨噬细胞集落刺激因子(m
‑
csf)和核因子κb受体 激活因子(nf
‑
κb)配体(rankl)的存在下逐渐分化为成熟的破骨细胞。在破骨 细胞形成过程中，m
‑
csf与csf
‑
1受体的结合保证了细胞的增殖，rankl与其受体 rank的作用促进了破骨细胞的成熟和吸收。破骨细胞前体表面rankl
‑
rank的相互 作用导致一系列下游信号的激活，包括与nf
‑
κb和丝裂原活化蛋白激酶(mapks)。 这些信号启动了破骨细胞的激活与分化。除此之外，信号传感器和转录激活因子3 (stat3)通过调节nf
‑
κb通路在破骨细胞形成过程中也发挥着重要的作用。以上 各种信号通路协同激活破骨细胞形成中的关键转录因子，如c
‑
fos和nfatc1。因此， 抑制这些信号通路可能有助于骨质疏松症的治疗。最近，针对破骨细胞骨吸收活性 或成骨细胞骨形成的新药物(如双磷酸盐、降钙素和狄诺塞麦等)已经被广泛开发 探索并用于预防和治疗骨质疏松症。然而，大多数治疗药物会导致严重的副作用， 阻碍了它们的长期应用和患者的良好依从性。因此，迫切需要开发可提高疗效和降 低毒性的替代方法来预防和治疗骨质疏松症。
5.双特异性磷酸酶6(dusp6)是一种丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶，与多种细胞 功能紧密相关，包括细胞增殖和分化。目前关于dusp6的研究方向主要集中在肿 瘤和免疫的治疗，然而其在破骨细胞分化相关疾病中的作用尚不清楚。本发明在 研究中发现dusp6的转录和翻译水平在破骨细胞形成与分化过程中显著升高，并 且敲除dusp6显著抑制破骨细胞的形成。此外，选择性dusp6抑制剂(e/z)
‑
bci 盐酸盐(bci)可在体外减弱rankl介导的破骨细胞分化，缓解双侧卵巢切除诱 导的骨质疏松小鼠的骨丢失，且无明显肝肾毒性。具体来说，bci在破骨细胞分 化的过程中以剂量依赖的方式破坏破骨细胞的融合和噬骨活性，并
降低破骨细胞 特异性基因的mrna和蛋白水平，基于转录组测序的gsea、kegg富集分析和 western blot结果表明，bci通过抑制stat3和nf
‑
κb信号通路并减弱nf
‑
κ b/p65与nfatc1的相互作用从而抑制rankl诱导的破骨细胞生成。这些结果表明， dusp6抑制可预防绝经后骨质疏松症，有望成为一种新的骨质疏松治疗方法，为 此完成本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供dusp6抑制剂bci在制备防治骨质疏松药物中的应 用。为骨质疏松患者提供了一种新的潜在治疗手段。
7.本发明提供如下实施方案：
8.在一实施方案中，dusp6抑制剂在制造预防和治疗骨质疏松药物中的用途， 所述dusp6抑制剂抑制rankl诱导的破骨细胞分化。
9.优选的，本发明所述的用途，所述dusp6抑制剂能抑制破骨细胞的形成、 融合和骨吸收活性。所述dusp6抑制剂为化合物bci或其顺反异构体和其药用 盐。
10.在另一实施方案中，本发明提供了化合物bci或其顺反异构体(如e或z 构型)和其药用盐在制造预防和治疗骨质疏松药物中的用途。
11.化合物bci的化学结构式如下：
[0012][0013]
双特异性磷酸酶6(dusp6)是一种丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶，与多种细胞 功能紧密相关，包括细胞增殖和分化。目前关于dusp6的研究方向主要集中在肿 瘤和免疫的治疗，然而其在破骨细胞分化相关疾病中的作用尚不清楚。本发明在 研究中发现dusp6的转录和翻译水平在破骨细胞形成与分化过程中显著升高，并 且敲除dusp6显著抑制破骨细胞的形成。此外，选择性dusp6抑制剂(e/z)
‑
bci 盐酸盐(bci)可在体外减弱rankl介导的破骨细胞分化，缓解双侧卵巢切除诱 导的骨质疏松小鼠的骨丢失，且无明显肝肾毒性。具体来说，bci在破骨细胞分 化的过程中以剂量依赖的方式破坏肌动蛋白环的形成和噬骨活性，并降低破骨细 胞特异性基因和蛋白水平。基于转录组测序的kegg、gsea分析和western blot 结果表明，bci通过抑制stat3和nf
