1.本发明涉及基因工程技术领域，涉及一种抗棘球蚴感染的亚单位疫苗及其制备方法，尤其涉及一种抗加拿大棘球蚴感染的亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术：
2.棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球蚴属绦虫的幼虫——棘球蚴(hydatid cyst)寄生于人和动物的肺、肝等组织器官而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。棘球蚴病流行广，呈世界性分布，世界动物卫生组织(world organization for animal health；法语：office international des
é
pizooties，oie)将棘球蚴病归为全球通报的传染病，归属为多种动物共患病；世界卫生组织(world health organization，who)将棘球蚴病列为全球早期预警系统优先预测和应急处置的疾病之一。棘球蚴病也是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。
3.根据病灶的形态及感染病原的差异，棘球蚴病主要分为细粒棘球蚴病(cystic echinococcosis,ce)和多房棘球蚴病两种，其中细粒棘球蚴病分布最广，患者人数最多。ce的致病原目前由几个棘球绦虫复合种构成：狭义细粒棘球绦虫(echinococcus granulosus)、加拿大棘球绦虫(echinococcus.canadensis)、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫，其中由狭义细粒棘球绦虫g1型引起的ce超过90％，而由加拿大棘球蚴绦虫g6型引起的ce超过7％。
4.目前研究表明控制棘球蚴病的流行主要是通过切断棘球绦虫发育环节，控制人、畜等中间宿主对棘球蚴的感染，预防或驱虫治疗犬类等终宿主，阻断虫卵的大范围播散。其中对于中间宿主接种疫苗可以有效控制细粒棘球蚴病的流行lightowlers等发现eg95是存在于eg中的一种分子量为24.5kda的天然六钩蚴抗原，其编码基因全长715bp，其中462bp基因可编码分子量为16.5kda的含153个氨基酸的蛋白质，并且是筛选的众多蛋白中最有效的保护性抗原，已有成功研制抗羊细粒棘球蚴病的疫苗。然而现有抗羊细粒棘球蚴病的疫苗对加拿大棘球蚴绦虫g6型无明显保护性。
技术实现要素：
5.鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提出一种抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法，可以预防加拿大棘球蚴的感染，具有安全、高效、成本低等诸多优点。其中所述抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中包含免疫原的ec95抗原蛋白和药学上可以接受的载体。
6.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中，所述dec95蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中，所述dec95蛋白可以是单体，也可以是用多肽串联起来的单链多聚体，举例为二聚体2dec95，三聚体3dec95，四聚体4dec95，五聚体5dec95。
8.本发明的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗二次免疫后第4周即能达到不低于1:1024的抗体效价，且能维持长时期高滴度抗体效价。
9.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中dec95抗原蛋白含量为20-100μg/ml。
10.抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中，所述的dec95抗原蛋白含量可选自20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml。
11.即使当抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中dec95蛋白抗原含量仅为40μg/ml，二次免疫后第4周也能达到不低于1:128的抗体效价，且能维持长时期的高滴度的抗体效价。
12.作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中，所述的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中ec95蛋白抗原含量为60μg/ml。
13.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、dda；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽、montanide isa 206、gel佐剂中的一种或几种；优选地，montanide isa 50v。
