共载CD73抗体和阿霉素的脂质体及其制备方法和应用

共载cd73抗体和阿霉素的脂质体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及共载cd73抗体和阿霉素的脂质体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在多种癌症中所占比率位居首位。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, tnbc）是其中的一种亚型，其病理组织学分级较差，恶性程度高，肿瘤组织生长很快，一旦发病，进展迅速，肿瘤容易出现早期的复发转移，其最大的特点就是侵袭性强，简单来说，就是特别容易通过血液或淋巴转移到身体的其他组织，主要表现为内脏转移（肺转移和肝转移）和脑转移。并且它的临床预后较差，对于各种治疗方案均不敏感，治疗效果不理想。目前常用的局部治疗即为手术治疗，但三阴乳腺癌患者手术治疗后局部复发率及区域淋巴结转移率均高于非三阴乳腺癌。因此，肿瘤大小、局部淋巴结状况等常用的局部尺度也难以评估三阴乳腺癌的预后。以及目前针对恶性肿瘤治疗中较为成熟的内分泌治疗及针对her2基因的分子靶向治疗对三阴乳腺癌均无效。因此，需寻找更为有效的治疗方案。
3.阿霉素（dox）属于蒽环类药物，抗瘤谱广，抗瘤作用强，疗效确切，不仅能杀死肿瘤细胞，还能促进肿瘤细胞免疫原性死亡(immunogenic cell death, icd)，但临床上应用的化疗药阿霉素会导致较为严重的副作用，如引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等，特别是心脏毒性是这类药物最严重的毒副作用，限制了其在临床上的应用，而且长期的阿霉素化疗会导致耐药性。


技术实现要素：

4.发明人在研究中发现，目前比较有效的治疗方案多为免疫和化疗相结合，但由于三阴性乳腺癌的肿瘤微环境相当于免疫耗尽(cold)的状态，对免疫检查点抑制剂不敏感。由于tnbc免疫衰竭(cold)的微环境，免疫治疗的临床应用也受到限制。同时，肿瘤缺氧诱导广泛的代谢和免疫变化网络有利于肿瘤的生长和进展，缺氧限制了能量来源的可用性，并诱导细胞外atp的积累，随后是腺苷的积累。细胞外atp会迅速降解为腺苷，腺苷与p1嘌呤能受体(也称为腺苷能受体)结合，以阻碍免疫细胞浸润和激活。为此，为了改善现有技术的不足，发明人进行了以下设想，包括将tnbc由冷肿瘤向热肿瘤状态的转化，也就是将tnbc肿瘤内部的环境从没有或者只有很少的免疫细胞转变为含有较多免疫细胞，包括t细胞、巨噬细胞等，以实现最大效果的发挥抗癌作用，同时，阻断腺苷通路以有效逆转肿瘤微环境的免疫抑制作用。
5.与以上设想不谋而合的，发明人发现cd73在肿瘤微环境的癌细胞、dc细胞、treg细胞、nk细胞、mdsc、tam等多种细胞系表面均有表达。并且cd73的表达收到低氧诱导因子
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1（hif
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1）、tgf
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β、egfr、akt、β
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catenin等分子的调控。与肿瘤病人的不良预后密切相关。cd73主要通过腺苷通路产生抗肿瘤免疫抑制作用，促进肿瘤的生长，转移及血管新生。此
外，cd73还参与抗肿瘤药物耐药性产生，为肿瘤治疗带来极大挑战。基于此，发明人尝试阻断cd73能量通路，采用cd73抗体与阿霉素协同给药以尝试应用于对于三阴乳腺癌的治疗。但是出乎意料的，以组合物以及制备成偶联物的给药形式难以发挥预期的理想效果，表现为虽然能够提高免疫化疗的敏感性，但是阿霉素的心脏毒性以及耐药性的改善并不明显，对于三阴乳腺癌的治疗效果仍有待提高。
