高综合性能光固化生物3D打印复合水凝胶及其制备方法和应用

高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
1.本技术涉及医用改性高分子水凝胶，具体涉及一种高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.脊髓，脊髓位于椎管内，连接大脑跟周围的神经，属于神经系统，负责神经的传导，脊髓一旦受损会导致出现肢体的瘫痪，也可能出现感觉的丧失，另外还会出现其他的神经功能损伤。脊髓损伤(spinal cord injury，sci)致残率高且恢复困难，是一种严重的临床疾病，尤其是原发损伤后一系列的继发反应使病情更为复杂。继发反应造成的损伤会从损伤发生的初始区域蔓延到其他地方，形成星形胶质细胞疤痕，阻碍轴突的再生，还会造成囊性腔的形成。因此，脊髓损伤一直是医学领域的难题。
4.随着科学技术的进步，生物3d打印技术为组织器官修复提供了全新的临床医学策略，在医学领域的应用实例如组织器官替代品构建、器官移植与再生、药物筛选模型及解剖学模型等。生物3d打印可实现复杂组织结构打印、载细胞打印、不同细胞数量和细胞密度的可控精确沉积、容易获得生物材料理化性能梯度，在组织器官修复中占有诸多优势。
5.能够包裹活细胞的水凝胶对生物3d打印尤为重要，水凝胶材料合适的理化性能是细胞黏附、迁移、增殖的前提。因此，水凝胶材料需具有良好的生物相容性，既能为细胞生长提供特定的微环境，又是细胞功能化行为诱导的基础；同时须具有良好的可打印性、与组织细胞再生速度相匹配的降解速率、适合细胞生长的溶胀率、良好的力学性能。目前，制备一种综合性能良好的水凝胶材料仍是生物3d打印的难点。


技术实现要素：

6.为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶，具有生物相容性高、成形性好、机械强度可调、快速凝胶化的优势，可用于脊髓支架的打印。本发明3d打印的脊髓支架上可接种神经细胞，或者进行载神经细胞打印，用于神经损伤的修复、神经药物的筛选等。本发明复合水凝胶材料还可用于周围神经组织支架的打印，或者多孔复杂组织结构的打印。
7.具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
8.在本发明的第一方面，本发明提供了一种高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶，其为以甲基丙烯酰化明胶(gelma)、甲基丙烯酰化透明质酸(hama)、甲基丙烯酰化丝素蛋白(silma)为单体共价交联固化形成的聚合物凝胶。
9.明胶，含有许多生物活性位点，特别是整合素结合序列rgd肽，既具有良好的生物可降解性又能调节细胞黏附。明胶为温敏性材料，通过物理交联机制形成水凝胶网络，但物理交联受外界环境影响较大，稳定性差。
10.透明质酸，由于其具有高分子量和大量吸收水分的能力，有助于维持组织的机械完整性、体内稳态、黏弹性和润滑性，是神经细胞质基质的重要组成成分。同时，它能与细胞表面特异性受体(如cd44)结合，起到调节细胞黏附、迁移、增殖和分化作用。基于透明质酸的生物材料不会引发过敏和炎症。但透明质酸生物3d打印成形性和机械强度相对较差。
11.丝素蛋白，是在蚕丝中抽取天然高分子纤维聚合物，含有18种氨基酸，丝素蛋白分子链上有细胞结合位点，与合成高分子材料相比具有良好的生物活性，利于神经组织细胞的黏附；另外，甲基丙烯酰化丝素蛋白，改性后可在水中快速溶解，且具有较快的凝胶化速度。因此，丝素蛋白已被用于生物医学领域。
12.在本发明的实施方式中，本发明选用上述材料，并在其基础上，在其结构基础上引入双键并将其组合使用，一方面增加了材料的光敏性，另一方面使用改性后的上述材料能够以单体形式在分子间形成共价键产生聚合网络，得到生物相容性、成型性、力学性能等综合性能均优良且交联速度较快的凝胶材料
13.本发明材料为甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸和甲基丙烯酰化丝素蛋白的组合，这几种材料是神经细胞质基质的重要组成成分，利于神经干细胞的黏附、增殖和分化，且材料经过改性后在紫外光下可快速凝固，成形性好，尤其是支架材料的压缩模量可通过调节甲基丙烯酰化丝素蛋白的含量来调节，且支架的弹性模量在天然神经组织的模量范围内。