‑
κb信号通路并减弱nf
‑
κb/p65与nfatc1 的相互作用从而抑制rankl诱导的破骨细胞生成。这些结果表明，dusp6抑制可 预防绝经后骨质疏松症，可能是治疗骨质疏松症的一种有效方法。
[0014]
本发明研究了dusp6在骨稳态调节中的作用，探究了bci抑制rankl诱导的 破骨细胞分化及其调节机制，证明了dusp6抑制以浓度依赖的方式抑制破骨细胞 的形成、融合和骨吸收活性。此外，本发明还发现bci介导的dusp6抑制缓解了 卵巢切除术(ovx)诱导的骨质疏松小鼠模型的骨丢失。这些研究结果表明靶向 dusp6可能是一种全新的骨质疏松症治
疗策略。
附图说明
[0015]
图1为dusp6在rankl诱导的破骨细胞分化中的作用实验结果；
[0016]
图2化合物bci对bmms及raw264.7细胞活性、凋亡、周期及对破骨细胞的 形成与分化的影响实验结果；
[0017]
图3化合物bci抑制了rankl介导的nfatc1核转位以及破骨细胞分化标志基 因的表达实验结果；
[0018]
图4使用化合物bci抑制dusp6对破骨细胞融合和骨吸收活性的影响实验结果；
[0019]
图5经过化合物bci处理的raw264.7细胞在破骨细胞分化过程中的转录组变 化分析结果；
[0020]
图6化合物bci通过降低stat3和nf
‑
κb
‑
nfatc1信号从而抑制rankl诱导 的破骨细胞分化实验结果；
[0021]
图7化合物bci对破骨细胞分化过程中p
‑
p38，p
‑
jnk，p
‑
erk水平的影响实验 结果；
[0022]
图8特定浓度的化合物bci不影响成骨细胞活性及分化实验结果；
[0023]
图9化合物bci在体内缓解了ovx诱导的骨质疏松小鼠模型的骨丢失实验结果；
[0024]
图10化合物bci影响破骨细胞分化的机制示意图，图中：bci通过抑制stat3 和nf
‑
κb
‑
nfatc1信号负向调控mmp9、trap的表达，进而产生抑制破骨细胞分化 的效果。
具体实施方式
[0025]
以下实施例用于具体阐明本发明，以帮助理解本发明的精神实质。
[0026]
本发明采用药品和试剂如下：
[0027]
(e/z)
‑
bci盐酸盐购自mce公司(中国上海)，溶于dmso。dmem、α
‑
mem 和胎牛血清(fbs)均购自hyclone公司(美国)。重组小鼠rankl和m
‑
csf购 自美国的r&d公司。针对dusp6的一抗来自abcam公司(英国)。抗β
‑
微管蛋 白、甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶(gapdh)、phospho
‑
nf
‑
κb/p65、nf
‑
κb/p65、p
‑
iκ bα、iκbα、p38、p
‑
erk、erk、ctsk、mmp9和c
‑
fos抗体从protetech公司(中 国武汉)购得。p
‑
jnk、jnk和p
‑
p38特异性一抗购自affinity biosciences公司 (中国镇江)。抗p
‑
stat3和stat3抗体购自南京生物世界公司。抗nfatc1抗体 来自santa cruz(美国)。抗兔和抗小鼠的酶标二抗购自上海碧云天公司。
[0028]
实施例1
[0029]
细胞培养和破骨细胞分化
[0030]
小鼠巨噬细胞raw264.7来源于atcc细胞库(中国上海)，在dmem(10％胎 牛血清和1％p/s)中培养。从小鼠股骨和胫骨分离骨髓单核巨噬细胞(bmms)， 并在α
‑
mem(10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素双抗和50ng/ml m
‑
csf)中培养48 小时。所有细胞在5％co2下37℃下培养。在进行破骨细胞诱导前5h通过 lipofectamine 3000(invitrogen公司)转染dusp6特异性小干扰rna(sirna) 寡核苷酸(40nm；5
’‑