6.为此，发明人进一步提供了一种制剂，在该制剂中实现对cd73抗体和阿霉素的共载，该方案将三阴性乳腺癌由冷肿瘤转化为热肿瘤，使其对免疫化疗更为敏感，并且改善了阿霉素在体内的生物分布，降低了阿霉素对心脏的毒副作用，同时减轻了耐药性，以及，该制剂能够将阿霉素和cd73抗体联合递送到三阴性乳腺癌肿瘤部位，促进药物在肿瘤部位的积累，减少药物在动物体内的损失，更好的发挥了对于三阴乳腺癌的抗肿瘤效果。
7.具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
8.在本发明的第一方面，本发明提供了一种共载cd73抗体和阿霉素的脂质体（简称为cdl），所述脂质体内为包裹有阿霉素的脂质核心，脂质核心外修饰有cd73抗体。
9.在本发明的实施方式中，cd73抗体偶联在磷脂peg活性酯胶束上，然后修饰于脂质核心表面。
10.在本发明的一些实施方式中，所述磷脂peg活性酯为dspe
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peg
‑
nhs（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
琥珀酰亚胺酯）。发明人在研究中发现，采用dspe
‑
peg
‑
nhs时与抗体的反应更简单，仅需在特定温度下搅拌即可，并且能够更大程度的保证抗体的完整性以及活性。如dspe
‑
peg
‑
mal（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
马来酰亚胺）与抗体连接过程中则会破坏抗体的空间结构，dspe
‑
peg
‑
nh2或dspe
‑
peg
‑
cooh则往往需要进行活化后与抗体相连。发明人经过大量的实验验证，采用dspe
‑
peg3400
‑
nhs相较于其他重均分子量(比如mw=2000)情况下所修饰的抗体能够更稳定的形成脂质体。
11.在本发明的实施方式中，所述脂质核心为透明螺纹状双分子层结构。
12.在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的共载cd73抗体和阿霉素的脂质体的方法，其包括：以dopc（1,2
‑
二油酰基卵磷脂）、dope（1,2
‑
油酰基磷脂酰乙醇胺）和chems（胆甾醇琥珀酸酯）制备脂质核心包载阿霉素，将cd73抗体偶联在dspe
‑
peg
‑
nhs胶束上，然后采用后插入法将偶联在dspe
‑
peg
‑
nhs（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
琥珀酰亚胺酯）上的cd73修饰于脂质核心表面。
13.在本发明的一些实施方式中，dopc、dope和chems形成脂质核心，其中，dopc、dope、chems的摩尔比为1:3:2
‑
1:3:0.5，优选为1:3:1
‑
1:3:0.5，三者的比例会影响脂质体的形成以及稳定性。在本发明的比例范围内能够获得稳定性更好的脂质体，尤其是该比例为2:6:1时，并且，在此比例下脂质体的粒径最佳。
14.在本发明的一些实施方式中，阿霉素与脂质核心的质量比1:20
‑
1:10；优选为1:15
‑
1:10，在此条件下脂质体的载药量最高，比例过高会造成脂质体不稳定，尤其是当该比例为1:10时，脂质体稳定、且载药量最高。
15.在本发明的一些实施方式中，cd73抗体与dspe
‑
peg
‑
nhs的摩尔比为1:3。在此范围内，对于dspe
‑
peg
‑
nhs的利用率最高，可以实现较为理想的连接，连接率不低于80%，并且能够实现较好的治疗效果。
