包含瑞巴派特或其盐的药物组合物及其制备方法和在制备眼用制剂中的用途与流程

1.本发明属于眼用药物领域，具体涉及一种包含瑞巴派特或其盐的药物组合物及其制备方法和在制备眼用制剂中的用途。


背景技术：

2.眼部化学伤，作为一种常见非机械性损伤的眼科急症，多发生在化工厂、施工地和实验室等。根据化学物质的不同，可以分为碱烧伤、酸烧伤等，其中，碱烧伤往往又比酸烧伤更严重。
3.眼睛遭受化学损伤后，眼组织受损并引发炎症，炎症反应不能及时抑制就会进一步导致眼组织坏死，进而产生恶性循环。高迁移率族蛋白b1(high mobility group protein，hmgb1)，是机体坏死细胞发出的一种内源性危险信号，也是一种促新生血管和促炎性分子。已有研究表明，hmgb1与碱烧伤及其并发症密切相关，hmgbl可以通过其下游受体之一的toll样受体(toll-like receptors，tlrs)促进角膜新生血管的产生。
4.现阶段，这类眼部疾病的治疗手段十分有限，除了药物治疗之外，严重的患者往往需要进行角膜移植，具有失明的风险。
5.瑞巴派特(rbm)，为白色粉末，无臭，味苦，溶于甲醇和乙醇但不溶于水，通常制成悬浮液制剂，临床上可以用于干眼症的治疗，例如：cn 111107838 a、cn 110638748a等。
6.甘草酸二钾(dg)，为白色或类白色粉末，具有抗炎、抗过敏、保湿等功效，在医药行业主要用于镇咳祛痰、胃溃疡、急慢性胃炎、湿疹、皮肤瘙痒，以及用于治疗癌症和防治艾滋病等。
7.截止到目前为止，未检索到有将瑞巴派特或其与甘草酸二钾组合用于预防、治疗和/或缓解眼部化学伤(或者，用于降低hmgb1、tlr4和/或rage的表达水平)的相关文献报道。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题和/或不足，本发明的目的之一在于提供一种包含瑞巴派特或其盐的药物组合物。该药物组合物，安全有效，无刺激，为眼部化学伤、干眼症、角膜炎等眼部病症的治疗和/或预防提供了一种新的潜在选择。
9.本发明提供一种纳米胶束药物组合物，其包括：喹啉酮类化合物和药学上可接受的甘草酸盐；其中，所述的喹啉酮类化合物为瑞巴派特或其药学上可接受的盐，喹啉酮类化合物与甘草酸盐的质量比为1:2～50。
10.在本发明的一优选实施方案中，喹啉酮类化合物与甘草酸盐的质量比为1:9～20；优选地，喹啉酮类化合物与甘草酸盐的质量比为1:12～15。更优选地，喹啉酮类化合物与甘草酸盐的质量比为1:15。
11.在本发明的一优选实施方案中，所述的药物组合物满足下述条件i～iii中的一个
或两个以上：
12.i、所述的喹啉酮类化合物为瑞巴派特；
13.ii、所述的甘草酸盐选自甘草酸钠、甘草酸二钠、甘草酸钾、甘草酸二钾、甘草酸铵、甘草酸二铵中的一种或两种以上；优选地，所述的甘草酸盐为甘草酸二钾或甘草酸二钠；
14.iii、喹啉酮类化合物的包封率为80％以上；优选地，喹啉酮类化合物的包封率≥90％或≥95％；
15.优选地，所述的药物组合物同时满足条件i～iii。
16.在本发明的一优选实施方案中，所述的喹啉酮类化合物为瑞巴派特。
17.在本发明的一优选实施方案中，所述的药物组合物是由包括以下步骤的方法制成：将喹啉酮类化合物和甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，即得；
18.所述的溶剂优选醇类溶剂，更优选甲醇或乙醇。
19.每克喹啉酮类化合物对应所述溶剂的用量为5～100ml(例如：10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml等)。
20.在本发明的一优选实施方案中，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的辅料。
21.在本发明的一优选实施方案中，所述的药物组合物为固体制剂或液体制剂。
22.在本发明的一优选实施方案中，所述药物组合物中的喹啉酮类化合物为治疗有效量的。
23.在本发明的一优选实施方案中，所述的药物组合物为液体制剂，其溶剂选自药学上可接受的水、pbs缓冲液或羧甲基纤维素钠水溶液。
24.在本发明的一优选实施方案中，所述液体制剂的ph值为6～8，更优选为6.8～7.4。
25.在本发明的一优选实施方案中，所述的液体制剂为纳米胶束滴眼液。
26.在本发明的一优选实施方案中，喹啉酮类化合物的包封率为80％以上。
27.在本发明的一更优选实施方案中，喹啉酮类化合物的包封率≥90％或≥95％。
28.在本发明的一优选实施方案中，当所述液体制剂中的喹啉酮类化合物浓度为5mg/ml时，所述的液体制剂满足下述条件
①
～
③
中的一个或两个以上：
29.①
、所述液体制剂的胶束平均直径为1～80nm；
30.②
、所述液体制剂的多分散系数为≤0.5；
31.③
、所述液体制剂的zeta电位为-20～0mv；
32.在本发明一优选实施方案中，所述的溶剂制剂同时满足条件
①
～
③
。
33.对于条件
①
，所述液体制剂的胶束平均直径优选5～25nm。
34.对于条件
②
，所述液体制剂的多分散系数优选≤0.4。
35.对于条件
③
，所述液体制剂的zeta电位优选-10～-5mv。
36.在本发明的一优选实施方案中，所述的药物组合物为眼用制剂。
37.在本发明的一优选实施方案中，所述的眼用制剂至少满足下述用途a～f中的一种：
38.a、所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防眼部化学伤的眼用制剂；
39.b、所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防干眼症的眼用制剂；
40.c、所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜上皮细胞氧化应激损伤的眼用制剂；