cgaugcuuacgacauuguuaattuuaacaaugucguaagcaucgtt
‑3’
) (上海生工)。这两种细胞类型的分化均使用m
‑
csf(50ng/ml)和rankl(100 ng/ml)。分别在诱导第3天和第5天测定raw264.7细胞和bmms的破骨细胞分化的 程度。mc3t3
‑
e1细胞(前成骨细胞系)在α
‑
mem(10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素 双抗)中生长，
使用含抗坏血酸(60μg/ml)和β
‑
甘油磷酸酯(6mm)的成骨诱导 液对成骨细胞进行诱导。
[0031]
细胞毒性检测
[0032]
采用细胞计数试剂盒
‑
8(cck
‑
8)检测bci的细胞毒性，寻找适宜浓度。在96 孔板上接种raw264.7细胞和bmms，在0～8μm剂量的bci中培养1～3天后评估细 胞的活力。用pbs洗涤细胞，并将细胞在cck
‑
8溶液中培养1.5小时至2小时。使 用分光光度计(bio
‑
tek，美国)在450nm处读取吸光度。
[0033]
采用流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞周期情况。1.5
×
106个raw264.7在 含或不含bci(2～4μm)的分化培养基上培养3天。用pbs洗涤细胞并在70％乙 醇中固定，然后按照标准程序进行碘化丙啶(pi)染色，并使用facstar流式细胞 仪(becton dickinson，美国)进行检测。对于细胞凋亡率检测，采用annexin v/pi 对细胞进行染色并采用流式细胞仪检测。
[0034]
trap染色
[0035]
依前所述，raw264.7细胞和bmms接种在96孔板中生长并向破骨细胞分化。观 察到多核破骨细胞形成后进行trap染色(trap染色试剂盒，sigma，美国)。使用 光学显微镜计数细胞，并考虑包含3个或更多细胞核的trap+细胞为成熟的破骨细胞。
[0036]
fak染色
[0037]
96孔板中的细胞用pbs冲洗，在37℃下用4％多聚甲醛固定30分钟，然后用 洗涤缓冲液洗涤两次，然后用triton x
‑
100破膜。接着，再次洗涤细胞，用2％bsa 封闭20分钟。用四甲基罗丹明结合的鬼笔环肽染色1.5小时后，用洗涤液洗涤2次。 用dapi进行核复染色。荧光图像由荧光显微镜显示。
[0038]
骨陷窝形成实验
[0039]
在牛皮质骨切片上接种bmms，并根据实验要求进行诱导。诱导8天后，用 次氯酸钠冲洗骨片，后在甲苯胺蓝中孵育5分钟，后用显微镜观察骨陷窝形成情 况，由imagej软件对相对吸收面积进行定量。
[0040]
碱性磷酸酶和茜素红s染色
[0041]
mc3t3
‑
e1细胞在24孔板上培养，并在成骨培养基中诱导。诱导成功后，细胞 在70％乙醇中固定30分钟，用去离子水冲洗2次。采用nbt/bcip底物体系评估 alp活性。茜素红s染色时，如前所述制备细胞，然后将细胞在茜素红染色液中染 色。使用倒置显微镜获取图像。
[0042]
rna提取和qrt
‑
pcr
[0043]
使用trizol缓冲液获得rna，使用nanodrop nd
‑
1000酶标仪(thermo，英 国)测定浓度。用primescript
tm
逆转录酶(takara，日本)合成cdna。随后将22l 的cdna与sybr green super mix和对应引物混合。以gapdh为参照，检测dusp6、 ctsk、c
‑
fos、mmp9、nfatc1、cd9、oscar、pu.1、atp6v0d2、runx2、col1α1、 alpl的表达。所有引物序列列于表1。
[0044]
表1.qrt
‑
pcr引物序列
[0045][0046]
转录组测序和生物信息学分析
[0047]
采用rna
‑
seq检测raw264.7细胞在含或不含2μm bci的分化培养基中诱导3 天后的基因表达情况。测序由上海生工公司使用hiseqtm 2500系统(illumina)进 行。使用degseq r软件包进行数据分析，差异表达基因(degs)的阈值为|logfc|>1， p<0.05。使用clusterprofiler r包对基因本体(go)注释和京都基因与基因组 百科全书(kegg)进行富集分析。使用h.all.v7.2.符号进行基因集富集分析(gsea)。 p<0.05，fdr<0.25被认为具有统计学意义。