14.在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶的方法，其包括：分别将甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸和甲基丙烯酰化丝素蛋白加入光引发剂标准溶液中避光溶解，得到复合溶液后加入阻光剂至搅拌完全溶解，在光下交联固化成胶，即得。
15.在本发明的实施方式中，所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)；所述述阻光剂为柠檬黄。
16.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：取甲基丙烯酰化明胶加入至光引发剂标准溶液中，55
‑
60℃的水浴避光加热至甲基丙烯酰化明胶完全溶解，然后加入甲基丙烯酰化透明质酸，55
‑
60℃的水浴避光加热至甲基丙烯酰化透明质酸完全溶解，然后加入甲基丙烯酰化丝素蛋白室温下溶解得到甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸和甲基丙烯酰化丝素蛋白的混合溶液，加入阻光剂后搅拌至完全溶解，在紫外光照射下交联固化成胶，即得。
17.在本发明的一些实施方式中，所述甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸和甲基丙烯酰化丝素蛋白的混合溶液中甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸和甲基丙烯酰化丝素蛋白的质量体积浓度比为8：2：1
‑
5。在进一步的实施方式中，该体积浓度比为8:2:3
‑
5。
18.在本发明的实施方式中，发明人还提供了制备甲基丙烯酰化明胶以及甲基丙烯酰化透明质酸的方法，其包括在明胶或透明质酸分子链上引入碳碳双键。
19.具体地，在本技术的一些实施方式中，所述制备甲基丙烯酰化明胶的方法包括：将
明胶浸泡后在水浴加热条件下(维持55℃)搅拌至完全溶解，加入甲基丙烯酸酐，混合反应，并调节ph在8左右，反应结束后透析、离心，冷冻(超低温冰箱中冷冻至少2小时)后不解冻直接进行冷冻干燥，冻干至完全脱水(约3
‑
4天)即得，冻干后的凝胶可防止棕色瓶中密封冷藏储存、备用。在本发明的实施方式中，所述透析采用透析袋进行，透析袋的截留分子量为12000。
20.在本发明的一些实施方式中，所述制备甲基丙烯酸酰化透明质酸的方法包括：将透明质酸浸泡后水浴加热(50℃)条件下搅拌至完全溶解，然后滴加二甲基甲酰胺，充分反应后加入甲基丙烯酸酐，同时调节水凝胶溶液ph保持在8
‑
9，充分反应过夜后加入反渗透水稀释溶液，将该水凝胶溶液，并加入氯化钠，氯化钠充分溶解后将水凝胶溶液转移至透析袋内透析，透析后的溶液进行冷冻(超低温冰箱中冷冻至少2小时)，冷冻后不解冻直接进行冷冻干燥，冻干至完全脱水(约3
‑
4天)即得，冻干后的凝胶可防止棕色瓶中密封冷藏储存、备用。在本发明的实施方式中，所述透析采用透析袋进行，透析袋的截留分子量为12000。
21.在本发明的实施方式中，在明胶或透明质酸分子链上引入碳碳双键，改性明胶或改性透明质酸具有光敏性，其可通过紫外光在引发剂的作用下交联固化成胶。
22.采用本发明的方法，在波长为405nm的紫外光照射下，引发剂吸收光能产生聚合反应活性中心，活性中心与gelma单体、hama单体、silma单体发生自由基反应，单体自由基与单体加成产生新的自由基，如此反复生成增长链自由基，增长链自由基失去活性生成聚合物分子，即gelma、hama、silma大分子间形成共价键产生聚合网络，从而使gelma、hama、silma分子形成具有良好生物相容性、成形精度高、强度高、交联速度快的水凝胶，可用于光固化生物3d打印。
23.在本发明的第三方面，本发明提供了一种神经组织支架或多孔支架，其以上述第一方面中所述的高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶为原料。在本发明的一些实施方式中，所述神经组织支架为脊髓支架、周围神经组织支架。
24.在本发明的一些实施方式中，所述神经组织支架或多孔支架以上述第一方面中所述的高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶为原料经3d打印制备得到。