14.所述佐剂含量为5％-60％v/v，优选从20％-60％v/v，更优选50％v/v。
15.作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)和白介素2(il2)。
16.为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
17.本发明还涉及一种制备所述抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将加拿大棘球蚴中2dec95抗原蛋白的基因(如seq id no.6所示)分别扩增、克隆到表达载体，得到含有加拿大棘球蚴2dec95抗原蛋白基因的重组表达载体；步骤(2)将所述步骤(1)得到的含有加拿大棘球蚴2dec95抗原蛋白基因的重组表达载体转化或转导宿主，得到含有所述重组表达载体的重组子；步骤(3)培养所述步骤(2)得到的重组子，表达加拿大棘球蚴2dec95抗原蛋白；以及步骤(4)纯化所述步骤(3)得到的所述加拿大棘球蚴2dec95抗原蛋白，加入佐剂，得到所述抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗。
18.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的方法中，所述步骤(1)中的所述加拿大棘球蚴dec95抗原蛋白氨基酸序列如seq idno.1或其简并序列所示；所述步骤(2)中的宿主为e.coli。所述步骤(3)中所述表达的加拿大棘球蚴2dec95抗原蛋白为细胞内可溶性蛋白。
19.本发明还涉及所述的抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗在制备预防和/或治疗加拿大棘球蚴感染的药物中的应用。
20.本发明所述的制备预防和/或治疗加拿大棘球蚴感染的药物的施用对象包括羊、牛、骆驼。
21.本发明中，大肠杆菌24a-2dec95(escherichia coli 24a-2dec95)，已经于2021年6月23日递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:m 2021749。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
23.1)目前尚无抗加拿大棘球蚴感染的疫苗，本发明采用2dec95蛋白作为抗原，制备的抗加拿大棘球蚴感染的亚单位疫苗生产成本低，生产工艺简单，具有安全、高效、成本低等诸多优点；
24.2)本发明中，即使当抗加拿大棘球蚴亚单位疫苗中dec95蛋白抗原含量仅为40μg/ml，二次免疫后第4周也能达到1:128以上的抗体效价，且能维持长时期的高滴度的抗体效价。
附图说明
25.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
26.图1：蛋白纯化结果；其中，泳道m：蛋白标准分子量；泳道1：蛋白样品p-24a-2dec95；泳道2：蛋白样品p-24a-2deg95；泳道3：蛋白样品p-mal-2dec95；
27.图2：竞争elisa检测结果。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
29.实施例1：重组载体的构建
30.1.1基因序列的合成。以e.coli为宿主菌，本发明对编码重组蛋白2deg95、2dec95、2aec95的碱基序列进行了密码子的优化，优化后的碱基序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其中，将deg95氨基酸通过“gggsgggs”连接，构建得到单链同源二聚体2deg95；将dec95氨基酸通过“gggsgggs”连接，构建得到单链同源二聚体2dec95，将aec95氨基酸通过“gggsgggs”连接，构建得到单链同源二聚体2aec95。2dec95的氨基酸序列如seq id no.2所示，2aec95的氨基酸序列如seq id no.7所示。
31.1.2重组表达载体pet24a-2dec95的构建。
32.(1)以2dec95为模板，设计上游引物nde i-f和下游引物xho i-r，pcr扩增得到基因片段2dec95，上游引物的5’端引入限制性内切酶nde i位点及保护性碱基，其中nde i位点序列为catatg；下游引物的5’端引入限制性内切酶xho i位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中xho i位点序列为ctcgag。引物序列及pcr反应程序如表1和表2所示。
33.表1：pcr引物名称及序列
34.引物名称序列nde i-f5
’‑
ggtccatatgcatcaccatcatcaccacctg-3’seq id no.4xho i-r5
’‑
ccgctcgagtta gacggtagattcttttttaccagc-3’seq id no.5