[0048]
免疫印迹法
[0049]
诱导后的细胞在预冷的pbs中洗涤，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细 胞裂解液在冰上裂解30分钟。使用至少40g的蛋白质进行sds
‑
page凝胶电泳，然 后转移到pvdf膜上。用4％的牛血清白蛋白在tbst中封闭2小时，然后用特异性一 抗(1:1000)孵育过夜。次日，用tbst洗涤3次后，用酶标二抗孵育1.5小时。tbst 洗涤二抗3次后，使用ecl发光液后在bio
‑
rad成像系统(ca，美国)下采集图像。
[0050]
p65和nfatc1的核转位
[0051]
观察bci对破骨细胞分化过程中nfatc1核转位和nf
‑
κb/p65的影响，将 raw264.7细胞用含或不含2μm bci的培养基处理2小时，再用100ng/ml rankl 溶液对细胞诱导20分钟。接着用4％多聚甲醛中固定，用triton x
‑
100中透膜及 4％bsa中封闭1.5小时。紧接着在4℃摇床中孵育一抗过夜，最后孵育alexa 萤石647标记的二抗(proteintech)。用dapi进行细胞核复染5分钟。使用共 聚焦显微镜(leica microsystems)观察荧光图像，使用imagej分析荧光强度。
[0052]
co
‑
ip实验
[0053]
在含或不含2μm bci的分化培养基中诱导raw264.7细胞3天，然后用裂解 缓冲液在冰上裂解1小时，随后12000g离心。在细胞裂解液中加入抗nf
‑
κb/p65 抗体(nfatc1抗体)(1:150)，在4℃孵育过夜，由此形成免疫复合物。根据操 作步骤使用蛋白质a/g磁珠(thermo，美国)进行nf
‑
κb/p65(nfatc1)的ip实 验。在室温下用磁珠孵育60分钟，得到ip复合物。磁珠在磁支架上收集，在ip 缓冲液中洗涤3次，免疫复合物用洗脱液洗涤最后用
western blot检测。
[0054]
ovx小鼠骨质疏松模型的建立
[0055]
6周龄大的雌性c57bl/6小鼠随机分为sham组、ovx组、ovx+低剂量(15mg/kg) bci组和ovx+高剂量(30mg/kg)bci组。小鼠采用5％水合氯醛腹腔注射麻醉后， 进行双侧切除卵巢建立骨质疏松模型。假手术组小鼠只进行切开缝合操作。术后3 天，各组小鼠分别通过腹腔注射bci(15或30mg/kg)或生理盐水7周。所有小鼠 被安置在陆军军医大学实验动物中心。该实验得到了陆军军医大学伦理委员会的批 准。
[0056]
微计算机断层扫描(micro
‑
ct)和组织学评估
[0057]
各组小鼠在被断颈处死后，用4％多聚甲醛固定小鼠股骨后进行micro
‑
ct扫 描。之后所有样本用10％edta溶液脱钙10天。对脱钙后的小鼠股骨进行h&e、 masson和trap染色。各组小鼠的肝、肾组织采用h&e染色进行形态学评价。切片 采用倒置显微镜进行观察。
[0058]
统计分析
[0059]
数据以均数
±
标准差表示，采用graphpad prism进行统计分析。对两组比较采 用学生t检验，对3组或3组以上进行比较采用单因素方差分析。p<0.05为被定 义为具有统计学差异。
[0060]
结果
[0061]
dusp6对rankl介导的破骨细胞形成与分化的影响
[0062]
为了探究dusp6在rankl介导的破骨细胞分化中的作用，我们(即本发明人) 分别用m
‑
csf和rankl诱导raw264.7细胞和bmms 1天、3天和5天。结果表明， 在破骨细胞分化过程中，dusp6的mrna水平逐渐升高(图1a)。用不同剂量的rankl 诱导raw264.7细胞和bmms后，dusp6的表达以rankl剂量依赖的方式显著增加(图 1b)。此外，我们观察到在破骨细胞分化过程中dusp6蛋白表达伴随着破骨细胞特 异性基因(mmp9、ctsk、nfatc1和c