41.d、所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜上皮损伤的眼用制剂；
42.e、所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜炎的眼用制剂；
43.f、所述的眼用制剂是抑制角膜新生血管、角膜炎症因子表达、hmgb1表达、tlr4表达或者rage表达的眼用制剂。
44.在本发明的一更优选实施方案中，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防眼部化学伤的眼用制剂。
45.在本发明的一更优选实施方案中，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防干眼症的眼用制剂。
46.在本发明的一更优选实施方案中，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜上皮细胞氧化应激损伤的眼用制剂。
47.在本发明的一更优选实施方案中，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜上皮损伤的眼用制剂。
48.在本发明的一更优选实施方案中，所述的眼用制剂是用于治疗和/或预防角膜炎的眼用制剂。
49.在本发明的一更优选实施方案中，所述的眼用制剂是抑制角膜新生血管、角膜炎症因子表达、hmgb1表达、tlr4表达或者rage表达的眼用制剂。
50.在本发明进一步更优选实施方案中，所述的眼部化学伤为眼部碱烧伤。
51.在本发明进一步更优选实施方案中，所述的角膜炎症因子为vegf、tgf-β1、nf-κb、tnf-α、il-6或il-1β。
52.在本发明的一优选实施方案中，包括以下步骤：
53.将喹啉酮类化合物和甘草酸盐一起分散或溶解于溶剂中，混匀，然后35～45℃旋转蒸发除去溶剂，得到固体产物；
54.之后可选择地包括：将所述的固体产物溶解或分散在所述液体制剂的溶剂中，调节所述液体制剂的ph值为6～8，过滤灭菌，即可。
55.在本发明的一更优选实施方案中，所述的溶剂为醇类溶剂，进一步更优选为甲醇或乙醇；
56.每克喹啉酮类化合物对应所述溶剂的用量为5～100ml(例如：10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml等)；
57.调节所述液体制剂的ph值为6.8～7.4；
58.调节所述液体制剂的ph值所使用的是氢氧化钠和/或氢氧化钾。
59.所述的药物组合物在制备眼用制剂中的用途。
60.本发明中“包封率”，表示的是dg-rbm(固体)中dg包封(或者称结合)的rbm量与rbm总量(未包封的rbm量与包封的rbm量之和)的比值。
61.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
62.本发明所用试剂和原料均市售可得。
63.本发明的积极进步效果在于：
64.试验结果表明，本发明提供的包含瑞巴派特的药物组合物dg-rbm，安全、无刺激，对于预防、治疗和/或缓解眼部化学伤(例如：眼部碱烧伤)具有较好的疗效，并能够修复角膜上皮细胞氧化应激损伤、角膜上皮损伤，促进损伤愈合；此外，也能够抑制角膜新生血管、角膜炎症因子表达、hmgb1表达、tlr4表达和/或rage表达，为相关病症的防治提供了一种新的解决方案。
附图说明
65.图1为本发明甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液的外观图及其对照。
66.图2为rbm与dg不同质量比的包封率。
67.图3为甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液保存12周的包封率。
68.图4为兔眼刺激性观察图。
69.图5为兔眼组织病理学观察图。
70.图6为鸡胚尿囊膜-台盼蓝染色实验的血管充血情况。
71.图7为不同实验组的台盼蓝吸收量。
72.图8为给药dg-rbm后的角膜荧光强度图。
73.图9为dg-rbm滴眼液的短时间细胞毒性。
74.图10为dg-rbm滴眼液的长时间细胞毒性。
75.图11为dg-rbm滴眼液对hcecs细胞迁移的影响。
76.图12为不同实验组的细胞迁移结果。
77.图13为过氧化氢诱导后细胞活力检测结果。
78.图14为过氧化氢诱导后细胞ros水平的检测结果。
79.图15为dg-rbm治疗对h2o2诱导hcecs后细胞活力的检测结果。
80.图16为dg-rbm对h2o2诱导hcecs后ros水平的影响。
81.图17为dg-rbm对h2o2诱导hcecs后sod水平的影响。
82.图18为dg-rbm对h2o2诱导hcecs后mda水平的影响。
83.图19为裂隙灯观察不同实验组小鼠角膜荧光素钠染色图像。
84.图20为根据荧光素钠染色统计的不同实验组小鼠角膜上皮的缺损率。
85.图21为裂隙灯观察不同实验组小鼠角膜虎红染色图像。
86.图22为根据虎红染色统计的不同实验组小鼠角膜上皮的缺损率。
87.图23为碱烧伤后角膜新生血管的裂隙灯检查图像。
88.图24为fitc-葡聚糖灌注后小鼠角膜新生血管图像。
89.图25为角膜铺片的新生血管面积荧光定量结果。
90.图26为碱烧伤后角膜的组织病理学检查结果。
91.图27为碱烧伤后角膜上皮细胞凋亡结果。
92.图28为不同实验组角膜组织中炎症因子vegf的表达。
93.图29为不同实验组角膜组织中炎症因子tgf-β1的表达。
94.图30为不同实验组角膜组织中炎症因子nf-κb的表达。
95.图31为不同实验组角膜组织中炎症因子tnf-α的表达。
96.图32为不同实验组角膜组织中炎症因子il-6的表达。
97.图33为不同实验组角膜组织中炎症因子il-1β的表达。