16.进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述方法包括按比例将dopc、dope、chems溶于有机溶剂（比如三氯甲烷）中配制得到磷脂溶液，旋转蒸发，形成具有透明螺旋纹状的脂质膜，加入硫酸铵溶液后水浴超声，混匀得到脂质体溶液；透析法除去游离硫酸铵，向脂质体溶液中加入阿霉素溶液，水浴加热搅拌，透析法除去未包裹的阿霉素，即得包裹有阿霉素的脂质核心溶液；将磷脂peg活性酯分散于溶剂（比如氯仿）中，减压蒸发形成磷脂peg活性酯胶束，加入pbs溶液后水浴超声，将cd73抗体加入到溶液中，水浴搅拌，加入甘氨酸终止反应，即得抗体溶液，将抗体溶液加入包裹有阿霉素的脂质核心溶液中，水浴搅拌，除去游离抗体即得共载cd73抗体和阿霉素的脂质体。
17.在本发明的一些实施方式中，旋转蒸发的旋转速度为60
‑
100rpm/min，温度为20
‑
40℃，更以20
‑
23℃为宜；所述硫酸铵溶液浓度为100
‑
250mmol/l。
18.在本发明的一些实施方式中，所述阿霉素溶液为阿霉素的pbs溶液，加入阿霉素溶液后的水浴加热温度为35
‑
45℃（40℃更宜），搅拌速率为500
‑
1000rpm/min（800 rpm/min更宜）。
19.在本发明的一些实施方式中，cd73抗体与磷脂peg活性酯胶束反应的水浴温度为20℃
‑
50℃，搅拌时间为3h
‑
5h。
20.在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述第一方面中所述的共载cd73抗体和阿霉素的脂质体。
21.在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物制剂，其包含上述第一方面中所述的共载cd73抗体和阿霉素的脂质体，和至少一种药学上可接受的辅料。
22.在本发明的第五方面，本发明提供了上述第一方面中所述的共载cd73抗体和阿霉素的脂质体或上述第三方面中所述的药物组合物或上述第四方面中所述药物制剂在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
23.相较于现有技术，本发明的优势在于：本发明提供了一种共载cd73抗体和阿霉素的脂质体，其能够特异性针对三阴性乳腺癌，将三阴性乳腺癌由冷肿瘤转化为热肿瘤，改善了其肿瘤微环境中存在的免疫耗尽状态，扭转了肿瘤内部的免疫抑制，使得三阴性乳腺癌肿瘤内部的环境从没有或者只有很少的免疫细胞转变为含有较多免疫细胞（包括t细胞、巨噬细胞等），使其对免疫化疗更为敏感，并且改善了阿霉素在体内的生物分布，降低了阿霉素对心脏的毒副作用，同时减轻了耐药性，以及该脂质体能够将阿霉素和cd73抗体联合递送到三阴性乳腺癌肿瘤部位，促进药物在肿瘤部位的积累，减少药物在动物体内的损失，更好的发挥了对于三阴乳腺癌的抗肿瘤效果。
附图说明
24.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1示意了本发明实施例1中cdl体外释放行为实验的结果。
25.图2示意了本发明实施例2中cdl对三阴性乳腺癌细胞(4t1细胞)的24小时（左图）和48小时（右图）的杀伤效果，其中，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
26.图3示意了实施例3体内分布研究中尾静脉注射free dox、doxlip、cdl后不同时间的荧光体内分布图。
27.图4示意了实施例3体内分布研究中尾静脉注射free dox、doxlip、cdl后不同时间的体外器官分布图，其中，heart（h）、liver（l）、spleen（s）、lung（l）、kidney（k）和tumor（t）。
28.图5示意了实施例3体内分布研究中尾静脉注射free dox、doxlip、cdl后不同时间的荧光定量图，其中，n=3，结果以平均值
±
sd表示，**p<0.01，*p<0.05。
29.图6示意了本发明实施例4中cdl对三阴性乳腺癌肿瘤的抑制效果（***p<0.001）。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
31.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