‑
fos)表达的增加而上调(图1c)。为了更好 地了解dusp6对破骨细胞形成的影响，我们使用sirna敲低dusp6的表达，westernblot结果证实dusp6 sirna有效地降低了raw264.7细胞和bmms中的dusp6表达(图 1d)。此外，trap染色和western blot显示，dusp6敲低显著降低了rankl诱导 的trap+细胞的数量和破骨细胞发生相关蛋白的水平(图1e
‑
f)，表明dusp6在调 节rankl介导的破骨细胞生成中发挥了重要作用。
[0063]
bci对细胞周期、活力和凋亡的影响
[0064]
首先，我们评估了bci对raw264.7细胞和bmms的细胞毒性，结果显示低剂量 的bci(≤2μm和≤4μm)没有显示出对raw264.7细胞和bmms的毒性(图2b和 2c)。进一步评估bci在细胞凋亡和细胞周期进程的影响，我们进行了流式细胞术。 结果表明，bci(≤4μm)对bmms细胞周期进展(图2d)和凋亡(图2e)无明显 影响。我们随后证实，在rankl介导的破骨细胞分化过程中，bci抑制了raw264.7 细胞和bmms中的dusp6蛋白表达(图2f)。这些结果表明，bci能有效抑制dusp6 蛋白的表达而不影响细胞周期和细胞凋亡。
[0065]
dusp6抑制剂bci抑制rankl介导的破骨细胞形成
[0066]
为了确定bci介导的dusp6抑制是否会抑制rankl介导的破骨细胞分化，我们 对raw264.7细胞和bmms进行trap染色。图2g显示bci处理以浓度依赖的方式抑制破 骨细胞的生成。目前的研究认为，在破骨细胞激活过程中，nfatc1从细胞质转位到细 胞核，并促进下游破骨细胞特异性基因的转录。为了评价dusp6对nfatc1核转位的 抑制作用，我们在含或
不含bci的分化培养基中诱导raw264.7细胞1天。细胞免疫 荧光结果表明，bci处理抑制了rankl介导的nfatc1核转位(图3a)。此外，qrt
‑
pcr 评价bci特异性作用破骨细胞特异性基因表达(ctsk，mmp9，nfatc1和c
‑
fos) 显示，raw264.7细胞经bci处理后(图3b
‑
e)和bmms(图3f
‑
i)的mrna水平 呈浓度依赖性显著下调。western blot结果也得到了相似的结论(图3j和k)。
[0067]
bci减弱rankl介导的破骨细胞融合与吸收
[0068]
为了进一步评估dusp6抑制对破骨细胞融合的影响，我们对不同剂量bci诱导 的raw264.7细胞进行fak染色。fak染色显示bci处理后f
‑
actin环的数量明显减 少(图4a)。此外，qrt
‑
pcr结果显示，bci处理降低了破骨融合基因(atp6v0d2、 pu.1、oscar和cd9)的mrna水平(图4b
‑
e)，与fak染色结果一致。在骨陷窝形 成实验中，在含或不含bci的分化培养基中诱导bmms 7天，定量结果显示bci处理 下的骨陷窝数量显著减少(图4f)。
[0069]
转录组测序及生物信息学分析
[0070]
为了阐明bci介导的抑制破骨细胞形成的相关机制，我们通过rna
‑
seq分析测 定了rankl诱导的raw264.7细胞是否经过bci处理的转录组。结果发现，在bci 治疗后，有177个基因表达下调，45个基因表达上调。图5a采用火山图展示了degs 的分布情况。此外，rna
‑
seq分析结果显示，bci处理后破骨细胞分化关键基因 的表达显著降低(图5b)，这与qrt
‑
pcr结果一致。接着我们进行了go和kegg 富集分析，预测bci处理下前50个最显著的degs代表的主要功能。这些基因的 生物学过程主要富集在受体配体活性、趋化因子活性和破骨细胞分化调控；分子 功能主要涉及对脂多糖的应答、中性粒细胞迁移和中性粒细胞趋化(图5c)。kegg 通路富集的结果显示了几个主要的通路，包括细胞因子
‑
细胞因子受体相互作用、 破骨细胞分化、类风湿关节炎、nf
‑
κb和tnf信号相关的通路(图5d)。以上结 果证实bci抑制了破骨细胞分化并暗示了下游信号通路。