98.图34为不同实验组蛋白质印迹法检测结果。
99.图35为不同实验组角膜组织中hmgb1水平。
100.图36为不同实验组角膜组织中tlr4水平。
101.图37为不同实验组角膜组织中rage水平。
具体实施方式
102.下面将结合具体实施例对本发明进行清楚、完整的描述，本领域技术人员将会理解，下面所述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为对本发明保护范围的限制。
103.本发明中，未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
104.例如：
105.甘草酸二钾，购自西安优硕生物科技有限公司。
106.瑞巴派特、mtt，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
107.香豆素6、dph、3％过氧化氢、temed，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
108.pbs缓冲液：购自武汉赛维尔生物科技有限公司。
109.胎牛血清、dmem/f12培养基、胰蛋白酶、免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒、预染彩虹蛋白marker(10-170kd)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
110.ripa裂解液、pmsf、tris碱、30％丙烯酰胺、1.5m tri-cl ph＝8.8、1.0m tri-cl ph＝6.8、1.0m tri-cl ph＝7.4、tween 20(吐温20)、ecl底物液，购自北京索莱宝科技有限公司。
111.hrp标记羊抗兔二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
112.活性氧ros检测试剂盒、脂质氧化(mda)检测试剂盒、总sod活性检测试剂盒(wst-8法)，购自上海碧云天生物技术有限公司。
113.鸡胚：由江苏肇银兰戈贸易有限公司提供，蛋重约40g，放置于孵化箱，保持温度37℃，相对湿度40％-70％，培养十日后使用。
114.雄性新西兰兔：购自青岛康大生物有限公司(中国青岛)。
115.c57bl/6j小鼠：6-8周，雄鼠，济南朋悦实验动物繁育有限公司。
116.本发明中，所有分析均采用spss11.5软件(spssinc.，芝加哥)，p《0.05表示具有显著性。
117.关于本发明中使用术语的定义，除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于全文中的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应当根据公开内容和/或上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
118.实施例1甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液的制备：
119.制备方法(参考：zuo r,zhang j,song x,et al.encapsulating halofuginone hydrobromide in tpgs polymeric micelles enhances efficacy against triple-negative breast cancer cells[j].int j nanomedicine,2021,16:1587-1600.)：将
750mg瑞巴派特(rbm)和不同质量比(1:3、1:6、1:9、1:12、1:15)的甘草酸二钾(dg)加入到茄型瓶中，超声使甘草酸二钾和瑞巴派特在甲醇(20ml)中均匀分散。随后，将茄型瓶置于旋转蒸发仪，在40℃、减压条件下将甲醇挥干，直到茄型瓶的瓶壁上附有一层干燥的薄膜(dg-rbm)。取下茄型瓶，加入pbs缓冲液将瓶壁上的薄膜(dg-rbm)溶解，用氢氧化钠调节ph在6.8-7.4并定容(150ml)，无菌微孔滤膜过滤，得到甘草酸二钾-瑞巴派特(dg-rbm)纳米胶束滴眼液无菌制剂，见图1：dg-rbm(rbm与dg的质量比为1:15)，为淡黄色透明澄清的溶液，其rbm的溶解度为5mg/ml；pbs缓冲液(为无色澄清透明溶液)、dg(pbs为溶剂，每毫升中含75mg的dg，为淡黄色溶液)，dg&rbm(pbs为溶剂，每毫升中含75mg的dg和5mg的rbm，为淡黄色混悬溶液)、rbm悬液(pbs为溶剂，每毫升中含5mg的rbm，为白色混悬溶液)作为对照。
[0120]
1.1甘草酸二钾临界胶束浓度的测定
[0121]
以1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(dph)为荧光探针，分别测定甘草酸二钾在人工泪液、pbs缓冲液和水中的临界胶束浓度(cmc)。结果显示，甘草酸二钾在人工泪液、pbs缓冲液和水中的cmc分别为1.18
±
0.09、1.07
±
0.06、1.23
±
0.06mg/ml。
[0122]
1.2包封率
[0123]
采用高效液相色谱法测定(参考：ding p,chen y,cao g,et al.solutol((r))hs15+pluronicf127 and solutol((r))hs15+pluronicl61 mixed micelle systems for oral delivery of genistein[j].drug des devel ther,2019,13:1947-1956)，将制备的dg-rbm纳米胶束滴眼液过0.22μm滤膜，过滤分离未包封的rbm。用适当溶剂(例如：甲醇)稀释dg-rbm过滤前和过滤后的溶液，以破坏胶束。采用高效液相色谱法测定rbm浓度。包封率，为过滤后检测到的rbm浓度与过滤前检测到的rbm浓度之比。