32.制备例1共载cd73抗体和dox的免疫化疗脂质体（cdl）的制备本发明实施例中所使用的cd73抗体为商品化的产品，购买自美国bioxcell生物技术有限公司。
33.1、负载dox的脂质体（dox lip）的制备首先，按比例将适宜浓度的dopc：dope：chems=摩尔比2:6:1溶于3ml氯仿中，旋转蒸发，水浴温度为22℃，转速为80rpm/min，最终形成具有透明螺旋纹状的脂质膜后，彻底干燥去除溶剂。
34.2、加入适当预热至40℃的硫酸铵溶液（250mmol，ph=5.5）水浴超声，用微型脂质体挤出机重复挤压多次。将所得到的溶液放入处理好的透析袋（3000 da）中，在pbs溶液中匀速搅拌透析4h，每2h更换透析液，将游离硫酸铵除去，得到空白脂质体。以脂质体；阿霉素=10：1的质量比加入游离阿霉素溶液，水浴加热至40℃并以800rpm的速度旋转搅拌1h，运用透析法除去未包裹的阿霉素，最终得到纯化的阿霉素脂质体。
35.3、运用后插入法制备共载cd73抗体和dox的免疫化疗脂质体（cdl），将dspe
‑
peg3400
‑
nhs分散到氯仿中，使用旋转蒸发仪真空蒸干形成薄膜。加入pbs溶液后水浴超声。按cd73抗体:dspe
‑
peg3400
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nhs=1:3的摩尔比加入抗体，在50℃水浴中搅拌4h，加入甘氨酸终止反应。将得到的抗体溶液加入到阿霉素脂质体溶液中，在40℃条件下，水浴搅拌1h (800rpm)，通过透析法除去游离抗体得到最终的cdl。纯化，保存在4℃条件下。
36.对制备得到的cdl进行物理化学性质的测定，粒径为216.3
±
4.40nm，pdi为0.215
±
0.006，包封率为99.8
±
0.140%，载药量为9.8
±
0.147%。粒径、包封率和载药量良好。
37.实施例1 cdl体外释放行为研究
实验方法：将相同体积的游离阿霉素（free dox）、cdl制剂（制备例1）置于透析袋中，将所有样品置于pbs中进行恒温振荡以模拟体内环境，37℃，100 r/min，于不同时间点（0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 、72 h、96h ）对样品溶液进行取样，并再次加入相同ph的pbs介质。将取出的样品溶液过0.22 μm的有机滤膜，使用hplc检测记录其峰面积，对样品体外释放行为进行分析。cdl体外释放行为结果如图1所示。
38.由图1可知，cdl中阿霉素的释放速率具有明显降低。在ph=7.4时，制剂在72h时的累计释放速率为23.15
±
0.58%，表现出很显著的缓释效果，在ph=5.0时，制剂一直保持快速释放的速率，到72h时，累计释放速率已经达到99.13
±
0.42%，标明cdl具有ph敏感性，并具有较为理想的释放效果。
39.实施例2 cdl对三阴性乳腺癌细胞的杀伤效果细胞杀伤实验：将三阴性乳腺癌细胞（4t1细胞）以4
×
104个/ml、200μl/孔接种在96孔板中，培养过夜使其贴壁。实验组分组如下：空白脂质体、阿霉素脂质体（dox lip）、共载阿霉素和cd73抗体的脂质体（cdl），对照组加入完全培养基，分别转化为dox浓度（0.002，0.02，0.2，2，20μg/ml）加入到对应96孔板中；空白脂质体组以（0.02，0.2，2，20，200μg/ml）浓度加入到对应孔中，每孔加入100μl药物体积。操作完成后在培养箱中放置24h/48h。在各样品孔中加入配置好的cck
‑
8溶液（10μl/孔），在培养箱中放置1h。将微孔酶标仪的最大吸光度值设定在450nm，对样品孔进行扫描收集数据，进一步分析。相对细胞存活率（rcv）（%）使用以下公式计算：rcv%=实验组平均吸光度/对照组平均吸光度
×
100%各制剂组设置复孔为5个。
40.其中，cdl对三阴性乳腺癌(4t1细胞)的杀伤效果如图2所示。