[0071]
bci抑制rankl诱导的stat3和nf
‑
κb
‑
nfatc1信号
[0072]
基于kegg通路分析的结果(图5d)，我们接着进行了gsea。结果显示，通过 nf
‑
κb的tnf
‑
α信号在rankl诱导组中显著富集，而在bci处理组较少富集(图 6a)。此外，nf
‑
κb/p65核转位的免疫荧光染色实验显示，在rankl诱导组中发生 了明显的nf
‑
κb/p65核转位，而在bci组中这一过程被显著抑制(图6b)。stat3 可诱导nf
‑
κb活性，进而激活下游破骨细胞相关基因(如ctsk和trap)的转录调 控。我们用含或不含bci(2μm)的分化培养基分别处理raw264.7细胞5、15、 30和60分钟，然后通过western blot检测stat3和nf
‑
κb信号的活性。图6c的 结果显示，相对于rankl组，bci处理组在5分钟、15分钟和30分钟显著减弱了stat3 在ser727和tyr705位点的磷酸化。此外，相对于rankl组，bci处理组在15分钟 和30分钟抑制p65亚基和iκbα的磷酸化(图6c
‑
d)。nfatc1是破骨细胞分化相 关基因的重要调节因子。我们之前在图4中的结果显示，nfatc1蛋白表达随bci浓 度及处理时间的增加逐渐降低。此外，通过co
‑
ip实验发现nf
‑
kb/p65和nfatc1之 间的蛋白相互作用受到bci的显著抑制(图6e)。最后，我们验证了bci是否通过 mapk信号来抑制破骨细胞分化。western blot结果显示在bci处理后p
‑
p38，p
‑
jnk 和p
‑
erk的表达水平没有显著变化(图7a和7b)。以上结果表明，bci可能通过减 弱stat3和nf
‑
κb信号抑制rankl介导的破骨细胞分化，且此过程不依赖于mapk 信号。
[0073]
bci不影响成骨细胞的分化或矿化
[0074]
除了破骨细胞，成骨细胞也是骨的关键调节细胞体内平衡。首先，我们通过 cck
‑
8实验证实bci对mc3t3
‑
e1细胞无毒性，数据表明bci处理48和96h后 mc3t3
‑
e1细胞活力无显著变化(<4m)(图8a)。接着，我们评估了bci对关键 成骨分化基因(runx2，col1α1和alpl)mrna水平的影响。qrt
‑
pcr结果显示， bci(<4m)并没有显著改变这些成骨细胞特异性基因的表达(图8b)。此外，我 们通过alp和茜素红s染色评价bci处理下mc3t3
‑
e1细胞的成骨和矿化情况。正 如预期的那样，结果显示mc3t3
‑
e1细胞的成骨和矿化在对照组和bci处理组之间 没有显著变化(图8c和d)。上述结果表明，bci有效地抑制了破骨细胞的分化， 而不影响成骨分化。
[0075]
bci可改善ovx诱导的骨丢失
[0076]
在建立ovx诱导的骨质疏松小鼠模型后，我们随后评估了bci在体内的作用。 腹腔注射低浓度或高浓度(15mg/kg或30mg/kg)bci 8周，采用micro
‑
ct评估 骨丢失情况。我们观察到，在低浓度和高浓度bci组中，骨丢失都得到了预防(图 9a)。此外，定量结果显示，与ovx组相比，两个bci处理组的骨体积/总组织体积 (bv/tv)、骨小梁数量(tb.n)、骨密度(bmd)和骨表面密度(bs/tv)明显增加 (图9b)。与micro
‑
ct结果一致，h&e和masson染色显示ovx组的样本有明显的 骨破坏，然而，在bci处理组的样本中很少观察到这种情况(图9c)。此外，相对 于sham组，trap染色检测出ovx组样本中大量的trap+细胞，两种浓度的bci处 理均减少了相对于ovx组的trap+破骨细胞数量(图9c)。为了评估bci治疗下的 肝肾毒性，我们对肝脏和肾脏进行了组织学分析。sham组和ovx组小鼠肝脏结构正 常，门脉三联结构正常，有中央静脉，而bci组小鼠肝脏结构未见明显病理改变(图9d)。同样，我们在bci处理的动物肾脏结构中也未观察到明显的病理改变(图9d)。 这些结果表明，bci通过抑制破骨细胞的活化而对ovx诱导的骨质疏松具有保护作 用明显的肝肾毒性。如图10中所示，在化合物bci干预下通过stat3与 nf