[0124]
高效液相色谱法：
[0125]
日本岛津lc2010a高效液相色谱仪，紫外-可见光检测器，反相色谱柱agilent zorbax sb-c18(250mm
×
4.60mm，5μm)；柱温40℃；流动相为甲醇和ph＝3的醋酸水溶液(55:45，v/v)；检测波长245nm；流速1.0ml/min；进样体积10μl。瑞巴派特的保留时间7.4min，定量限50ng/ml。
[0126]
检测结果见图2，rbm与dg的质量比为1:3时，dg-rbm的rbm包封率为86.85
±
0.59％，此时肉眼观察到有药物析出现象；rbm与dg的质量比为1:9或更高(例如，1:12、1:15等)时，dg-rbm的rbm包封率＞90％，尤其是质量比为1:15时，包封率达到99.97
±
0.86％，无药物析出现象，表现为淡黄色透明澄清的溶液。
[0127]
1.3胶束尺寸、多分散指数和zeta电位
[0128]
使用纳米粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)进行测定，结果显示，dg-rbm纳米胶束滴眼液(rbm与dg的质量比为1:15，其rbm浓度为5mg/ml)的平均直径为16.56
±
0.91nm，多分散性指数为0.377
±
0.12，zeta电位为-(7.27
±
0.591)mv。
[0129]
1.4储存稳定性考察
[0130]
将制备的dg-rbm纳米胶束滴眼液(rbm与dg的质量比为1:15，其rbm浓度为5mg/ml)，分装，密封，避光，一部分储存在4℃，另一部分储存在25℃。结果如图3所示，25℃条件下保存12周dg-rbm的rbm包封率为92.02
±
1.83％，4℃条件下保存12周dg-rbm的rbm包封率96.78
±
1.96％，肉眼观察仍然是澄清淡黄色溶液。
[0131]
1.5安全性考察
[0132]
(1)在体兔眼刺激性实验
[0133]
眼刺激性评价(参考：1、li x,fang j,xin m,et al.rebaudioside a/tpgs mixed nanomicelles as promising nanocarriers for nimodipine ocular delivery[j].drug deliv transl res,2020(1)；2、zhang f,li r,yan m,et al.ultra-small nanocomplexes based on polyvinylpyrrolidone k-17pf:a potential nanoplatform for the ocular delivery of kaempferol[j].eur j pharm sci,2020,147:105289；3、wilhelmus k r.the draize eye test[j].surv ophthalmol,2001,45(6):493-515.)，对家兔随机进行如下分组，每隔半小时进行一次点眼，持续6h，最后一次点眼后24h用裂隙灯对兔眼角膜、结膜等眼组织进行观察和记录。
[0134]
生理盐水组：
[0135]
sds(十二烷基硫酸钠)组：生理盐水作为溶剂，浓度0.5％；
[0136]
dg-rbm组：dg-rbm纳米胶束滴眼液，rbm与dg的质量比为1:15，其rbm浓度为5mg/ml；
[0137]
dg组：pbs为溶剂，每毫升中含75mg的dg；
[0138]
rbm组：pbs为溶剂，每毫升中含5mg的rbm。
[0139]
经上述各组滴眼后首先进行draize-test评分，观察结果见图4。结果显示，0.5％sds对兔眼组织具有一定的刺激性，兔子缺乏依从性，已经无法自主眨眼，眼球整体充血肿胀，虹膜虽可见但颜色加深，巩膜以及角膜缘充血高于正常，结膜出现明显水肿，伴有部分眼睑外翻且潮湿，结膜有大量分泌物。其他组无明显眼部损伤，角膜、结膜、虹膜均未见临床异常征候。
[0140]
(2)组织病理学
[0141]
在拍照及评分结束后，将兔安乐死后行眼摘，用无齿镊摘眼，要确保在过程中不拉拽眼球造成眼组织的损伤，将摘取的眼球浸泡在组织固定液中固定，脱水后包埋于蜡块中，切片进行角膜的苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，he)染色和过碘酸雪夫氏染色(schiff periodic acid shiff，pas)染色，显微镜下观察眼角膜、结膜、房角、视网膜等组织并拍照。
[0142]
结果见图5，0.5％sds组的兔眼结膜杯状细胞的数量和密度明显减少，其他组未发现明显异常，进一步证明dg-rbm在眼部应用的安全性。
[0143]
(3)鸡胚尿囊膜-台盼蓝染色实验(cam-tbs)
[0144]
鸡胚尿囊膜-台盼蓝染色(cam-tbs)法，用于评价甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液的刺激性(参考：liu s,han x,liu h,et al.incorporation of ion exchange functionalized-montmorillonite into solid lipid nanoparticles with low irritation enhances drug bioavailability for glaucoma treatment[j].drug deliv,2020,27(1):652-661.)。实验鸡胚随机分成六组，每组5只：
[0145]
生理盐水组：
[0146]
sds(十二烷基硫酸钠)组：生理盐水作为溶剂，浓度0.5％；