25.在本发明的第四方面，本发明提供了一种采用3d打印技术制备神经组织支架或多孔支架的方法，其包括：以上述第一方面中所述的高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶为原料进行光固化3d打印或者以上述第一方面中所述的高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶载神经细胞进行光固化3d打印，其中，光固化3d打印的参数为：光固化3d打印机沉积平台温度27℃，料槽温度29℃，层高10μm，光强10mw/cm2，基层层数5，基层曝光时间5s，片层曝光时间10
‑
12s，z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度2mm/min，剥离回复速度200mm/min。
26.在本发明的第五方面，本发明提供了上述第一方面中所述的高综合性能光固化生物3d打印复合水凝胶或上述第三方面中所述的神经组织支架或多孔支架在制备用于修复神经损伤的材料或在神经药物筛选中的应用。
27.通过上述一个或多个技术手段，可实现以下有益效果：
28.(1)加入gelma、hama、silma材料均为光敏材料，可通过光固化打印精度高、成形性好、稳定性好的复杂组织结构，可通过调节光照强度、曝光时间来实现凝胶时间的控制。
29.(2)加入柠檬黄阻光剂有助于打印微小孔径。
30.(3)加入gelma提供细胞黏附位点，具有优异的细胞相容性和细胞反应性；加入hama使水凝胶吸水性提高，有助于维持组织的机械完整性、体内稳态、黏弹性和润滑性；加入silma后水凝胶机械强度提高，凝胶化时间缩短，生物相容性提高。复合水凝胶具有优良生物相容性、高机械强度、快速凝胶化、成形性好的高综合性能，为脊髓支架的制备提供了一种新型光固化材料。
附图说明
31.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。以下，结合附图来详细说明本技术的实施方案，其中：
32.图1为本发明实施例1
‑
4制备的水凝胶光固化3d打印的脊髓支架和多孔支架图片。
33.图2为本发明实施例1
‑
4制备的水凝胶扫描电镜下微观形貌图。
34.图3为本发明实施例1
‑
4制备的水凝胶流变性能图。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例，进一步阐述本技术。应理解，这些实施例仅用于说明本技术而不用于限制本技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
36.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本技术所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本技术所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
37.作为本发明的一些实施方式，一种高综合性能的光固化生物3d打印复合水凝胶材料，由以下原料组成gelma8％(w/v)、hama2％(w/v)、silma1％
‑
5％(w/v)、lap0.25％(w/v)、柠檬黄0.05％(w/v)。
38.实施例1
39.(1)制备甲基丙烯酸酰化明胶：将200g明胶浸泡在200ml去离子水中，并在磁力搅拌器中搅拌90min促进明胶溶解，搅拌同时将混合物水浴加热至55℃(并保持在此温度)直至明胶完全溶解，溶液变得清澈。明胶溶解后，搅拌的同时，逐滴加入12g甲基丙烯酸酐，混合充分反应4小时，反应过程中使用0.5m的氢氧化钠溶液调节水凝胶溶液的ph值为8左右。反应结束后将溶液转移到截留分子量为12000的透析袋内在大量去离子水中透析4
‑
5天，每天更换去离子水。透析结束后在离心机中以5710r/min的转速离心5min，将离心后的溶液等分后转移在超低温冰箱中冷冻2h，冷冻后不要解冻将试样转移到冷冻干燥机中，冻干直至完全脱水(约3
‑
4天)，最后将冷冻干燥后的凝胶放棕色瓶中密封冷藏储存以备使用。
40.(2)制备甲基丙烯酸酰化透明质酸：将2g透明质酸浸泡在150ml反渗透水中，水浴加热至50℃，并在磁力搅拌器中搅拌直至透明质酸完全溶解。随后，滴加二甲基甲酰胺100ml，充分反应60min，再逐滴加入甲基丙烯酸酐2.2ml，同时使用0.5m的naoh调节水凝胶溶液ph值保持在8
‑
9，充分反应过夜后加入1000ml反渗透水稀释水凝胶溶液，并加入29g氯
化钠，氯化钠充分溶解后将水凝胶溶液转移至截留分子量为12000的透析袋中透析4天，将透析后的溶液等分后放置超低温冰箱中冻干2h，冷冻后不要解冻将试样转移到冷冻干燥机中，冻干直至完全脱水(约3
‑
