胆木提取物在制备抑制肺通透性增加和/或肺损伤的药物中的应用

1.本发明涉及一种化合物的新用途，具体涉及胆木提取物与异长春花苷内酰胺抑制肺通透 性增加和肺损伤的作用。


背景技术：

2.异常春花苷内酰胺是从胆木中分离得到的生物碱化合物，英文名：strictosamide，结构式 如下：
[0003][0004]
胆木(nauclea officinalis pierre ex pitard.)为茜草科乌檀属植物，又名乌檀、 熊胆树、黄胆木、山熊胆等，以枝、皮入药，具有清热解毒、消肿止痛的功效， 用于治疗咽喉炎、支气管炎、急性扁桃体炎等，有“植物抗生素”之称。异常春花 苷内酰胺作为胆木主要生物碱类成分，已有文献提到其可抑制lps诱导的炎症 模型及其在分子方面相应的抗炎机制，未有文献报道其抑制肺通透性增加作用及 机制。肺通透性增加是引起肺损伤的一个重要因素，急性肺肺损伤患者中多数可 以看到明显的肺部通透性增加，进而导致呼吸窘迫。目前临床上对于肺通透性增 加的治疗主要为大剂量的激素治疗，由于激素连续使用会诱发严重后遗症和并发 症，使该症状在临床上缺乏有效的治疗手段。
[0005]
现有技术中没有其它关于胆木提取物及其异常春花苷内酰胺用于肺通透性增加医药用途 的报道。