[0147]
naoh组：0.1mol/l的氢氧化钠溶液；
[0148]
dg-rbm组：dg-rbm纳米胶束滴眼液，rbm与dg的质量比为1:15，其rbm浓度为5mg/ml；
[0149]
dg组：pbs为溶剂，每毫升中含75mg的dg；
[0150]
rbm组：pbs为溶剂，每毫升中含5mg的rbm。
[0151]
样品与鸡胚尿囊膜(cam)接触5min后，cam的血管情况如图6所示，0.1m的naoh溶液和0.5％sds溶液(均为阳性对照组)的鸡胚尿囊膜的血管有明显的血管破裂出血情况，其他组与生理盐水(阴性对照)通过肉眼观察鸡胚尿囊膜的血管没有破裂和出血现象，表明dg-rbm、dg、rbm对鸡胚尿囊膜都没有明显的刺激性。
[0152]
台盼蓝吸收量如图7所示，生理盐水组是阴性对照组，其台盼蓝的吸收量约1.91μg，对鸡胚尿囊膜基本没有刺激性。0.1m naoh组作为阳性对照，台盼蓝吸收量为49.01μg，0.5％sds溶液组的台盼蓝吸收量约52.02μg，具有强烈的刺激性。dg-rbm、dg、rbm的台盼蓝吸收量分别约为2.27μg，1.22μg和4.28μg。
[0153]
(4)在体小鼠角膜吸收的考察
[0154]
用香豆素6(cou-6)分别对dg-rbm、rbm进行标记(香豆素6的浓度5μg/ml)，将小鼠随机分为两组，一组眼表滴香豆素6标记的dg-rbm纳米胶束滴眼液；另一组滴香豆素6标记的rbm悬液，每10分钟一次，共三次；最后一次点眼结束后30、60和90分钟处死小鼠，用生理盐水冲洗眼球以去除滴眼液残留。将小鼠角膜剪瓣平铺玻片上，使用正置荧光显微镜观察，曝光时间设定为100毫秒。
[0155]
结果见图8，dg-rbm的角膜荧光强度顺序：30分钟＞60分钟＞90分钟，而rbm几乎观察不到绿色荧光，这表明角膜对dg-rbm的吸收和利用远优于rbm。
[0156]
实施例2dg-rbm纳米胶束滴眼液用于治疗h2o2诱导人角膜上皮细胞氧化应激损伤
[0157]
2.1细胞毒性评价
[0158]
mtt法检测细胞毒性：细胞接种在96孔板中，每孔约5
×
104个细胞，在96孔板中培养24h，使细胞贴壁。
[0159]
(1)短时间细胞毒性
[0160]
dg-rbm：dg-rbm纳米胶束滴眼液，rbm与dg的质量比为1:15，其rbm浓度为5mg/ml；
[0161]
dg：pbs为溶剂，每毫升中含75mg的dg；
[0162]
rbm：pbs为溶剂，每毫升中含5mg的rbm；
[0163]
分别将上述dg-rbm、dg、rbm加入96孔板中与细胞一起培养1h，检测方法与长时间细胞毒性检测方法相同，采用未经处理的细胞作为空白对照，考察细胞存活情况，结果见图9。
[0164]
结果显示，dg-rbm、dg、rbm都没有表现出较为明显的细胞毒性，但防腐剂0.1mg/ml苯扎氯铵(bac)的细胞存活率仅为40.91
±
1.05％，表现出明显的细胞毒性。
[0165]
(2)长时间细胞毒性
[0166]
采用含有2％胎牛血清的培养基稀释甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束，使其终浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.913μg/ml；按照处方对应的浓度稀释甘草酸二钾溶液，使其终浓度为7500、3750、1875、937.5、468.75、234.38、117.19和58.59μg/ml；按照处方对应的浓度稀释瑞巴派特混悬液，使其终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.91 3μg/ml。
[0167]
上述样品加入96孔板中与细胞一起培养24、48、72h，孵育结束后，吸走各个孔的样品溶液培养基，每个孔加入200μl无菌pbs冲洗3遍，洗掉样品残留。加入mtt溶液继续孵育
4h，吸去上清，各孔加入200μl二甲基亚砜，用酶标仪检测490nm波长下的吸光度值。采用未经处理的细胞作为空白对照，浓度5μg/ml和10μg/ml苯扎氯铵与实验组同时考察细胞毒性，结果见图10。
[0168]
结果显示，500μg/ml的dg-rbm与细胞共孵育72小时，细胞的存活率为100.265
±
0.01％，相应的500μg/ml瑞巴派特混悬液、7500μg/ml甘草酸二钾溶液的细胞存活率分别为103.216
±
1.09％、100.976
±
1.20％，未表现出细胞毒性反应，但10μg/ml和5μg/ml苯扎氯铵与细胞共孵育72小时的细胞存活率仅4％左右，细胞毒性明显。
[0169]
2.2对hcecs(human corneal epithelial cells，人角膜上皮细胞)细胞迁移的影响
[0170]
细胞接种数量以第二天细胞贴壁正好铺满细胞孔板底为宜。待细胞正好铺满一层后进行细胞划痕，用200μl移液器的枪头划痕。pbs轻轻洗细胞，洗掉掉落的细胞碎片，加入用以血清培养基为溶剂的dg-rbm、dg、rbm。放入细胞培养箱中，于0、12、24h用倒置显微镜观察，拍照记录。采用imagej分析细胞迁移面积，计算细胞迁移率。
[0171]
根据细胞毒性结果，甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液处方浓度稀释10倍即500μg/ml(dg-rbm)，相应的瑞巴派特混悬液为500μg/ml(dg)，甘草酸二钾溶液为7500μg/ml(rbm)，进行细胞迁移实验，显微镜观察细胞迁移结果见图11，细胞迁移率见图12(*：表示与对照相比，p＜0.05；$：表示与dg-rbm相比，p＜0.05；p＜0.05表示具有显著性差异)。
[0172]
