一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法与流程

1.本发明属于生物材料领域，具体是一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法。


背景技术：

2.我国水产资源丰富，但是在水产资源加工过程中产生大量的鱼下脚料，例如鱼皮、鱼鳞、内脏、鱼头等，不仅造成了资源极大的浪费，而且还会造成环境污染。鱼皮中的胶原蛋白含量占总蛋白量80％以上，较鱼体其他部位高出许多。另外，水生动物源胶原避免了陆生哺乳动物源性疾病传播的风险。因此使用鱼皮作为原料提取胶原蛋白、生产组织修复膜，具有提高我国水产品加工利用的综合效益和经济附加值、规避陆生哺乳动物源性疾病、避免造成环境污染等优点。
3.胶原蛋白具有优良的物理机械性能、良好的生物相容性、安全性和低免疫原性，能促进细胞粘附和增殖，促使血管形成、肉芽生长和上皮化，加快伤口愈合的进度，是一种优良的生物医学材料。静电纺丝技术可以用来制备纳米纤维，具有简单、经济、快速的优点。静电纺丝制备的纳米纤维具有高比表面积、高孔隙率、吸水性、三维结构和与天然细胞外基质相似的结构。通过静电纺丝技术制备胶原蛋白静电纺丝膜，同时具备胶原蛋白优良的生物学性能和静电纺丝纳米纤维高比表面积、高孔隙率、孔道连通性、三维结构和仿生天然细胞外基质的优点，有望成为高端生物医学组织工程材料。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，该方法制备的天然医用胶原蛋白组织修复膜具有优异的生物相容性和机械性能，具体技术方案如下：
5.1、一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，包括以下步骤：
6.(1)鳕鱼皮预处理。
7.(2)制备胶原蛋白液。
8.(3)制备鱼皮膜。
9.(4)将鱼皮膜进行化学交联。
10.(5)在交联后的鱼皮膜上用胶原蛋白液进行静电纺丝，得到组织修复膜。
11.(6)将组织修复膜进行干燥和灭菌。
12.上述鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，所述鳕鱼鱼皮预处理包括化冻、去鱼鳞、低温纯化水冲洗、盐洗、去黑皮、脱脂、碱处理、脱色。
13.进一步地，所述低温纯化水的温度是5-8℃。
14.进一步地，所述盐洗用1％-10％的氯化钠溶液在5-10℃下震荡12-24h。
15.进一步地，所述去黑皮是用0.1％-5％乙酸溶液浸泡鱼皮2-8min，再将黑色鱼皮刮去；然后将鱼皮3000-5000r/min离心3-5min，放入1
×
pbs缓冲液中暂存。
16.进一步地，所述脱脂是用0.1％-2％的tritonx-100溶液振荡摇晃12-24h。
17.进一步地，所述碱处理是用0.1％-10％的氢氧化钠溶液中振荡摇晃4-12h。
18.进一步地，所述脱色是用2％-10％的双氧水溶液振荡摇晃1-5h。
19.上述一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，所述胶原蛋白液的制备包括酸洗、蛋白酶浸提、过滤。
20.进一步地，所述酸洗是将步骤(1)的鱼皮用1％-8％的乙酸溶液5-10℃搅拌12-24h。
21.进一步地，所述蛋白酶浸提是用胃蛋白酶5-10℃搅拌12-24h。
22.进一步地，所述过滤是用滤袋-筒式过滤系统。
23.上述一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，所述鱼皮膜的制备包括分切和软化。
24.进一步地，所述分切是将步骤(1)的鱼皮分切成20mm
×
20mm、25mm
×
25mm、30mm
×
30mm等所需要的规格。
25.进一步地，所述软化是用0.1％-2％的软化剂溶液振荡摇晃1-5h。
26.上述一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，所述交联是将步骤(3)中的鱼皮膜用京尼平或戊二醛溶液振荡摇晃3-5h。
27.上述一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，所述静电纺丝包括推进器进样和纺丝。
28.进一步地，所述推进器的推进速度为0.1-15ml/h；
29.进一步地，所述纺丝电压为7-30kv；
30.进一步地，所述纺织采用的不锈钢滚轴的接收距离为8-20cm；
31.进一步地，所述纺织采用的不锈钢滚轴的转动速度为100-2000rmp；
32.进一步地，所述纺丝时间为2-20h。
33.上述一种鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜及其制备方法，所述灭菌是通过co-60γ射线辐照灭菌，辐照剂量为10-25kgy。
34.与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：
35.(1)使用鱼皮等水产品加工副产物，解决鱼加工副产物浪费的问题。另外，水生动物源胶原避免了陆生哺乳动物源性疾病和病原体传播的风险更加安全可靠。