技术实现要素：

[0006]
发明目的：本发明目的是为了解决现有技术的不足，对胆木提取物或异长春花苷内酰胺 的活性进行深入研究开发其抑制肺通透性增加的新的药理用途。
[0007]
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
[0008]
胆木提取物在制备抑制肺通透性增加和/或肺损伤的药物中的应用。
[0009]
异长春花苷内酰胺在制备抑制肺通透性增加和/或肺损伤的药物中的应用。
[0010]
作为优选方案，以上所述的应用，所述的肺损伤为炎症性肺损伤疾病。所述的炎症性肺 损伤疾病包括肺炎、支气管炎、上呼吸道感染引起的肺损伤。
[0011]
作为优选方案，以上所述的胆木提取物是通过以下方法制备得到的：
[0012]
取胆木干燥茎枝，切段，粉碎，加入一定量的水浸泡提取，收集提取液，减压浓缩得
到 胆木浸膏，浸膏经萃取获得二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位，分别以不同配比二氯甲烷-乙酸乙 酯、二氯甲烷-甲醇为洗脱液，经反复硅胶柱分离得到胆木提取物。
[0013]
作为优选方案，以上所述的具有促进细胞屏障修复作用的胆木提取物，它们通过以下方法 制备得到：
[0014]
取胆木茎枝，切段，粉碎，用5～10倍体积的水分3次浸泡提取，合并提取液，浓缩得浸 膏。分别用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，分别浓缩。取乙酸乙酯部位，以体积比为95:5～10:90 的二氯甲烷-甲醇经硅胶柱洗脱，洗脱液浓缩，以tlc分析合并相似部位，得到胆木提取物 (异长春花苷内酰胺)。
[0015]
作为优选方案：以上所述的具有促进内皮修复作用的胆木提取物，它是由下列重量份数 的原料制成：
[0016]
取胆木茎枝，切段，粉碎，加入胆木重量6倍体积量的水分3次浸泡提取，每次5h，合 并提取液，浓缩得浸膏。加入浸膏重量3倍体积的萃取液，分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙 酯萃取部位。取乙酸乙酯部位，按体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇经 硅胶柱洗脱，洗脱液浓缩，以tlc分析合并相似部位，得到胆木提取物(异长春花苷内酰胺)。
[0017]
作为优选方案，以上所述的具有抑制肺通透性增加作用的胆木提取物在制备防治炎症性 肺损伤相关性疾病中的应用。
[0018]
作为优选方案，以上所述的炎症性肺损伤相关性疾病包括：肺炎、支气管炎、上呼吸道 感染引起的肺损伤。
[0019]
根据以上所述的应用，将胆木提取物或异长春花苷内酰胺与药学上可接受的载体制备成 颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、合剂、丸剂、涂剂、膏剂或透皮吸收制剂。
[0020]
本发明在制成片剂时，把胆木提取物浸膏粉添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑 剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
[0021]
本发明在制成胶囊剂时，把胆木提取物浸膏糊精或淀粉混合均匀，制粒，然后装胶囊制 成胶囊剂。
[0022]
本发明在制成颗粒剂时，把胆木提取物浸膏加糊精等混合均匀，制粒，干燥，制成颗粒 剂。
[0023]
本发明在制成合剂时，胆木提取物加纯化水溶解，制成合剂。
[0024]
本发明在制成口服液时，把胆木提取物加纯化水溶解，加入甜菊素或阿斯巴坦，调ph， 制成口服液。
[0025]
有益效果：本发明提供的具有抑制肺通透性增加的胆木提取物和现有技术相比具有以下 优点：
[0026]
(1)本发明提供的具有抑制肺通透性增加、防治肺损伤的胆木提取物，本发明基于抑制 肺通透性的相关机制研究，在理论指导下，深入研究异长春花苷内酰胺的生物活性，通过动 物实验研究表明，本发明通过优选方法制备得到的胆木生物碱(异常春花苷内酰胺)，能明 显抑制肺通透性的作用。
[0027]
(2)本发明提供的具有抑制肺通透性的胆木提取物，可以方便和药学载体制备成多种剂 型，临床上服用方便，且经急性毒性试验表明，本发明制备得到的胆木提取物(异常春花苷 内酰胺)，毒性低，应用安全。
附图说明
[0028]
图1中a为肺组织w/d比值，b为balf中的蛋白含量。所有数据均用mean
±
sem表 示。##p＜0.01与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01与lps组相比。
[0029]
图2中a为balf中的总细胞数。b为肺组织中的mpo活性。所有数据均用mean
±
sem 表示。##p＜0.01与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01与lps组相比。
[0030]
图3中a为肺组织中claudin-5的表达水平，b为肺组织中ve-cadherin的表达水平。所 有数据均用mean
±
sem表示。##p＜0.01与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01与lps组相 比。
[0031]
图4中a为肺组织中vegf的表达水平。b为肺组织中p-akt/akt蛋白的表达水平。所 有数据均用mean
±
sem表示。##p＜0.01与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01与lps组相 比。
具体实施方式
[0032]
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利 要求书中所详细描述的本发明。
[0033]
实施例1
[0034]
1、一种具有抑制肺通透性作用的胆木提取物，它通过以下方法制备得到：
[0035]
取胆木茎枝，切段，粉碎，加入胆木重量6倍体积量的水分3次浸泡提取，每次5h，合 并提取液，浓缩得浸膏。加入浸膏重量3倍体积的萃取液，分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙 酯萃取部位。取乙酸乙酯部位，按体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇经 硅胶柱洗脱，洗脱液浓缩，以tlc分析合并相似部位，再以体积浓度为60％和70％甲醇经 ods柱洗脱，得到一个胆木提取物：异常春花苷内酰胺。
[0036]
具体数据如下：
[0037]
淡黄色粉末(常温)，1hnmr(500mhz,cdcl3)δ11.41(d,j＝2.2hz,1h),11.36(d,j＝7.8 hz,1h),11.26(d,j＝8.1hz,1h),11.03(t,j＝7.5hz,1h),10.94(t,j＝7.4hz,1h),9.51
–
9.42 (m,2h),9.24(d,j＝17.1hz,1h),9.17
–
9.09(m,1h),9.04
–
8.99(m,1h),8.67(d,j＝7.9hz, 1h),7.87(d,j＝11.9hz,1h),7.66(d,j＝5.4hz,1h),7.35(d,j＝8.9hz,1h),7.29(dd,j＝11.3, 5.2hz,3h),7.23