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κb
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nfatc1信号通路抑制破骨细胞的分化进而达到保护骨质疏松骨症骨丢失效 果的相关模拟示意图。
[0077]
讨论
[0078]
本发明人深入研究并探讨了dusp6对破骨细胞形成的影响，发现在破骨细 胞形成过程中dusp6蛋白表达显著增加，并且dusp6的下调抑制了破骨细胞的 形成。此外，dusp6的抑制剂bci以浓度依赖的方式抑制破骨细胞的分化。生 物信息学分析和实验验证提示bci通过改变stat3和nf
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κb
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nfatc1信号通路 抑制破骨细胞的发生。此外，体内实验结果显示，bci处理可减轻ovx诱导的 骨质疏松小鼠模型的骨丢失。
[0079]
对破骨细胞分化过程中dusp6表达的评估表明，随着破骨细胞的形成和成熟， dusp6的表达逐渐增加。值得注意的是，在bmms和raw264.7细胞中靶向dusp6 的sirna显著抑制了trap+破骨细胞的形成。随后，通过trap染色、fak染色和 骨陷窝形成实验结果证明，bci对dusp6的药理性抑制显著减弱了破骨细胞的形 成、融合和骨吸收。
[0080]
nf
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κb的激活需要iκb激酶磷酸化iκbα，而iκb激酶促进nf
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κb/p65 转位至细胞核，从而通过促进破骨细胞特异性基因nfatc1等因子的转录活性。本 发明人发现bci处理通过抑制iκbα的磷酸化逆转了rankl诱导的nf
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κb/p65 的核转位。此外，co
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ip检测表明bci可减弱nf
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κb/p65与nfatc1的相互作用。 综上所述，我们推测bci通过抑制nf
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κb/p65的激活和核转位来抑制nfatc1的 表达，从而抑制破骨细胞的形成。mapk信号在破骨细胞发生中起关键作用。然而， 在本发明中的western blot结果显示bci抑制破骨细胞分化不依赖于mapk
信号 通路。此外，我们发现bci处理减弱了rankl介导的破骨细胞形成中stat3信号 的活性，提示bci可能通过抑制nf
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κb和stat3的活性来抑制破骨形成中c
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fos 和nfatc1的表达。
[0081]
通过小鼠模型中评估了bci对骨质疏松的体内作用。micro
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ct数据显示，bci 治疗可通过增加ovx骨质疏松小鼠bs/tv、bv/tv、tb.n和bmd来提高骨量和骨密度。 此外，小鼠骨组织切片trap染色显示bci治疗后股骨远端小梁组织中trap+成熟破 骨细胞数量显著减少，并且bci处理组的小鼠观察到明显的肝毒性和肾毒性。