一种鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂及制备方法和应用与流程

1.本发明涉及疫苗耐热保护剂领域，特别是一种鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂及制备方法和应用。


背景技术：

2.坦布苏病毒病俗称“黄病毒病”、“出血性卵巢炎”，最早于2010年在浙江某鸭群被发现，随后证明它是由坦布苏病毒感染引起的。该病可造成产蛋鸭、鹅群产蛋率骤然下降至绝产，亦可引起雏鸭、鹅出现共济失调、瘫痪和死亡。给我国水禽养殖业造成了严重的经济损失。随着鸭群在产前多使用免疫效果更确实的活疫苗进行免疫预防，当前临床上已鲜有该病引起降蛋的案例发生。坦布苏病毒病活疫苗以及大多数兽用活疫苗产品使用常规冻干保护剂。常规保护剂主要成分为脱脂牛奶、蔗糖、明胶等，组方简单、配制简便、易溶性良好，但热稳定性和保护功能差，产品的保存条件较为苛刻，大多需要在
‑
15℃以下保存。在疫苗生产、运输以及使用过程中，如果冷链系统控制不当，疫苗保存环境温度升高，常常导致疫苗效力下降或失效，造成免疫失败。发达国家早在20世纪80年代就开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热保护剂生产活疫苗，但由于保护剂的研究和应用均属于专利资料，各国都处于保密状态，耐热冻干保护剂比常规的冻干保护剂更周到地考虑了具有生物活性的制品在较高温度和较长保存时间的情况下，冻干过程可能产生的物理和化学变化对活疫苗存活的影响，通过添加填充剂、防冻剂、抗氧化剂、酸碱调整剂、缓冲剂、羟基中和剂、低分子化合物、高分子化合物等，确保病毒在2～8℃条件下，保存期可达24个月，效价无明显下降，因而其保护性能要比传统保护剂更为优良，从而使活疫苗的储存、运输和使用更方便、经济。随着我国规模化养殖的飞速发展，养殖密度加大，防疫模式也要相应的变化，防疫质量是其中的关键问题，活疫苗的冷链运输及储存温度要求非常高，控制不好直接影响疫苗质量，耐热保护剂的研制开发显得尤为重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的是要解决鸭坦布苏病毒病疫苗因冷链运输控制不好影响疫苗质量的问题，提供一种鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂及制备方法和应用。
4.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
5.本发明的第一个目的是要提供一种鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂，由以重量百分比计的组份组成：明胶0.8～1.2％、多聚蛋白胨3～6％、胰蛋白胨2～5％、酶解酪蛋白3～6％、乳糖5～10％、蔗糖1～3％、硫脲1～5％、聚乙烯吡咯烷酮0.5～3％、葡聚糖0.1～1％、山梨醇0.1～2％，余量为注射用水。
6.作为本发明的优选方案，所述鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂，由以重量百分比计的组份组成：明胶1％、多聚蛋白胨4.5％、胰蛋白胨3％、酶解酪蛋白3.5％、乳糖10％、蔗糖3％、硫脲2.5％、聚乙烯吡咯烷酮1.2％、葡聚糖0.6％、山梨醇0.6％，余量为注射用水。
7.作为本发明的优选方案，所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮pvpk30。
8.本发明的第二个目的是要提供一种如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.用玻璃容器称取配制总体积的3/5蒸馏水，按顺序依次将明胶、多聚蛋白胨、胰蛋白胨、酶解酪蛋白、乳糖、蔗糖、硫脲、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、山梨醇加入蒸馏水中，将玻璃容器置于超声波加热水浴中，搅拌加热及超声波高频振动使各组分完全溶解后加入余量注射用水，再进行灭菌处理。
10.作为本发明的优选方案，所述灭菌处理为：于116℃下灭菌处理20分钟。
11.本发明的第三个目的是要提供一种如权利要求1或2所述的鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂的应用，其特征在于：所述鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂用于制备鸭坦布苏病毒病活疫苗。
12.进一步地，制备鸭坦布苏病毒病活疫苗的具体步骤为：将鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂与鸭坦布苏病毒原液按体积比1:1.5混合分装，经真空冷冻干燥处理得鸭坦布苏病毒病活疫苗。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