–
7.15(m,2h),6.69(dd,j＝15.5,9.6hz,3h),6.41(dd,j＝9.3,3.6hz,1h), 5.40(d,j＝12.2hz,1h).13c nmr(126mhz,cdcl3)δ168.58(c-22),151.57(c-17),140.81 (c-13),137.09(c-2),136.44(c-19),130.48(c-8),125.08(c-11),123.05(c-18),122.57 (c-10),121.40(c-9),114.55(c-12),111.84(c-7),111.59(c-16),102.17(c-1’),99.96 (c-21),80.87(c-3’),80.53(c-5’),77.37(c-2’),74.12(c-4’),65.22(c-6’),57.31 (c-3),47.03(c-5),43.76(c-20),35.16(c-14),29.87(c-15),24.58(c-6).
[0038]
取胆木提取物加入适量淀粉，制粒，干燥，装胶囊，即得。
[0039]
实施例2
[0040]
取胆木茎枝，切段，粉碎，加入胆木重量6倍体积量的水分3次浸泡提取，每次5h，合 并提取液，浓缩得浸膏。加入浸膏重量3倍体积的萃取液，分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙 酯萃取部位。取乙酸乙酯部位，按体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲
醇经 硅胶柱洗脱，洗脱液浓缩，以tlc分析合并相似部位，再以体积浓度为60％和70％甲醇经 ods柱洗脱，得到一个胆木提取物：异常春花苷内酰胺。
[0041]
经现代波谱学鉴定提取物为异常春花苷内酰胺，经现代波谱学鉴定同实施例1。
[0042]
取胆木提取物加入纯化水溶解，加入甜菊苷适量，调节ph至5.5，分装，灭菌即得。
[0043]
实施例3
[0044]
1.胆木提取物抑制肺组织通透性的药效学实验，具体通过以下方法执行：
[0045]
将小鼠随机分为6组，每组12只。分别为对照组、模型组、异常春花苷内酰胺(100mg/kg) 组、异常春花苷内酰胺(200mg/kg)组、异常春花苷内酰胺(400mg/kg)组、地塞米松组(5mg/kg) 组。对照组和模型组给予生理盐水，异长春花苷内酰胺组按上述剂量灌胃给药7天，1次/d， 地塞米松组造模前1h腹腔注射给药一次。
[0046]
末次给药后1h，除正常组外，其它组小鼠腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg)对小鼠进 行麻醉，以气管内滴注脂多糖(lps，5mg/kg)诱导肺损伤模型。lps刺激小鼠6h后麻醉 小鼠，收集支气管肺泡灌洗液(balf)，lps刺激小鼠24h后，收集肺组织放至-80℃冰箱中 冻存，待用。
[0047]
2.肺组织湿/干重比值和balf中的蛋白含量测定
[0048]
取小鼠左肺用微量电子天平称取重量，即为湿重，然后置于80℃恒温烤箱中烘烤48h， 直至肺组织重量恒定，再次称取的肺组织重量即为干重。分别记录并计算各小鼠肺组织的湿/ 干重(w/d)比值。将收集的balf离心(4℃，3000rpm，15min)，上清用bca试剂盒检 测总蛋白浓度。
[0049]
3、实验结果：
[0050]
3.1肺血管通透性增加是急性肺损伤的特征，因此本发明通过测定肺w/d比值和蛋白含 量来观察毛细血管的渗漏情况。lps刺激后会引起肺水肿，如图1a所示，与对照组相比lps 处理之后肺w/d比值明显增加。相反，dm治疗之后w/d比值明显降低。如图1b所示，balf 中的蛋白浓度在lps刺激之后也明显增加。然而与lps组相比，dm就可以显著的降低balf 中的蛋白含量。同时，dxm处理也降低了肺w/d比值和蛋白含量。结果表明胆木可以抑制 肺组织内皮通透性增加。
[0051]
3.2balf中细胞数和肺组织髓过氧化物酶(mpo)活性测定
[0052]
将balf离心后的沉淀细胞用pbs重悬、混匀然后用细胞计数器进行细胞计数。取小鼠 的右肺组织，用生理盐水匀浆。采用mpo测定试剂盒检测肺组织匀浆中mpo的活性。
[0053]
大量炎症细胞浸润是急性肺损伤的一个重要标志，本实验通过测定balf中的总细胞数 来观察细胞渗漏的情况。如图2a所示，lps刺激之后大量炎症细胞进入balf中。而dm 和dxm处理后显著降低了balf中的细胞数。
[0054]
肺组织匀浆中mpo的活性是反映急性肺损伤时中性粒细胞浸润的重要指标，通过测定 肺组织mpo活性，观察dm对lps诱导ali小鼠肺组织中性粒细胞浸润的影响。如图2b 所示，lps可以使mpo的活性升高，dm治疗后显著降低了肺组织中mpo的活性。结果表 明，胆木可以改善肺组织内皮渗漏。
[0055]
实施例4内皮细胞损伤修复的机制研究实验
[0056]
1.wb蛋白印迹实验：
[0057]
分别取对照组、模型组、异常春花苷内酰胺(100mg/kg)组、异常春花苷内酰胺
(200mg/kg) 组、异常春花苷内酰胺(400mg/kg)组、地塞米松(5mg/kg)组小鼠肺组织。肺组织用含pmsf 及磷酸酶抑制剂的ripa裂解液来提取蛋白，采用bca蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。样品 经sds-page电泳分离后转移到pvdf膜上。在室温下用5％脱脂牛奶封闭膜1h，然后与一 抗在4℃下孵育过夜。次日将膜用tbst清洗后，在室温下用过氧化物酶偶联的二抗孵育1h。 然后用ecl检测试剂盒的化学发光成像系统检测蛋白信号。
[0058]
2.实验结果：
[0059]
经过wb实验分析后，结果显示，在lps处理后，小鼠肺组织中的claudin-5和ve-cadherin 蛋白表达下调。然而，经dm治疗后，显著上调了肺组织中的claudin-5(图3a)和ve-cadherin (图3b)的表达水平。这些数据表明胆木可以通过上调claudin-5和ve-cadherin的表达，促进 细胞间的连接，维持内皮屏障的完整性。
[0060]
pi3k/akt参与了多种生物学过程，包括细胞增殖、迁移、凋亡和血管生成。我们检测了 vegf、p-akt/akt蛋白的表达。实验发现lps处理后的小鼠肺组织中vegf(图4a)、p-akt/akt 蛋白(图4b)的表达显著降低。然而，与lps组相比，dm治疗组和dxm治疗组显著上调了 vegf、p-akt/akt蛋白的表达。提示胆木治疗后通过激活vegf、p-akt/akt蛋白来维持内皮 通透性的平衡进而促进内皮屏障修复。
[0061]
以上结果表明，胆木提取物(异常春花苷内酰胺)具有较好的抑制肺通透性的作用，且 安全性高。它可以作为有效成分用来制备改善血管内皮细胞通透性和促进内皮屏障修复相关 疾病的药物。另外，它还可以作为有效成份用来制备炎症性肺损伤疾病的药物。
[0062]
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解 本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的 等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。