一种抗衰老组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品领域，具体涉及一种抗衰老组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着社会的发展，人们越来越注重个人皮肤状态。衰老是一种自然发生的生命过程，环境污染、生活方式、作息规律都会影响衰老进程，化妆品的抗衰老功效是永恒追求的话题。
3.皮肤是人体免疫的第一道屏障，在人体表面生存着大量的微生物，包括细菌、真菌、病毒等，这些微生物在维持皮肤生态平衡、自净作用以及参与皮肤生理机能实施等方面都具有重要作用。皮肤菌群失调会导致功能性免疫缺陷，触发身体自身非特异性但及时的积极防御机制。
4.乳酸杆菌作为人体必不可缺少的一类菌群，广泛应用于食品行业，在化妆品中的应用也受到人们的关注。益生菌乳酸杆菌中的乳酸、蛋白质、酶等成分可以有效促进皮肤健康，但是皮肤作为人体屏障，益生菌活菌透过皮肤屏障信息传达的效果甚微；直接涂抹乳酸菌或者代谢体，容易诱发皮肤的拮抗作用；乳酸直接作用于皮肤也容易引发皮肤刺激问题。
5.洋蔷薇为蔷薇科蔷薇属小灌木，又称普罗旺斯玫瑰、千叶玫瑰、格拉斯玫瑰、百叶蔷薇等。洋蔷薇花提取物含有丰富的糖、蛋白质、小分子rna和玫瑰鞣酸，可以促进肌肤修复，平衡皮肤微生态。本发明采用的洋蔷薇花提取物来自本应废弃的洋蔷薇花花渣，实现了资源的合理利用，符合天然可持续的发展理念。
6.北美乔松是常绿乔木，在原产地树高30
‑
50米，可做建筑、器具用材，树皮则作废弃物被掩埋或者作为燃料和堆肥，资源并未得到最大化的利用。来源于林业副产物北美乔松树皮从中提取的提取物具有抗氧化、减少蛋白羰基化的作用，提取后的树皮可以用来作为能源燃料或者回归土地，最大程度上实现了资源利用。
7.目前市售产品多集中在自由基和糖化对于皮肤状态的影响，还没有涉及慢性炎症对于衰老的影响。环境的变化和生活方式的改变，让大多数人们的皮肤变得敏感，越来越多的慢性炎症状态出现，加速了炎症导致的衰老。因此亟需一款抗炎、抗糖化、抗氧化的抗衰老组合物。


技术实现要素：

8.为了解决现有的抗衰老组合物只从抗氧化、抗糖化的角度延缓皮肤衰老的问题，忽略慢性炎症对于衰老的影响，本发明提出一种抗衰老组合物，从减少慢性炎症、抵抗自由基、减少蛋白羰基化三个方面减缓衰老进程。本发明的组合物在一定比例范围内发挥协同增效的作用，增强皮肤的透皮吸收，从而提高活性物的生物利用度，从1)有益于皮肤的共生菌群抑制致病菌群，减少炎症因子从而减少炎症反应对于衰老的影响；2)减少氧自由基损伤，减少蛋白羰基化反应；3)提供一些小分子营养物质和矿物质，给细胞补充营养物质，加快细胞代谢三个方面来减缓皮肤衰老，降低敏感肌肤敏感度，让皮肤健康透亮。
9.本技术通过以下技术方案得以实现：
10.本发明一方面提供了一种抗衰老组合物，由以下质量比的组分组成：
11.乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物＝(1
‑
10)：(0.1
‑
2)：(0.1
‑
3)。
12.作为优选，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物的质量比为(1
‑
8)：(0.1
‑
1)：(0.1
‑
2)；
13.作为优选，将所述洋蔷薇花提取物和北美乔松树皮提取物混合后，加入乳酸杆菌发酵溶胞产物混合均匀，依次用0.1
‑
10μm孔径的微滤膜、0.01
‑
0.05μm孔径的超滤膜过滤得到所述组合物；
14.其中，
15.将洋蔷薇花渣清洗干净，加入2
‑
3倍质量的去离子水打碎匀浆，用高压均质机150
‑
200mpa，均质5
‑
7次，离心取上清液，减压浓缩至五分之一到二分之一，干燥成粉末加入1
‑
3质量倍溶剂溶解均匀即得洋蔷薇花提取物；所述溶剂为去离子水、丁二醇、甘油、丙二醇中的一种或几种；
16.将北美乔松树皮清洗干净，加入5
‑
8倍质量的去离子水，进行湿法超微粉碎，离心，取上清液进行减压浓缩至五分之一到二分之一，干燥成粉末，即得北美乔松树皮提取物；
17.将乳酸杆菌接种在无菌培养基中，厌氧发酵培养，移除培养基并水洗，再与透明质酸钠混合并后发酵；然后巴氏灭菌30min，4℃离心收集乳酸杆菌菌体，加入5
‑
8倍重量去离子水；将乳酸杆菌菌体重悬、破壁处理，最后高压均质后过滤得到乳酸杆菌发酵溶胞产物；
