一种治疗骨髓炎的组合物及其应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种治疗骨髓炎的组合物及其应用。


背景技术：

2.感染性骨髓炎是由病原菌所引起的骨与骨髓的炎症，以骨局部严重炎症及进行性骨破坏为特征，多继发于长骨开放性创伤或骨折内固定术后等造成的感染。近年来由于交通意外、坠落等造成的创伤和骨折的发生率持续升高，感染性骨髓炎患者数量逐年增长。感染性骨髓炎一直是国内外骨科临床的治疗难题，常规采用的彻底清创、全身与局部抗生素应用等治疗方案通常疗效有限，感染往往迁延不愈且复发率高，极易发展为骨坏死、骨折延迟愈合甚至骨不连等，严重者可致肢体短缩畸形，给患者的生活和工作带来极大不便，也给家庭和社会带来沉重的经济负担。
3.感染性骨髓炎常见致病菌有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌等。由于骨髓组织是机体重要的免疫器官及造血器官，内含各类造血系干细胞和祖细胞，以及各种成熟免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、t和b淋巴细胞等，骨组织局部感染势必破坏骨髓局部免疫细胞功能。研究表明，各类细菌感染造成的宿主固有免疫下降是感染迁延不愈的重要原因之一。因此，在抗感染同时辅助“宿主导向治疗”(host
‑
directed therapy)调节宿主免疫反应以有效防御病原菌，是治疗各类细菌感染包括急慢性感染性骨髓炎的新思路，但是，目前临床尚无相关药物具备“宿主导向治疗”功能。
4.巨噬细胞和中性粒细胞在感染局部吞噬病原菌是宿主固有免疫系统抵御感染的第一道防线。其中，巨噬细胞的杀菌功能强弱对于局部组织能否有效对抗感染至关重要。有研究报道，一些病原菌如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,s.aureus)可逃避巨噬细胞的杀伤并长期定植在巨噬细胞内，巨噬细胞作为s.aureus等病原菌感染后在细胞内的主要储存库，其抗菌能力变化可能是造成感染性骨髓炎反复发作的源头之一。因此，在固有免疫抑制的情况下，如何恢复巨噬细胞抗菌能力实现“宿主导向治疗”，对急慢性感染性骨髓炎的临床治疗具有重要意义。
5.现有技术的缺点：针对骨髓炎，现有的治疗方案为是通过手术切除感染的组织和严格的抗生素治疗，以尽可能减少细菌负荷。但由于生物膜包埋的细菌对大多数抗生素的耐受性增强，且s.aureus感染会造成的宿主固有免疫下降，加之生物膜、骨龛和/或宿主细胞内存在休眠细菌，因此治疗方法往往不能完全清除病原体，并且经常发生再次感染。最终，这可能会导致不愈合的骨缺损，受累关节僵硬甚至感染肢体截肢。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于治疗骨髓炎的组合物，该组合物能够恢复巨噬细胞抗菌能力实现“宿主导向治疗”。
7.本发明所采取的技术方案是：
8.本发明的第一方面，提供一种组合物，包括抗生素和pd
‑
1/pd
‑
l1抑制剂。
9.在本发明的一些实施方式中，所述抗生素和pd
‑
1/pd
‑
l1抑制剂的质量比为(2～3.3):1。
10.在本发明的一些优选实施方式中，所述抗生素和pd
‑
1/pd
‑
l1抑制剂的质量比为2:1。
11.在本发明的一些实施方式中，所述抗生素为抗细菌感染的抗生素。
12.在本发明的一些优选实施方式中，所述抗生素为抗金黄色葡萄球菌的抗生素。
13.在本发明的一些实施方式中，所述抗生素为β
‑
内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、糖肽类、四环素类、磺胺类、氯霉素、林可酰胺类和恶唑烷酮中的至少一种。
14.在本发明的一些优选实施方式中，所述的β
‑
内酰胺类包括青霉素类、头孢霉素类和非典型β
‑
内酰胺类中的至少一种。
15.在本发明的一些优选实施方式中，所述氨基糖苷类为庆大霉素。
16.在本发明的一些实施方式中，所述pd
‑
1/pd
‑
l1抑制剂选自抗pd
‑
1抗体、抗pd
‑
l1抗体、抗pd
‑
1小分子抑制剂、抗pd
‑
l1小分子抑制剂、抗pd
‑
1/pd
‑
l1相互作用小分子抑制剂、pd
‑
1的干扰rna和pd
‑
l1的干扰rna中的至少一种。
17.在本发明的一些实施方式中，所述抗pd
‑
1抗体为nivolumab、toripalimab、keytruda、tislelizumab、pembrolizumab、cemiplimab、其生物类似物、其生物优化物及其生物等效物中的至少一种。