对细胞进行细胞划痕实验，上述三种样品12小时显著促进角膜上皮细胞细胞划痕迁移(与对照组相比，p＜0.05)，500μg/ml甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束的细胞迁移率为69.450
±
1.25％，显著大于其他两组样品的迁移率(p＜0.05)。24小时，纳米胶束组的细胞几乎全部融合，迁移率达82.977
±
0.96％，其余两组的细胞也进一步迁移，但融合程度低于纳米胶束组(与dg-rbm组相比，p＜0.05)。这表明，瑞巴派特、甘草酸二钾都具有促进细胞迁移的作用，而且甘草酸二钾-瑞巴派特具有协同作用，效果优于任何单一组分。
[0173]
2.3对h2o2诱导hcecs氧化应激的影响
[0174]
(1)建立h2o2诱导hcecs产生氧化应激模型
[0175]
建立hcecs氧化应激实验模型，采用不含血清的培养基将细胞接种在96孔板上，细胞密度为每孔约5
×
103个细胞，细胞贴壁后建模。h2o2的浓度设定为200、300、400、500、600、700、800、900、1000nm，注意用不含血清的空白新鲜培养基配制，且要在避光条件下，现配现用。在96孔板中加入上述不同浓度的过氧化氢孵育细胞，孵育时间设定为2、4小时，随后用无菌pbs冲洗细胞，用上述mtt法检测细胞活力，结果见图13。
[0176]
结果显示，随着h2o2浓度从200nm升高到1mm，细胞存活率逐渐也降低，且4小时孵育的细胞活力低于2小时。
[0177]
活性氧(ros)的测定，见图14。使用活性氧检测试剂盒测定500nm的h2o2诱导细胞4h后产生的ros水平，与正常细胞相比，该条件下诱导的细胞ros水平显著升高(p＜0.05)，进一步证明了h2o2诱导hcecs产生氧化应激模型建立成功。
[0178]
(2)活性氧(ros)的测定
[0179]
取对数生长期的hcecs，按照10
×
104个细胞/孔的细胞密度将其接种于6孔板中。设置空白细胞对照组，过氧化氢模型组及不同的给药组。不同给药组，根据细胞毒性实验结果，选取合适的浓度进行预处理。预处理结束后，用无血清培养基冲洗掉残留的样品溶液，
加入过氧化氢造模。造模结束，吸弃上清液，用无血清培养基将6孔板润洗3遍。按照ros试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书进行操作。收集细胞检测荧光强度。测得的荧光强度减去没有装载探针的细胞悬液的荧光强度，并以空白组的荧光强度作为对比。每个组分别设置3组平行对照。
[0180]
(3)超氧化物歧化酶(sod)含量的测定
[0181]
按照总sod活性检测试剂盒(wst-8法)说明书测定sod活性。在数据分析中，sod酶活力单位用细胞的蛋白浓度进行校准。
[0182]
(4)丙二醛(mda)的测定
[0183]
按照脂质氧化(mda)检测试剂盒说明书测定细胞中脂质氧化水平。计算出mda含量后要用细胞的蛋白浓度校准。
[0184]
根据前述细胞毒性和细胞迁移的结果，选择甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液处方浓度稀释10倍即500μg/ml为给药治疗浓度，相应的瑞巴派特混悬液为500μg/ml，甘草酸二钾溶液为7500μg/ml。上述样品溶液首先孵育细胞12小时，之后测定其细胞活力、ros水平、sod和mda含量，结果分别见图15～18(*：表示与对照相比，p＜0.05；#：表示与h2o2相比，p＜0.05；$：表示与dg-rbm相比，p＜0.05)。
[0185]
预给药后用h2o2诱导细胞，dg-rbm组的细胞活力与h2o2组相比显著提高(p＜0.05)，见图15。过氧化氢诱导人角膜上皮细胞后细胞的活力明显受损，ros水平明显升高，说明细胞产生氧化应激。检测结果显示，与正常细胞对照组相比，h2o2组的细胞ros、mda明显增加(p＜0.05)，sod明显降低(p＜0.05)；与h2o2组相比，dg-rbm组的sod明显增加(p＜0.05)，ros、mda明显降低(p＜0.05)，这表明甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束可以有效降低氧化应激水平，调控细胞产生sod和mda的含量。
[0186]
实施例3 dg-rbm纳米胶束滴眼液调控hmgb1(high mobility group b1，高迁移率族蛋白b1)信号通路治疗小鼠角膜碱烧伤
[0187]
3.1建立模型
[0188]
用于构建角膜碱烧伤的小鼠品系为c57bl/6j，用裂隙灯观察小鼠眼睛状态无异常。
[0189]
直径2mm圆形滤纸浸入1m的naoh溶液中。小鼠深度麻醉后，角膜滴0.5％的丁卡因进行眼表麻醉。在显微镜视野下小心剪掉小鼠的眼睫毛和眼周多余毛发，用棉签蘸取生理盐水轻柔擦拭眼球周围。使用无菌眼科镊子，将一块naoh浸湿的滤纸片放在角膜中央，持续时间60秒，以产生小鼠眼角膜的急性碱烧伤。每只老鼠右眼进行碱烧伤，左眼作为对照。取下滤纸，用生理盐水冲洗眼睛，以洗去眼部残留的naoh溶液。将下述各分组的溶液滴到角膜上。每天重复给药4次，持续14天。
[0190]
①
pbs组；
[0191]
②
ha组：0.1％的透明质酸钠；
[0192]
③
dg-rbm组：dg-rbm纳米胶束滴眼液，rbm与dg的质量比为1:15，其rbm浓度为500μg/ml；
[0193]
④
dg&rbm组：pbs为溶剂，每毫升中含7.5mg的dg和0.5mg的rbm；
[0194]
⑤
dg组：pbs为溶剂，7500μg/ml；
[0195]
⑥
rbm组：pbs为分散溶剂，500μg/ml。
[0196]
3.2小鼠眼前节裂隙灯观察
[0197]
(1)小鼠角膜荧光素钠染色
[0198]