14.本发明耐热保护剂，各组分相互作用，提高疫苗冻干过程中对温度的耐受性，减少效力损失，冻干前后病毒损失率不超过0.3个滴度。
15.本发明鸭坦布苏病毒病冻干耐热保护剂用于鸭坦布苏病毒病活疫苗，活疫苗耐老化程度高，37℃放置15天，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.2～0.3个，2～8℃条件下可存放36个月，滴度无明显下降，说明本发明解决了常规保护剂活疫苗因冷链运输控制不好影响疫苗质量的问题。
16.本发明耐热保护剂的原料成本低、配制方法简单、可实现工业大规模生产。
具体实施方式
17.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
18.实施例1
19.用玻璃容器称取配制总体积的3/5蒸馏水，按顺序依次将重量百分比为：明胶0.8％、多聚蛋白胨3％、胰蛋白胨2％、酶解酪蛋白3％、乳糖5％、蔗糖1％、硫脲1％、聚乙烯吡咯烷酮pvpk30 0.5％、葡聚糖0.1％、山梨醇0.1％加入蒸馏水中，将玻璃容器置于超声波加热水浴中，搅拌加热及超声波高频振动使各组分完全溶解后加入余量注射用水，于116℃下灭菌处理20分钟，即制得鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂。
20.实施例2
21.用玻璃容器称取配制总体积的3/5蒸馏水，按顺序依次将重量百分比为：明胶1.2％、多聚蛋白胨6％、胰蛋白胨5％、酶解酪蛋白6％、乳糖10％、蔗糖3％、硫脲5％、聚乙烯吡咯烷酮pvpk30 3％、葡聚糖1％、山梨醇2％加入蒸馏水中，将玻璃容器置于超声波加热水浴中，搅拌加热及超声波高频振动使各组分完全溶解后加入余量注射用水，于116℃下灭菌处理20分钟，即制得鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂。
22.实施例3
23.用玻璃容器称取配制总体积的3/5蒸馏水，按顺序依次将重量百分比为：明胶1％、
多聚蛋白胨4.5％、胰蛋白胨3％、酶解酪蛋白3.5％、乳糖10％、蔗糖3％、硫脲2.5％、聚乙烯吡咯烷酮pvpk30 1.2％、葡聚糖0.6％、山梨醇0.6％加入蒸馏水中，将玻璃容器置于超声波加热水浴中，搅拌加热及超声波高频振动使各组分完全溶解后加入余量注射用水，于116℃下灭菌处理20分钟，即制得鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂。
24.对比实施例1
25.选用鸭坦布苏病毒病常规保护剂，包括以下重量组分：明胶10％、蔗糖40％，余量补注射用水。配制方法：称取配制总体积的3/5注射用水，将明胶、蔗糖依次溶解，待上种试剂完全溶解后再进行下个试剂的溶解，待全部溶解后余量补注射用水，116℃高压灭菌20分钟，即得对比例保护剂。
26.实施例4
27.本实施例记载了所述鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂可以用于制备鸭坦布苏病毒病活疫苗，其具体步骤为：将实施例3制得的鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干保护剂与鸭坦布苏病毒原液按体积比1:1.5混合分装，经真空冷冻干燥处理得鸭坦布苏病毒病活疫苗，记为耐热保护剂疫苗。另外，取对比例保护剂与鸭坦布苏病毒原液按1：7混合配苗分装，1.7ml/瓶，然后立即进行真空冷冻干燥，记为常规保护剂疫苗。
28.对实施例冻干疫苗的检测
29.1、产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验、安全性检验、剩余水分测定和真空度测定按《中国兽药典》进行检验。
30.2、冻干周期不超过48小时。
31.3、保护剂毒性试验
32.按产品当中含保护剂量的10倍量，肌肉接种21～35日龄易感鸭10只，每只0.2ml，接种后连续观察14日，应不出现任何不良反应。
33.4、病毒含量测定及标准
34.(1)测定方法
35.按瓶签注明羽份，用维持液稀释成每0.1ml含1羽份，再用维持液作10倍系列稀释，取1取10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑64个稀释度分别接种在生长良好的df
‑
1细胞的96孔板上，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，置37℃、含5％co2的细胞培养箱中继续培养6日，观察并记录细胞病变，根据reed
‑
muench法计算tcid50。
36.(2)达到标准
37.①