4天)，最后将冷冻干燥后的凝胶放棕色瓶中密封冷藏储存以备使用。
41.(3)制备甲基丙烯酰化明胶(gelma)、甲基丙烯酰化透明质酸(hama)复合溶液：量取20mlpbs溶液，加入光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂0.05g，以40
‑
50℃水浴加热溶解15min，期间搅拌震荡数次得到0.25％(w/v)引发剂标准溶液；取1.6g gelma放入引发剂标准溶液中，以55
‑
60℃的水浴避光加热至gelma完全溶解，期间搅拌震荡得8％(w/v)gelma溶液；取0.4g hama放入8％(w/v)gelma溶液，以55
‑
60℃的水浴避光加热至hama完全溶解，期间搅拌震荡得8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama混合溶液；取阻光剂柠檬黄0.005g放入8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama混合溶液，搅拌至完全溶解。(注：仅在光固化3d打印时复合水凝胶溶液添加柠檬黄(便于打印微小孔结构)，在水凝胶性能测试时复合水凝胶溶液并未添加柠檬黄。)
42.(4)复合水凝胶的光固化3d打印：光固化3d打印机沉积平台温度27℃，料槽温度29℃，层高10um，光强10mw/cm2，基层层数5，基层曝光时间5s，片层曝光时间10
‑
12s，z轴速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度2mm/min，剥离回复速度200mm/min。
43.实施例2
44.(1)制备甲基丙烯酸酰化明胶：同实施例1中步骤(1)。
45.(2)制备甲基丙烯酸酰化透明质酸：同实施例1中步骤(2)。
46.(3)制备甲基丙烯酰化明胶(gelma)、甲基丙烯酰化透明质酸(hama)、甲基丙烯酰化丝素蛋白(silma，购自efl)复合溶液：量取20mlpbs溶液，加入光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂0.05g，以40
‑
50℃水浴加热溶解15min，期间搅拌震荡数次得到0.25％(w/v)引发剂标准溶液；取1.6g gelma放入引发剂标准溶液中，以55
‑
60℃的水浴避光加热至gelma完全溶解，期间搅拌震荡得到8％(w/v)gelma溶液；取0.4g hama放入8％(w/v)gelma溶液，以55
‑
60℃的水浴避光加热至hama完全溶解，期间搅拌震荡得到8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama混合溶液；取silma0.2g放入8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama溶液中，室温下溶解(避免剧烈超声、高温及强力剪切)得到8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama、1％silma混合溶液。取柠檬黄0.005g放入8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama、1％silma混合溶液，搅拌至完全溶解。(注：仅在光固化3d打印时复合水凝胶溶液添加柠檬黄(便于打印微小孔结构)，在水凝胶性能测试时复合水凝胶溶液并未添加柠檬黄。)
47.(4)复合水凝胶的光固化3d打印：光固化3d打印机沉积平台温度27℃，料槽温度29℃，层高10um，光强10mw/cm2，基层层数5，基层曝光时间5s，片层曝光时间7
‑
12s，z速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度2mm/min，剥离回复速度200mm/min。
48.实施例3
49.(1)制备甲基丙烯酸酰化明胶：同实施例1中步骤(1)。
50.(2)制备甲基丙烯酸酰化透明质酸：同实施例1中步骤(2)。
51.(3)制备甲基丙烯酰化明胶(gelma)、甲基丙烯酰化透明质酸(hama)、甲基丙烯酰化丝素蛋白(silma，购自efl)复合溶液：量取20mlpbs溶液，加入光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂0.05g，以40
‑
50℃水浴加热溶解15min，期间搅拌震荡数次得到0.25％
(w/v)引发剂标准溶液；取1.6g gelma放入引发剂标准溶液中，以55