35.表2：pcr反应程序
[0036][0037][0038]
(2)将扩增得到的基因片段2dec95，用内切酶nde i和内切酶xho i消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶nde i和内切酶xho i处理的pet24a原核表达载体，连接产物转化e.coli dh5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pet24a-2dec95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
[0039]
1.3重组载体pet24a-2deg95、pmal-2dec95、pet24a-2aec95。参考1.2的实验步骤，分别(1)将基因序列2deg95连接到载体pet24a，酶切位点为nde i/xho i，得到重组载体pet24a-2deg95，所用克隆模板为2deg95基因，所用引物nde i-f序列如seq id no.4所示，和引物xho i-r序列如seq id no.5所示；(2)将基因序列2dec95连接到载体pmal，酶切位点为ndei/ecori，得到重组载体pmal-2dec95，所用克隆模板为2dec95基因，所用引物nde i-f序列如seq id no.4所示，和引物ecori-r序列如seq id no.8所示；(3)将基因序列2aec95连接到载体pet24a，酶切位点为nde i/xho i，得到重组载体pet24a-2aec95，所用克隆模板为2aec95基因，所用引物nde i-f序列如seq id no.4所示，和引物aec95-xho i-r序列如seq id no.9所示。以上所得重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。其中，2deg95的氨基酸序列如seq id no.3所示，2aec95的氨基酸序列如seq id no.7所示。
[0040]
实施例2：重组菌的构建
[0041]
2.1原始种子的构建。将上述的pet24a-2dec95、pet24a-2deg95、pmal-2dec95、pet24a-2aec95。分别转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，涂布于含有相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的lb培养基平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的3ml液体培养基，37℃培养，从中取1ml菌液加入终浓度为8％的甘油，-80℃冷冻保存，分别得到重组工程菌24a-2dec95、24a-2deg95、mal-2dec95、24a-2aec95，作为原始种子库。
[0042]
2.2原始种子的鉴定。
[0043]
(1)形态和生化特性：本工程菌为革兰氏阴性短杆菌。能发酵分解葡萄糖，产酸产气；吲哚试验、甲基红试验均呈阳性；voges-proskauer二氏试验(v.p试验)、枸橼酸盐试验均呈阴性。
[0044]
(2)培养特性：在lb固体培养基上生长形成圆形、边缘整齐、隆起、乳白色有光泽的光滑菌落。
[0045]
(3)纯粹检验：按《中华人民共和国兽药典》附录中纯粹检验法进行检验，结果纯
粹。
[0046]
实施例3：重组菌的发酵
[0047]
将菌株接种到500ml含相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的lb培养基中，在37℃条件下震荡培养至od
600
值为1.2～1.5时，按照10％的接种量，将种子液接种至5l发酵罐中进行发酵培养，当菌体od
600
值达到20～25时，降低培养温度至28℃，同时添加iptg至终浓度为0.4mm，诱导12～14h。离心收集菌体湿重约500g。
[0048]
按照每克湿菌体加10毫升重悬缓冲液(20mm tris-hcl ph 7.5，500mm nacl)重悬菌体。
[0049]
实施例4：重组抗原的纯化
[0050]
4.1利用均质机对重悬菌液进行破碎，压力700bar，破碎4次。
[0051]
4.2裂解液28000g离心40分钟，取上清。
[0052]
4.3采用亲和层析的方式进行纯化，蛋白层析设备为akta pure 150m蛋白纯化仪。
[0053]
(1)关于重组蛋白p-24a-2dec95、p-24a-2deg95、p-24a-2aec95，采用的层析填料为ni sepharose 6ff，平衡液为20mm tris-hcl ph 7.5，500mm nacl，洗杂液为30mm咪唑，洗脱液为500mm咪唑；
[0054]
(2)关于重组蛋白p-mal-2dec95，采用的层析填料为dextrin sepharose high performance，平衡液为20mm tris-hcl,200mm nacl,1mm edta,1mm dtt,ph 7.4，洗脱液为20mm tris-hcl,200mm nacl,1mm edta,1mm dtt,10mm maltose,ph 7.4。