41.从图2结果可以看出，cdl相较于阿霉素制剂组dox lip具有更强的细胞杀伤作用，且随着作用时间的延长，这种优势也更为明显。
42.实施例3体内分布研究本实验通过小动物活体成像仪器对制剂在小鼠体内的组织分布进行探究，可以对制剂的分布进行实时观察并记录分析。阿霉素本身具有荧光，可运用这一特质通过活体成像对其分布进行观察。首先将制备好的free dox、dox lip和cdl（制备例1）过0.22μm的有机滤膜进行灭菌，并将各制剂用生理盐水稀释10倍，通过小鼠尾静脉进行注射，所用制剂的剂量为 5mg/kg。将小鼠腹部的毛发通过脱毛操作进行除去，小鼠通过腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉（80mg/kg），将药物通过小鼠尾静脉注射进体内4 h、12 h及24 h后，采用小鼠活体成像仪器对小鼠进行拍照观察。拍照完成后将小鼠脱颈处死，将肿瘤以及器官收集起来进行拍照分析数据。实验结果如图3
‑
5所示。
43.小鼠体内显像结果（图3）显示，与游离阿霉素和阿霉素脂质体相比，制备的cdl在24h时肿瘤组织中检测到的cdl荧光信号最强。离体器官结果（图4）显示，在肿瘤组织中，游离阿霉素组的药物积累低于阿霉素脂质体组，使其更多的分布于肿瘤组织；cdl组的药物积累高于阿霉素脂质体组，定量分析也显示出更多的cdl富集，这也证实了主动靶向促进药物在肿瘤组织中积累的作用，使得cdl具有很好的治疗效果。同时，dox具有明显的心脏毒性，且易在心脏聚集。从定量分析中可以看出，cdl组中的dox在心脏的荧光信号最低，是游离阿霉素组的0.3倍，这证实游离阿霉素装载于脂质体中可以显著降低dox的心脏毒性，从而显
著降低阿霉素对正常组织的损伤。从荧光定量结果（图5）中可以看出，cdl组中的阿霉素在代谢器官肝中累积较多，而阿霉素脂质体组中的阿霉素在肾中累积较多，这可能由于cd73抗体具有的靶向作用所导致的代谢分布不同；结果表明包载进载体中的阿霉素代谢效率要低于游离阿霉素，这说明脂质体可以延长阿霉素在体内的存在时间并且提高阿霉素在肿瘤部位的累积，更好的发挥抗肿瘤效果。
44.实施例4抑瘤实验三阴性乳腺癌肿瘤的治疗实验：选择健康适龄的balb/c小鼠，将处理好的4t1细胞悬液接种在小鼠的第四对乳腺脂肪垫上，每天观察测量，等到小鼠乳腺脂肪垫上的肿瘤体积达到 50 mm3，按照实验分组给药。给药后测定肿瘤体积和体重，当小鼠肿瘤体积大于 1000 mm3 时或体重连续下降超过10%时认为该小鼠死亡。隔两天测量一次小鼠体重和瘤体积并记录。
45.实验分组每组6只。实验分组：（1）pbs组：治疗过程中仅给磷酸盐缓冲液；（2）抗体对照组（isotype）：治疗过程中仅给抗体的同型对照；（3）游离阿霉素组(free dox)：治疗过程中仅给dox；（4）游离cd73抗体组(free cd73 ab)：治疗过程中仅给cd73抗体；（5）游离组合组（free combo）：治疗过程中同时给dox和cd73抗体；（6）阿霉素脂质体组（dox lip）：治疗过程中仅给dox lip；（7）cd73 ab脂质体组(ab lip)：治疗过程中给 ab lip；（8）联合给药组（cdl）：治疗过程中给cdl。
46.给药剂量和给药方式：给药间隔为两天，次数为5次，各组以100 μl/次/只尾静脉注射给药，其中，给药剂量5mg/kg（以dox计），以cd73抗体计为100μg/只。
47.实验结果如图6所示。
48.由实验结果可知，cdl组表现出特别优异的抑瘤活性，其肿瘤抑制率明显好于dox lip组、cd73抗体组、以及cd73和dox的混合组等其他所有组别，这表明cdl具有较好的可以使阿霉素发挥更好的杀伤作用，并且cd73抗体可以阻断肿瘤微环境中腺苷的产生，从而扭转肿瘤微环境的免疫抑制，联合应用可以很好的抑制肿瘤生长，延长生存周期。
49.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。