开启裂隙灯，调整光源到钴蓝光。随机选取1、3、5、7、14天的每个分组小鼠，在小鼠眼部给予浓度为1％的荧光素钠溶液覆盖眼球，在眼表停留10s后，冲去多余荧光素钠溶液，暴露眼球，在裂隙灯前观察，拍照记录小鼠角膜上皮荧光素钠着色情况。用图像分析软件image j测量角膜上皮着色面积，计算角膜上皮修复面积。
[0199]
六组小鼠角膜碱烧伤后，各个时间点荧光素钠染色观察结果见图19。结果很直观的显示出，当小鼠行碱烧伤后，氢氧化钠侵蚀掉整个角膜上皮，钴蓝光下经荧光素钠染色后所有组的小鼠角膜上皮全部为荧光绿色(0天)；经给药后，甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液对于治疗小鼠角膜碱烧伤有效，具有促进上皮损伤愈合的治疗效果，并且优于dg&rbm组、dg组、rbm组。
[0200]
根据荧光素钠染色统计的角膜上皮面积缺损率，结果见图20(*：表示与pbs相比，p＜0.05；#：表示与透明质酸钠组相比，p＜0.05；$：表示与dg-rbm组相比，p＜0.05)。
[0201]
pbs作为阴性对照，角膜损伤在治疗后愈合缓慢，在烧伤后第7天有34.05
±
2.55％的角膜未修复，直到第14天时，角膜上皮还有10.41
±
0.98％未修复。透明质酸钠(ha)作为阳性对照，第7天角膜上皮修复了80％左右(＝100％-缺损率)，dg&rbm组修复了约70％左右，甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液(dg-rbm组)修复了约91.87％。在给药的第14天，dg-rbm组的角膜损伤已经基本上完全修复，而其他五组均还存在不同程度的损伤。
[0202]
(2)小鼠角膜虎红染色
[0203]
开启裂隙灯，调整光源到自然光，随机选取1、3、5、7、14天的每个分组小鼠，在小鼠眼部滴虎红溶液覆盖眼球，在眼表停留10秒后，冲去多余虎红溶液，充分暴露眼球，在裂隙灯前观察，拍照记录小鼠角膜上皮虎红着色情况。用图像分析软件image j测量角膜上皮着色面积，计算角膜上皮修复面积。
[0204]
虎红可以染色已经干燥坏死的细胞，且敏感度高，在白光下就可以观察。各个时间点虎红染色观察结果见图21。与上述荧光素钠染色结果相似，不同分组随着给药时间的延长，角膜上皮染色范围逐渐减少，角膜上皮损伤都有不同程度的修复，以甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液(dg-rbm组)的效果最好。
[0205]
根据虎红染色统计的角膜上皮面积缺损率，结果见图22(*：表示与pbs相比，p＜0.05；#：表示与透明质酸钠组相比，p＜0.05；$：表示与dg-rbm组相比，p＜0.05)。与上述荧光素钠统计结果相似，以甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液(dg-rbm组)的效果最好，与其他组相比，存在显著性差异(p＜0.05)。
[0206]
3.3小鼠角膜新生血管观察
[0207]
观察碱烧伤后第1、3、5、7、14天后，新生血管的变化过程，在第14天，对小鼠进行fitc-葡聚糖颈静脉造影，随后将角膜铺片后用正置显微镜观察，采用image j软件分析荧光面积。
[0208]
通过14天的新生血管裂隙灯观察，呈现出的有代表性的照片，见图23。小鼠眼球发生碱烧伤后，从第1天起pbs组的小鼠角膜缘开始出现新生血管芽；第3天时，pbs组的小鼠被观察到有短小细密的血管从角膜缘快速向角膜中央生长，第5-7天pbs组的角膜上已经出现长且管径增粗的新生血管并形成了血管网，第14天新生的血管已到达角膜中央区域。
[0209]
甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液组、透明质酸钠组的新生血管长势均比pbs组要轻，在第14天，纳米胶束滴眼液组有细密的血管从角膜缘出现向角膜中央生长，但管径细，透明质酸钠组的血管密度比纳米胶束滴眼液组稍大，该组的新生血管到角膜中央的距离也比纳米胶束滴眼液组近一些。其余三组的治疗，没有明显抑制新生血管向角膜中央的生长，瑞巴派特混悬液组的血管是除pbs组外靠近角膜中央最近的，且血管的管腔大。
[0210]
fitc-葡聚糖颈静脉注射进行血管造影，角膜铺片结果见图24和25(*：表示与pbs相比，p＜0.05；#：表示与透明质酸钠组相比，p＜0.05；$：表示与dg-rbm组相比，p＜0.05)。健康小鼠角膜(对照组)上除了角膜缘之外无新生血管。pbs组和瑞巴派特混悬液组的血管分支多，密度大。而纳米胶束滴眼液组的血管密度小，荧光强度低。甘草酸二钾组和透明质酸钠组的血管密度相近。角膜铺片的结果与裂隙灯上的观察结果一致；因此，综合上述结果，可以认为纳米胶束滴眼液组对新生血管具有明显的抑制作用。
[0211]
3.4组织病理学检查角膜组织和炎症细胞
[0212]
造模后按分组给药，第7、14天每组随机选取小鼠脱颈处死，将摘取的眼球浸泡在组织固定液中固定，脱水后包埋于蜡块中，切片进行角膜的h&e染色，显微镜观察并拍照记录。
[0213]
碱烧伤角膜的组织学检查，可以更好地印证临床观察的结果，见图26。
[0214]
对于pbs治疗组，第7天，角膜基质被破坏，出现大量炎性细胞浸润，并且在基质中观察到明显的新形成的血管官腔，前房也有大量炎症渗出液；第14天，情况更加严重，角膜基质受损严重，出现更多的炎症细胞。
[0215]
对于透明质酸钠组，第7天，角膜上皮变薄，出现少量炎症细胞，基质排列较为紧密，第14天，角膜基质出现水肿，角膜上皮增厚，即透明质酸钠具有一定的修复作用。
[0216]
纳米胶束滴眼液组的角膜组织最接近健康小鼠，角膜上皮在第7天有轻微缺损，第14天，角膜上皮修复完整，新生血管官腔细且角膜基质致密，仅有少量炎症因子，角膜内皮完好无损，在前房中未观察到渗出液。
[0217]