[0055]
4.4无菌过滤。在超净工作台中，将样品用0.22μm的无菌过滤器进行除菌过滤，并分装在无菌样品瓶中。
[0056]
4.5sds-page电泳分析蛋白纯化情况，如图1所示，结果表明目的蛋白完全与层析柱结合，并被洗脱液洗脱。一步纯化得到的目的蛋白纯度大于85％。
[0057]
实施例5：重组抗原的理化分析
[0058]
5.1无菌试验。按《中华人民共和国兽药典》附录中无菌检验法进行检验，结果为无菌。
[0059]
5.2抗原蛋白浓度检测和纯度检测。采用灰度分析法，取样进行sds-page电泳，用凝胶成像仪对样品的各条带浓度和纯度进行分析。结果如表3。
[0060]
表3：蛋白样品纯度及浓度结果
[0061]
样品纯度(％)浓度(mg/ml)p-24a-2deg9588.500.79p-24a-2dec9585.300.74p-mal-2dec9589.601.84
[0062]
5.3 2017年版《兽药质量标准》中《羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗》质量标准要求抗原百分含量≥15％，本发明测得的p-24a-2deg95、p-24a-2dec95抗原百分含量分别是标准的5.90倍、5.69倍。
[0063]
实施例6：不同佐剂样品的制备
[0064]
(1)水溶性复合物佐剂gel疫苗样品制备。
[0065]
将p-24a-2dec95抗原用pbs稀释至100μg/ml，与20％(体积百分比)gel佐剂按照体积比1:1进行混合，4℃静置12h，得疫苗样品v-24a-2dec95-gel。
[0066]
(2)水佐剂quila疫苗样品制备。
[0067]
将p-24a-2dec95抗原用pbs稀释至100μg/ml，与1mg/ml quila佐剂按照体积比1:1进行混合，4℃静置12h，得疫苗样品v-24a-2dec95-quila。
[0068]
(3)油佐剂montanide isa 50v疫苗样品制备。
[0069]
将p-24a-2dec95抗原用pbs稀释至100μg/ml，与montanide isa 50v佐剂按照体积比1:1进行乳化，4℃静置12h，得疫苗样品v-24a-2dec95-50v。
[0070]
实施例7：不同佐剂疫苗样品羔羊免疫实验
[0071]
(1)筛选32只阴性羔羊，羊只要求如下表4。
[0072]
表4：动物筛选要求
[0073][0074][0075]
(2)免疫操作过程如下表5所示。
[0076]
表5：免疫操作程序
[0077][0078]
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行elisa抗体检测。结果表明疫苗组二免后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，抗体持续期至少二免后48周，油佐剂montanide isa 50v疫苗组明显优于其他两个疫苗组，具体如下表6、表7、表8和表9所示。
[0079]
表6：v-24a-2dec95-gel抗体效价检测结果
[0080][0081]
表7：v-24a-2dec95-quila抗体效价检测结果
[0082][0083]
表8：v-24a-2dec95-50v抗体效价检测结果
[0084][0085]
表9：pbs抗体效价检测结果
[0086][0087][0088]
实施例8：乳化条件的优化
[0089]
根据以下优化实验，最终选择剪切转速14000rpm、剪切时间10min、油水比1:1作为最优乳化条件。
[0090]
(1)优化乳化过程中使用的剪切力。分别使用12000rpm、14000rpm和16000rpm，根据乳化样品的均一性和稳定性判定，结果14000rpm优于16000rpm优于12000rpm。
[0091]
(2)优化乳化时间。在适当剪切速度下，分别剪切8min、10min和12min，根据乳化样品的均一性和稳定性判定，结果10min优于12min优于8min。
[0092]
(3)优化油水的比例。分别选取油水比为0.8:1、1:1和1.2:1，根据乳化样品的均一性和稳定性判定，结果1:1优于1.2:1优于0.8:1。实施例8：不同抗原含量重组疫苗的制备。
[0093]
8.1取适量佐剂montanide isa 50v，121高压灭菌30min，备用。
[0094]
8.2取实施例5中纯化得到的蛋白样品p-24a-2dec95，根据测得的浓度，用无菌pbs分别稀释至80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml。
[0095]
8.3按照油:水＝1:1(v:v)的比例，准备适量的佐剂，至于烧杯中，将剪切头浸至佐剂中。
[0096]
8.4预乳化。开始剪切，向正在剪切的佐剂中缓慢加入水相，确保混合均匀。
[0097]
8.5乳化。14000rpm剪切速度下，剪切10分钟，延搅拌头移动烧杯确保乳化均匀。
[0098]