‑
60℃的水浴避光加热至gelma完全溶解，期间搅拌震荡得到8％(w/v)gelma溶液；取0.4g hama放入8％(w/v)gelma溶液，以55
‑
60℃的水浴避光加热至hama完全溶解，期间搅拌震荡得到8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama混合溶液；取silma0.6g放入8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama溶液中，室温下溶解(避免剧烈超声、高温及强力剪切)得到8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama、3％silma混合溶液。取柠檬黄0.005g放入8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama、3％silma混合溶液，搅拌至完全溶解。(注：仅在光固化3d打印时复合水凝胶溶液添加柠檬黄(便于打印微小孔结构)，在水凝胶性能测试时复合水凝胶溶液并未添加柠檬黄。)
52.(4)复合水凝胶的光固化3d打印：光固化3d打印机沉积平台温度27℃，料槽温度29℃，层高10um，光强10mw/cm2，基层层数5，基层曝光时间5s，片层曝光时间7
‑
12s，z速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度2mm/min，剥离回复速度200mm/min。
53.实施例4
54.(1)制备甲基丙烯酸酰化明胶：同实施例1中步骤(1)。
55.(2)制备甲基丙烯酸酰化透明质酸：同实施例1中步骤(2)。
56.(3)制备甲基丙烯酰化明胶(gelma)、甲基丙烯酰化透明质酸(hama)、甲基丙烯酰化丝素蛋白(silma，购自efl)复合溶液：量取20mlpbs溶液，加入光引发剂苯基
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2,4,6
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三甲基苯甲酰基亚磷酸锂0.05g，以40
‑
50℃水浴加热溶解15min，期间搅拌震荡数次得到0.25％(w/v)引发剂标准溶液；取1.6g gelma放入引发剂标准溶液中，以55
‑
60℃的水浴避光加热至gelma完全溶解，期间搅拌震荡得到8％(w/v)gelma溶液；取0.4g hama放入8％(w/v)gelma溶液，以55
‑
60℃的水浴避光加热至hama完全溶解，期间搅拌震荡得到8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama混合溶液；取silma1g放入8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama溶液中，室温下溶解(避免剧烈超声、高温及强力剪切)得到8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama、3％silma混合溶液。取柠檬黄0.005g放入8％(w/v)gelma、2％(w/v)hama、5％silma混合溶液，搅拌至完全溶解。(注：仅在光固化3d打印时复合水凝胶溶液添加柠檬黄(便于打印微小孔结构)，在水凝胶性能测试时复合水凝胶溶液并未添加柠檬黄。)
57.(4)复合水凝胶的光固化3d打印：光固化3d打印机沉积平台温度27℃，料槽温度29℃，层高10um，光强10mw/cm2，基层层数5，基层曝光时间5s，片层曝光时间7
‑
12s，z速度25mm/min，剥离距离6mm，剥离速度2mm/min，剥离回复速度200mm/min。
58.下面，通过以下几项测试说明实施例中的水凝胶材料在组织工程支架或载细胞打印组织应用中的优势。
59.1、成形性测试：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4水凝胶材料3d打印脊髓支架和多孔支架如图1的(a)、(b)、(c)、(d)中所示，实施例1片层曝光时间为10
‑
12s，多孔支架打印效果稍差，多孔支架在打印机沉积台取下易粘连。实施例2、实施例3、实施例4打印脊髓支架和多孔支架成形性与实施例1相比较好，且孔不易塌陷，在实施例2、实施例3、实施例4中，随着silma含量的增加，凝胶化时间明显降低，在片层曝光时间在7
‑
12s均可打印成形，这对载细胞打印是至关重要的。