物理混合物组(dg&rbm)7天治疗后，角膜上皮变薄，角膜基质被破坏，在角膜基质中观察到新形成的血管以及炎性细胞浸润；第14天，情况有所缓解，但仍有大量炎症细胞，炎症细胞浸润角膜基质层，新生血管的管腔很大。
[0218]
甘草酸二钾组和瑞把派特混悬液组，都可以明显观察到前房的炎症渗出液，但它们主要粘附在角膜内皮上。
[0219]
3.5小鼠角膜细胞凋亡检测(tunel染色)
[0220]
造模后按分组给药，第7、14天每组随机选取小鼠脱颈处死后行眼摘，将摘取的眼球浸泡在组织固定液中固定，固定好之后将其放入包埋盒中,进行tunel染色操作。
[0221]
碱烧伤对于角膜组织的细胞伤害很大，所有治疗组的角膜上皮都有比较严重的细胞凋亡现象，见图27。但是，与其他组比较，甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液组的凋亡细胞相对较少，这表明dg-rbm可以促进上皮修复，与前面的结论一致。
[0222]
3.6 elisa检测炎症因子
[0223]
给药14天后，处死各组小鼠，显微镜下分角膜。角膜用4℃预冷的灭菌pbs清洗，角膜用液氮冷冻，使用眼科剪剪碎角膜。加入含有苯甲基磺酰氟(pmsf)的pbs，用超声破碎仪进行破碎处理，整个过程中在冰上进行。角膜破碎之后，在4℃和12000rpm条件下，离心10分
钟，将上清转移至新的离心管中。用bca蛋白试剂盒测定各样品蛋白浓度。按照试剂盒说明书步骤进行后续操作，用样品蛋白浓度校正结果。
[0224]
结果见图28～图33(*：表示与pbs相比，p＜0.05；#：表示与透明质酸钠组相比，p＜0.05；$：表示与dg-rbm组相比，p＜0.05)。与正常健康对照组相比，pbs组的小鼠角膜中vegf、tgf-β1、nf-κb、tnf-α、il-6和il-1β的表达显着增加。与其他组相比，甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液以及透明质酸钠在降低这些炎症因子表达方面显示出更好的效果。
[0225]
3.7蛋白质印迹法(western blotting，wb)
[0226]
(1)小鼠角膜蛋白提取与处理
[0227]
碱烧伤后第14天的六组小鼠，脱颈处死，用眼科镊小心摘取眼球；显微镜下仔细分离出小鼠角膜，用预冷的pbs冲角膜，蘸滤纸吸水，用干净的眼科剪将角膜剪碎；每两个角膜放在一个离心管中，加入200μl含有pmsf的ripa裂解液，用超声破碎仪在冰上进行破碎；4℃离心上述样品，上清液转移至新的离心管中；将角膜蛋白样品稀释10倍，取20μl分别加入到96孔板中，同时设置pbs孔作为空白对照；接着按bca试剂盒说明书操作并计算待测样品的蛋白浓度；充分混合蛋白样品与上样缓冲液后，金属浴95℃加热5分钟，冷却后放于-80℃冰箱冻存。
[0228]
(2)聚丙烯酰胺凝胶的制备
[0229]
使用前充分清洁玻璃板严密组装。按照sds-page分离胶配方从上向下顺序加入离心管，混匀，将分离胶注入玻璃板间。缓慢注入去离子水将胶面压平，室温静置。待分离胶聚合后，按配方制浓缩胶，各种成分按从上到下的顺序加入，混匀。在分离胶顶部灌入浓缩胶，并插入齿梳，等浓缩胶聚合。浓缩胶聚合后可以取下玻璃板4℃保鲜膜包起保存，一周内使用。
[0230]
(3)电泳
[0231]
取出制备好的胶板，将梳子轻轻平行拔出。将胶装在电泳槽上，加入电泳缓冲液,缓冲液要没过上下电阻丝。用加样枪头按预定顺序加入待测样品，及预染marker。电泳槽放在冰水中，80v电压用于浓缩胶电泳20-30分钟，120v电压用于分离胶电泳，溴酚蓝跑到底部边缘，约60-80分钟，结束电泳。
[0232]
(4)转膜
[0233]
将pvdf膜(0.45μm)先在甲醇中浸泡1分钟，将滤纸、pvdf膜和海绵放在转膜缓冲液中浸泡。电泳结束后，小心拆下凝胶，置于转膜缓冲液。打开转膜夹子，按照规定顺序将滤纸、海绵、胶、pvdf膜放好，排气泡。接通电源，始终在4℃中进行，时间90分钟。
[0234]
(5)免疫反应与化学发光
[0235]
加入5％脱脂奶粉封闭，室温孵育2h；加入一抗(抗体稀释比例为hmgb1(1:1000)稀释、rage(1:2500)稀释、gapdh(1:3000)稀释)，4℃孵育过夜；吸出一抗孵育液，用tbst漂洗；加入二抗液，室温下孵育60分钟；弃去二抗，不回收，以tbst漂洗；将pvdf膜蛋白样品侧朝上至于保鲜膜上，取等量的化学发光剂和增强剂混合，滴在pvdf膜，显影。用image j软件分析图片中蛋白条带灰度值。
[0236]
收集未进行碱烧伤的小鼠角膜和碱烧伤造模后给药第14天各组小鼠角膜，提取角膜蛋白后，进行hmgb1以及其下游蛋白tlr4(toll-like receptors 4，toll样受体4)和rage(receptor of advanced glycation endproducts，晚期糖基化产物受体)蛋白的检测，结
果见图34～图37(*：表示与pbs相比，p＜0.05；#：表示与透明质酸钠组相比，p＜0.05；$：表示与dg-rbm组相比，p＜0.05)。
[0237]
结果显示，与健康小鼠(对照)角膜相比，pbs组小鼠角膜组织中hmgb1、tlr4和rage的水平有明显程度的升高。dg-rbm(甘草酸二钾-瑞巴派特纳米胶束滴眼液)能够有效降低hmgb1、tlr4、rage的表达水平，使其趋向正常水平。因而，dg-rbm有望作为关键介质hmgb1的抑制剂，通过调控hmgb1信号通路有效预防和/或治疗眼角膜化学伤。
[0238]
当然，本发明还可以有其它多种实施方式，在不违背本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可以根据本发明作出各种相应的改变和/或变形，这些相应的改变和/或变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。