18.在本发明的一些实施方式中，所述抗pd
‑
l1抗体为atezolizumab、durvalumab、avelumab、kn035、cs1001、msb2311、bgb
‑
a333、kl
‑
a167、shr
‑
1316、sti
‑
a1014、其生物类似物、其生物优化物及其生物等效物中的至少一种。
19.在本发明的一些实施方式中，所述抗pd
‑
1小分子抑制剂为pd
‑
1inhibitor 1、pd
‑
1inhibitor2、其生物类似物、其生物优化物及其生物等效物中的至少一种。
20.在本发明的一些实施方式中，所述抗pd
‑
l1小分子抑制剂为lin28 1632、tomivosertib、其生物类似物、其生物优化物及其生物等效物中的至少一种。
21.在本发明的一些实施方式中，所述抗pd
‑
1/pd
‑
l1相互作用小分子抑制剂为bms
‑
1、bms202、bms
‑
1001、bms
‑
1166、pd
‑
1/pd
‑
l1 inhibitor 3、其生物类似物、其生物优化物及其生物等效物中的至少一种。
22.在本发明的一些实施方式中，所述干扰rna为sirna和/或shrna。
23.本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的组合物在以下(i)～(v)任意一项中的应用：
24.(i)制备治疗金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病的药物；
25.(ii)制备治疗骨髓炎的药物；
26.(iii)制备降低骨组织细菌载量的药物；
27.(iv)制备降低骨组织病变的药物；
28.(v)制备增强巨噬细胞功能的药物。
29.在本发明的一些实施方式中，所述金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病具体为金黄色葡萄球菌引起的骨及周围软组织感染性疾病。
30.在本发明的一些实施方式中，所述骨髓炎为金黄色葡萄球菌感染引起骨髓炎或患者骨组织中的pd
‑
l1/pd
‑
1表达上调的其他病原菌感染性骨髓炎。
31.本发明的第三方面，提供一种治疗骨髓炎的药物，包含本发明第一方面所述的组合物。
32.在本发明的一些实施方式中所述骨髓炎为金黄色葡萄球菌感染引起骨髓炎或患者骨组织中的pd
‑
l1/pd
‑
1表达上调的其他病原菌感染性骨髓炎。
33.在本发明的一些实施方式中，所述药物还包含辅料或载体。
34.在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为：注射剂、散剂、胶囊剂、片剂、膏剂、栓剂、气雾剂、口服剂、丸剂、滴剂、缓释片、混悬剂、颗粒剂、口含剂、冲剂、滴剂、丹剂、粉剂、溶液剂、霜剂、贴剂、锭剂或它们的任意形式组合。
35.本发明的有益效果是：
36.本发明提供一种药物组合物，包括pd
‑
1/pd
‑
l1抑制剂和抗生素，本发明发现pd
‑
l1/pd
‑
1中和抗体药物辅助抗生素治疗急慢性感染性骨髓炎，从激活自身固有免疫入手，应用pd
‑
l1/pd
‑
1中和抗体，通过部分解除急慢性感染性骨髓炎中固有免疫的抑制状态，恢复巨噬细胞杀菌能力，辅助抗生素达到更好的杀灭病原体的效果，减少感染复发，改善骨愈合，达到了更好的治疗效果。
附图说明
37.图1为在小鼠内植物s.aureus感染性骨髓炎模型中pd
‑
1中和抗体辅助抗生素治疗急慢性感染性骨髓炎效果图。其中图1a为骨组织和内植钉细菌涂板检测代表图；图1b为股骨组织表面附着的细菌定量图；图1c为内植钉表面附着的细菌定量图。
38.图2为免疫荧光检测检测在小鼠内植物s.aureus感染性骨髓炎模型中pd
‑
1中和抗体辅助抗生素治疗急慢性感染性骨髓炎效果图。其中图2a为小鼠骨髓内s.aureus代表图；图2b为骨髓单位面积内的s.aureus定量图。
39.图3为单纯庆大霉素治疗组和联合pd
‑
1中和抗体治疗组的骨组织h&e染色情况。其中图3a为h&e染色图，黄色箭头显示大范围脓肿灶，蓝色箭头显示局限性脓肿灶；图3b为骨组织感染病变评分。
40.图4为单纯庆大霉素治疗组和联合pd
‑
l1中和抗体治疗组的骨组织h&e染色情况。其中图4a为h&e染色图，黄色箭头显示大范围脓肿灶，蓝色箭头显示局限性脓肿灶；图4b为骨组织感染病变评分。
41.图5为单纯庆大霉素治疗组和联合pd
‑
1中和抗体治疗组感染股骨情况。其中图5a为micro
‑
ct扫描代表图；图5b为感染股骨的骨密度统计图；图5c为感染股骨的骨体积分数统计图；图5d为感染股骨的骨小梁数量统计图；图5e为左侧股骨的骨小梁厚度统计图；图5f为感染股骨的骨小梁间隙统计图。