60.2、水凝胶微观形貌：将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4水凝胶材料分别经固化、冷冻干燥、喷金后在扫描电镜下观察水凝胶微观形貌如图2的(a)、(b)、(c)、(d)中所示。图2表明，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4水凝胶微观形貌为多孔网络，且加入silma
后，水凝胶网络孔径均匀，随着silma含量的增加水凝胶网络孔更加致密，这使得在培养细胞的过程中，其它营养物质容易进出水凝胶，有利于细胞的新陈代谢。
61.3、流变性测试：使用anton paar mcr 302流变仪实现流变测试和紫外光固反应的实时同步，紫外光源的辐射强度和辐射波长范围可通过辐射计和滤波器调节，实施例1
‑
4的实验光源辐射强度为60％。为了评估实施例1
‑
4水凝胶的凝胶化时间，在25℃下，使用50mm平行板系统进行测试，间隙距离固定在50um，将0.5ml均匀的溶液加载到固定装置上，在1hz的频率下进行时间扫描，应变为1％，在50s时打开紫外灯，持续照射300s。由图3流变性数据可知，实施例1在2
‑
3s开始固化，实施例2、实施例3、实施例4均在2s内迅速开始固化，实施例1
‑
4均在35s内固化程度可达到65％，50s内完全固化，快速凝胶化为载细胞光固化3d打印节约时间从而提高细胞活力。实施例1
‑
4中，随着silma含量增大，水凝胶的储能模量增大，使打印成形性得到了极大改善。
62.4、力学性能测试：对实施例1
‑
4几种水凝胶的压缩模量进行测试，预紧力为1n，压缩速度为1mm/min，得到参数如表1。
63.表1水凝胶材料压缩模量测试结果
[0064][0065]
如表1可知，本发明水凝胶组分中加入silma后，水凝胶的压缩模量增大，且压缩模量随着silma含量增大而增大，当silma含量增大到5％时，水凝胶压缩模量可达到8623.7pa，相比于实施例1，水凝胶压缩模量提高了1倍，可通过改变丝甲基丙烯酰化丝素蛋白含量来调节水凝胶的模量，从而获得具有一定力学性能脊髓支架。
[0066]
5、cck
‑
8测细胞增殖：分别将实施例1
‑
4固化后圆柱体水凝胶块体，按着1.25cm2/ml(浸提介质表面积与培养基体积比)的浸提介质比例浸泡在培养基中，浸泡24小时得到浸提液，并用过滤器除菌后以备使用。取小鼠成纤维细胞l929，调整细胞悬液浓度为3*107个/ml,将配制好的细胞悬液接种于96孔板中，100ul/孔，置37℃，5％co 2培养箱内培养24h，使细胞贴壁完全，吸弃培养液，实验组加入100ul浸提液，对照组加入100ul新鲜培养基。分别在1天、3天、5天、7天时间点，吸弃培养液，实验组加入100ul浸提液，对照组加入100ul新鲜培养基，并加入10ul cck
‑
8液，培养1小时后，在酶标仪中震荡10s，在450nm波长下的吸光值(od)，每组平行测5个孔，取平均值。
[0067]
表2不同材料吸光值测试结果
[0068][0069][0070]
细胞相对增值率％＝实验组吸光值/对照组吸光值*100％
[0071]
表3细胞相对增殖率
[0072][0073]
由表2所示，实施例1
‑
4，在450nm波长下的吸光值(od)随着培养天数的增加而增加。由表3所示，实施例1
‑
4细胞活力均高于80％，根据gb/t 16886.5
‑
2017/iso 10993
‑
5：2009，本发明实施例材料不具有潜在的细胞毒性。实施例2、实施例3、实施例4相对于实施例1细胞活力明显提高，即在实施例1中加入甲基丙烯酰化丝素蛋白后细胞活力明显提高，实施例2细胞活力最高，其中甲基丙烯酰化丝素蛋白含量为1％(w/v)，与对照组相比促进了细胞增殖。这些结果表明这些复合水凝胶具有良好的细胞相容性、脊髓支架和多孔支架的无毒性。
[0074]
本发明打印的是脊髓支架，可在支架上接种神经细胞，或者进行载神经细胞打印，用于神经损伤的修复、神经药物的筛选等。本发明材料还可用于周围神经组织支架的打印，或者多孔复杂组织结构的打印。
[0075]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，尽管参照前述实施例对本技术进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本技术的精
神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。