8.6分析。乳液制备完毕，室温下放置一晚上，再进行检查。取1ml乳液，3000rpm离心30min，结果底部没有水相析出，说明乳化良好。
[0099]
8.7制备得到抗原含量为40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的疫苗样品v-24a-2dec95(40μg)、v-24a-2dec95(60μg)、v-24a-2dec95(80μg)。
[0100]
实施例9：重组疫苗稳定性分析
[0101]
9.1将疫苗置于玻璃瓶中，分别储存在4℃，20℃和37℃条件下，进行稳定性研究。
[0102]
9.2乳化液稳定性的判定标准为：(1)样品析出层高度不大于5％；(2)保持无菌状态；(3)破乳后，与原液相比，抗原含量不低于80％。
[0103]
9.3经检测疫苗样品在4℃条件下存放18个月，20℃条件下存放3个月，37℃条件下存放1个月，疫苗样品稳定。
[0104]
实施例10：不同抗原含量疫苗样品羔羊免疫实验
[0105]
(1)筛选32只阴性羔羊，羊只要求如表10。
[0106]
表10：动物筛选要求
[0107][0108]
(2)免疫操作过程如下表11。
[0109]
表11：免疫操作程序
[0110][0111]
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行elisa抗体检测。结果表明疫苗组二免后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，抗体持续期至少二免后48周，60μg抗原含量疫苗组明显优于其他两个疫苗组，具体如下表12、表13、表14和表15所示。
[0112]
表12：v-24a-2dec95(40μg)抗体效价检测结果
[0113][0114]
表13：v-24a-2dec95(60μg)抗体效价检测结果
[0115][0116]
表14：v-24a-2dec95(80μg)抗体效价检测结果
[0117][0118][0119]
表15：pbs抗体效价检测结果
[0120][0121]
实施例11：不同抗原重组疫苗的制备
[0122]
11.1取适量佐剂montanide isa 50v，121高压灭菌30min，备用。
[0123]
11.2取实施例4中纯化得到的蛋白样品p-24a-2dec95和p-24a-2aec95，根据测得的浓度，用无菌pbs分别稀释至120μg/ml。
[0124]
11.3按照油:水＝1:1(v:v)的比例，准备适量的佐剂，至于烧杯中，将剪切头浸至佐剂中。
[0125]
11.4预乳化。开始剪切，向正在剪切的佐剂中缓慢加入水相，确保混合均匀。
[0126]
11.5乳化。14000rpm剪切速度下，剪切10分钟，延搅拌头移动烧杯确保乳化均匀。
[0127]
11.6分析。乳液制备完毕，室温下放置一晚上，再进行检查。取1ml乳液，3000rpm离心30min，结果底部没有水相析出，说明乳化良好。
[0128]
11.7制备得到的疫苗样品分别为v-24a-2dec95和v-24a-2aec95。
[0129]
实施例12：不同抗原疫苗样品羔羊免疫实验
[0130]
(1)筛选24只阴性羔羊，羊只要求如下表16。
[0131]
表16：动物筛选要求
[0132][0133]
(2)免疫操作过程如下表17所示。
[0134]
表17：免疫操作程序
[0135][0136]
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行elisa抗体检测。结果表明：同样使用60ug抗原，疫苗组二免后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，抗体持续期至少二免后48周；v-24a-2dec95疫苗组二免后48周的抗体滴度全部不低于1：512，而v-24a-2aec95疫苗组二免后48周的抗体滴度全部不高于1：128，具体如下表18、表19和表20所示。
[0137]
表18：v-24a-2dec95抗体效价检测结果
[0138][0139][0140]
表19：v-24a-2aec95抗体效价检测结果
[0141][0142]
表20：pbs抗体效价检测结果
[0143][0144]
实施例13：抗血清的交叉保护效果评价
[0145]
据报道细粒棘球绦虫g1型和加拿大棘球蚴绦虫g6型不存在交叉保护效果，本发明设计了竞争elisa的实验，将抗原p-mal-2dec95做为包被抗原，抗v-24a-2dec95血清分别与以下抗原孵育p-24a-2deg95、p-24a-2dec95、p-p-mal-2dec95、pbs，抗v-24a-2dec95血清的稀释倍数100倍。
[0146]
竞争elisa检测结果如图2所示。结果表明eg95抗原不能够阻断抗ec95血清与ec95抗原的结合，说明由狭义细粒棘球绦虫eg95抗原蛋白组成的疫苗组合物不能够对加拿大棘球绦虫产生完全的保护效果。
[0147]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。