42.图6为单纯庆大霉素治疗组和联合pd
‑
l1中和抗体治疗组感染股骨情况。其中图6a为micro
‑
ct扫描代表图；图6b为感染股骨的骨密度统计图；图6c为感染股骨的骨体积分数统计图；图6d为感染股骨的骨小梁数量统计图；图6e为左侧股骨的骨小梁厚度统计图；图6f为感染股骨的骨小梁间隙统计图。
43.图7为涂板稀释倍数。
44.图8为巨噬细胞单纯吞噬与联合pd
‑
l1/pd
‑
1中和抗体吞噬s.aureus涂板情况。其中图8a为涂板代表图；图8b为涂板定量图。
45.图9为pd
‑
1中和抗体阻断s.aureus感染诱发的巨噬细胞线粒体自噬情况。其中图9a为代表图；图9b为定量图。
46.*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001；p为显著性。
47.isotype：庆大霉素+同型对照抗体治疗组。
48.pd
‑
1ab：庆大霉素+pd
‑
1抗体治疗组。
49.pd
‑
l1 ab：庆大霉素+pd
‑
l1抗体治疗组。
具体实施方式
50.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
51.实施例1
52.制作小鼠内植物s.aureus感染性骨髓炎模型，于术后第一天开始给予小鼠庆大霉素(4mg/ml,0.1ml，腹腔注射，每天一次)治疗，联合pd
‑
1或pd
‑
l1中和抗体处理组小鼠于术后第5天开始给予pd
‑
1中和抗体(anti
‑
pd
‑
1ab,#be0146,bio x cell,nh,usa)(200μg/只，每3天一次)或pd
‑
l1中和抗体(anti
‑
pd
‑
l1 ab,#be0101,bio x cell,nh,usa)(200μg/只，每3天一次)，与此同时非治疗组小鼠则注射同型对照抗体(isotype control antibody,#be0083,bio x cell,nh,usa)(200μg/只，每3天一次)，于术后第14天收集术侧骨组织标本。剔出骨组织周围附着的软组织，取出内植钉，将骨组织称重、碾碎后按10μl/mg比例加入pbs溶液，将原液梯度稀释至2000倍后取200μl进行涂板。将取出的内植钉置于1ml pbs溶液进行超声以游离附着于其表面的细菌，分别取原液和稀释10倍菌液涂板检测。对于进行组织形态学检测的样本，将骨标本用4％pfa固定24小时、脱钙后进行石蜡或冰冻包埋切片，用于免疫组织化学染色或组织免疫荧光检测。对于进行microct扫描的样本，将骨标本用4％pfa固定24小时后，使用micro
‑
ct扫描仪进行扫描。测量骨密度(bmd)，骨体积/组织体积(bv/tv)，骨小梁数(tb.n)，骨小梁厚度(tb.th)和骨小梁分离度(tb.sp)。
53.结果表明：从图1和图2中可得出，相较于单纯庆大霉素治疗小鼠s.aureus内植物感染性骨髓炎，联合pd
‑
l1/pd
‑
1中和抗体治疗可以显著降低股骨局部细菌载量。从图3和图4中可得出，相较于单纯庆大霉素治疗小鼠s.aureus内植物感染性骨髓炎，联合pd
‑
l1/pd
‑
1中和抗体治疗可以显著改善骨组织病变。从图5和图6中可得出，相较于单纯庆大霉素治疗小鼠s.aureus内植物感染性骨髓炎，联合pd
‑
l1/pd
‑
1中和抗体治疗可以显著改善股骨感染后的松质骨骨量丢失。
54.实施例2
55.培养小鼠巨噬细胞系raw264.7，以1
×
105cfu/cm2密度接种6孔板，将s.aureus以moi为10(细菌cfu数与细胞数之比)感染细胞并应用pd
‑
1(10μg/ml)或pd
‑
l1(10μg/ml)的中和抗体处理，对照组以等体积同型对照抗体处理。1小时后采用20μg/ml溶菌酶lysostaphin和50μg/ml庆大霉素在37℃孵育以清除胞外菌。以无菌pbs溶液漂洗细胞两次后裂解细胞，将细胞裂解液梯度稀释，稀释倍数为1
×
、10
×
、100
×
、500
×
、1000
×
、2000
×
，具体分布情况见图7，涂琼脂平板培养，计算每个细胞内的细菌载量反映吞噬量。为研究pd
‑
1或pd
‑
l1的
中和抗体对细胞杀菌能力的影响，继续在生长培养基中培养并联合pd
‑
1或pd
‑
l1的中和抗体处理12小时后收集细胞，漂洗、裂解细胞，将细胞裂解液梯度稀释，涂琼脂平板培养，计数细菌克隆并计算杀菌率。
56.结果表明：从图8和图9可得出，pd
‑
l1/pd
‑
1中和抗体不影响巨噬细胞吞噬功能，但可显著增强巨噬细胞杀菌能力。
57.上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。