冻干病毒损失率为0.4个滴度以内。
38.②
冻干后每羽份病毒含量应≥10
4.0
tcid50。
39.③
产品37℃条件下保存15天，病毒损失率为0.3个滴度以内，每羽份病毒含量应≥10
3.5
tcid50。
40.④
产品在2～8℃条件下保存36个月，病毒损失率为0.3个滴度以内，每羽份病毒含量应≥10
3.5
tcid50。
41.通过上述方法对耐热保护剂疫苗和常规保护剂疫苗进行检测，检测结果如下：
42.(1)性状：淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解；
43.(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，各样品均无菌生长；
44.(3)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，各样品均无支原体生长；
45.(4)外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，各样品均无外源病毒污染；
46.(5)鉴别检验：将疫苗用维持液稀释至10
2.0
tcid50/0.1ml，与等体积抗鸭坦布苏病毒特异性单克隆抗体(中和抗体效价不低于10)混合，37℃中和1小时，接种生长良好的df
‑
1细胞的96孔细胞培养板10孔，每孔0.2ml；同时设病毒对照和维持液对照，各接种10孔。置37℃、含5％co2的细胞培养箱中培养6日，观察并记录细胞病变(cpe)。各样品病毒对照孔均产生cpe，而中和孔与维持液对照孔应无cpe出现；
47.(6)安全检验：每批样品任抽3瓶，按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释为每0.2ml含10羽份，等量混合后，肌肉接种21～35日龄健康易感鸭10只，每只0.2ml，接种后连续观察14日。所有样品均未出现由疫苗引起的任何症状
48.(7)效力检验
49.病毒含量测定
50.每批样品任抽1瓶，按瓶签注明羽份，用维持液稀释成每0.1ml含1羽份，再用维持液作10倍系列稀释，取10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑64个稀释度，分别接种在生长良好的df
‑
1细胞的96孔板上，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，置37℃、含5％co2的细胞培养箱中继续培养6日，观察并记录细胞病变，根据reed
‑
muench法计算tcid50。所有样品每羽份病毒含量均≥10
3.5
tcid50。
51.血清法
52.每批次任抽1瓶，按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释为每0.2ml含1羽份，肌肉接种21～35日龄健康易感鸭10只，每只0.2ml。另10只不接种，作为对照。接种后14日，所有鸭采血，分离血清，用鸭坦布苏病毒elisa抗体检测方法测定抗体效价。所有样品接种鸭应10只的elisa抗体效价均≥20，对照鸭的elisa抗体效价应均＜5。
53.(8)剩余水份测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，各样品剩余水份均≤3.5％；
54.(9)真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，各样品真空度均合格。
55.耐热保护剂疫苗和常规保护剂疫苗在不同条件和放置不同时间病毒含量情况，单位是lgtcid
50
/羽份，具体检测结果如下：
56.(1)鸭坦布苏病毒病活疫苗冻干前后毒价变化如表1所示：
57.表1
[0058][0059]
从表1结果可以看出，通过3次重复试验可以看出采用本发明的耐热保护剂疫苗在冻干过程的保护性能略优于常规保护剂疫苗，冻干损失0.2滴度以内。
[0060]
(2)鸭坦布苏病毒病活疫苗耐老化实验和保存期实验
[0061]
将耐热保护剂疫苗和常规保护剂疫苗，分别置37℃和2～8℃保存，定期取出若干瓶，检测病毒含量变化情况，其结果见表2表3。
[0062]
表2
[0063][0064]
表3
[0065][0066]
由表2可知，常规保护剂疫苗通过3次重复实验数据可以看出在37℃耐热15天，病毒含量降低2.6～2.8个滴度，耐热保护剂疫苗损失在0.3个滴度以内。
[0067]
由表3可知，常规保护剂疫苗通过3次重复实验数据可以看出在2～8℃保存36个月，病毒含量降低2～2.16个滴度，耐热保护剂疫苗损失在0.3个滴度以内。
[0068]
上述实验结果可见，本发明的耐热保护剂能有效提高鸭坦布苏病毒病活疫苗的保存期。
[0069]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。