36.(2)该组织修复膜是双层膜，既保存了鱼皮本身的真皮层结构，具有良好的机械屏障作用，又通过静电纺丝技术制备胶原蛋白静电纺丝膜，同时具备胶原蛋白优良的生物学性能和静电纺丝纳米纤维高比表面积、高孔隙率、孔道连通性、三维结构和仿生天然细胞外基质的优点，有望成为高端生物医学组织工程材料。
附图说明
37.图1组织修复膜的扫描电子显微镜照片(左为静电纺丝膜，右为脱细胞鱼皮膜)
38.图2组织修复膜拉伸强度
39.图3组织修复膜差示扫描量热结果
40.图4伤口愈合结果图
具体实施方式
41.以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
42.实施例1鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜的制备
43.1、取鳕鱼鱼皮化冻、去鱼鳞，5℃低温纯化水冲洗后，用5％氯化钠溶液在5℃下震荡24h，用蒸馏水反复冲洗；将鱼皮置于5％乙酸溶液浸泡5min，用刀刮去黑色鱼皮，将鱼皮3000r/min离心5min，放入1
×
pbs缓冲液中暂存，将鱼皮按照1:20的比例先后在1％的tritonx-100溶液和5％的氢氧化钠溶液中振荡摇晃12h，随后按照1:10的比例置于5％的双氧水溶液振荡摇晃3h。
44.2、将预处理后的鱼皮分切成30mm
×
30mm的正方形，按照1:10比例置于1％的胰蛋白酶溶液中，120r/min振荡摇晃5h，5℃低温纯化水洗涤3遍，然后3000r/min离心5min，按照1：10的比例转移至0.5％的戊二醛溶液中，120r/min振荡摇晃5h得到鱼皮膜。
45.3、将预处理后的鱼皮按照1:20的比例先后置于8％的乙酸溶液和1％的胃蛋白酶中10℃搅拌12h后，分别通过5微米的滤袋过滤、0.45微米的筒式过滤系统进行过滤得到胶原蛋白液，用200目滤袋8000r离心10min得到胶原蛋白沉淀，然后在真空冷冻干燥机内真空冷冻24h得到胶原蛋白沉淀(干基)。
46.4、用1％的冰醋酸配置1.2％浓度的胶原蛋白溶液，静置、脱泡，将胶原蛋白液少量分次装入10ml塑料注射器，在鱼皮膜表面进行静电纺丝。注射泵控制溶液流速为0.6ml/h左右，电压设定在25kv，针头与收集板的距离为10cm，不锈钢滚轴的转动速度为100rmp，纺丝5h，得到组织修复膜，在真空干燥机中干燥，然后用co-60γ射线辐照灭菌，辐照剂量为15kgy，得到鳕鱼皮天然医用胶原蛋白组织修复膜。
47.实施例2组织修复膜的扫描电镜观察
48.1、样品制备，样品必须干燥(无水)。将导电胶一面粘于钉型样品台上，将样品固定在样品台上导电胶的另一面，确保样品粘贴牢固。样品固定好后，使用压缩空气(压力确保在8-10psi之间)吹扫除尘。
49.2、将制备好的样品放进离子溅射仪中，真空度为8pa时，开始喷金，喷金时电流为5ma，喷金时长200s。
50.3、将样品放在样品杯中，放入电镜中进行观察。点击软件，电镜由光学模式转换成电子模式，进入二次电子观察模式，调节电压为5kv,电流为中等电流。调节放大旋钮、聚焦旋钮、对比度和亮度按钮等操作，调节好需要观察的图片区域，然后点击存储图片，扫描电镜照片形成，得图1。
51.实施例3组织修复膜的机械性能研究
52.图2为利用万能拉力试验机参照gb/t 528-2009《硫化橡胶或热塑性橡胶拉伸应力应变性能的测定》中哑铃状试样4型测得的组织修复膜拉伸强度。可以看出，相比未交联的组织修复膜，经交联后鱼皮膜的力学强度得到了有效提升，其结构更为完整坚固，机械性能较好。
53.实施例4组织修复膜的热稳定性研究
54.采用差示扫描量热仪(dsc)进行检测。扫描范围25～70℃，升温速率为2k/min，样品室氮气流量40ml/min，保护气60ml/min，可得到组织修复膜的热稳定结果。如图3所示：组织修复膜发生热降解的温度为51.1℃。
55.实施例5组织修复膜用于创面修复的研究
56.1、使用外科剪在大鼠背部剪出2个全层皮肤缺损的圆形创面，覆盖敷料前应滴加生理盐水确保伤口保持湿润，2个创面全部剪好后尽快进步下一步操作。
57.2、敷料覆盖与包扎固定，采用组织修复膜和无菌纱布作为对照。2种敷料使用前均剪裁为2.0-2.5cm的方块，用无菌生理盐水浸泡10分钟以上；然后每组选3只覆盖对应样品，确保敷料完全覆盖创面，并将每种材料的四角缝合到周围健康皮肤的角质层，此处采用3-0号缝合线。然后每只大鼠用一张3m聚氨酯敷料(规格10*12cm)覆盖黏贴于2个创面之上，并用医用胶带捆绑固定，目的是伤口保湿防菌；最后在伤口处覆盖2层纱布(预先裁剪成合适尺寸，刚好覆盖四个创面)，用无纺布胶带包扎固定于周围健康皮肤(二次固定，防止敷料脱落)。
58.3、观察组织修复膜对创伤愈合的促进作用
59.通过观察动物实验结果，如图4所示，术后7d时组织修复膜和无菌纱布愈合率分别为53.07
±
15.43和44.33
±
21.50；术后14d时愈合率分别为88.24
±
13.16和83.25
±
17.84，各组间无显著性差异；术后21d时组织修复膜组几乎痊愈，且新生表皮毛发开始生长，显著高于无纺纱布敷料组愈合率86.65
±
8.81(p《0.05)；结果显示组织修复膜在创伤末期呈现了非常显著的促进创伤愈合的作用。