18.所述乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物＝(2
‑
4)：(0.3
‑
0.5)：(0.4
‑
0.6)。
19.作为优选，所述洋蔷薇花提取物以及北美乔松树皮提取物的制备中，所述干燥的方法为烘箱烘干或者冷冻干燥。
20.作为优选，所述北美乔松树皮提取物的制备中所述湿法超微粉碎采用胶体磨或均质机进行。
21.作为优选，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物的制备中所采用的乳酸杆菌为：genbank登记号mz208824的乳酸杆菌、戊糖乳酸杆菌中的一种或其混合。
22.作为优选，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物的制备中所用的乳酸杆菌接入量为匀浆质量的10％
‑
25％，含菌量为6.0*109cfu/ml,厌氧发酵时间为12
‑
36h，透明质酸钠的用量为菌液重量的4
‑
6％，后发酵的时间为12
‑
48h。
23.作为优选，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物的质量比为3：0.3:0.5。
24.本发明另一方面还提供了一种抗衰老组合物的制备方法，包括以下步骤：
25.1)将洋蔷薇花渣清洗干净，加入2
‑
3倍质量份的去离子水打碎匀浆，用高压均质机150
‑
200mpa，均质5
‑
7次，离心取上清液，减压浓缩至五分之一到二分之一，干燥成粉末加入1
‑
3质量倍溶剂溶解均匀即得洋蔷薇花提取物；所述溶剂为去离子水、丁二醇、甘油、丙二醇中的一种或几种；
26.2)将北美乔松树皮清洗干净，加入5
‑
8倍质量份去离子水，进行湿法超微粉碎，离心，取上清液进行减压浓缩至五分之一到二分之一，干燥成粉末，即得北美乔松树皮提取
物；
27.3)选用乳酸杆菌接种在无菌培养基中，厌氧发酵培养，移除培养基并水洗，再与透明质酸钠混合并后发酵；然后巴氏灭菌30min，4℃离心收集乳酸杆菌菌体，加入5
‑
8倍重量去离子水，将乳酸杆菌菌体重悬、破壁处理，高压均质后过滤得到乳酸杆菌发酵溶胞产物；
28.4)将洋蔷薇花提取物和北美乔松树皮提取物混合均匀，加入乳酸杆菌发酵溶胞产物混合均匀，依次用0.1
‑
10μm孔径的微滤膜、0.01
‑
0.05μm孔径的超滤膜过滤得到组合物；
29.所述步骤1)、步骤2)所述干燥方法为烘箱烘干或者冷冻干燥；
30.所述步骤2)所述湿法超微粉碎采用胶体磨或均质机进行；
31.所述步骤3)所述乳酸杆菌乳酸杆菌为：genbank登记号mz208824的乳酸杆菌、戊糖乳酸杆菌中的一种或其混合；
32.所述乳酸杆菌发酵溶胞产物的制备中所用的乳酸杆菌接入量为匀浆质量的10％
‑
25％，含菌量为6.0*109cfu/ml,厌氧发酵时间为12
‑
36h，透明质酸钠的用量为菌液重量的4
‑
6％，后发酵的时间为12
‑
48h。
33.所述乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物的质量比为3：0.3:0.5。
34.本发明另一方面还提供了一种化妆品，含有如权利要求1
‑
8任一所述的组合物；所述化妆品选自水、水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜中的一种。
35.与现有技术相比，本技术可以获得包括以下技术效果：
36.(1)本发明的组合物选择从三条影响衰老的途径：减少慢性炎症、抵抗自由基、减少蛋白糖基化三个方面减缓衰老进程；
37.(2)本发明的组合物在一定比例范围内发挥协同增效的作用，比组合物中单一组分更好的发挥抗衰老功效，增强皮肤的透皮吸收，从而提高活性物的生物利用度；
38.(3)从温和安全角度，本发明优选来自人类婴儿皮肤的乳酸杆菌，同源性的乳酸杆菌来源可以减少刺激产生的风险，来源于天然植物的洋蔷薇花提取物、北美乔松树皮提取物效果更温和；
39.(4)从渗透吸收角度，本发明组合物中的活性成分多为小分子，比如：乳酸杆菌发酵溶胞产物中的分子量小于2000道尔顿，可以深入肌肤，更好的发挥作用；
40.(5)从环境保护的角度，本发明采用发酵的乳酸杆菌溶胞产物，洋蔷薇花提取物、北美乔松树皮提取物使用的原料均为本应废弃的副产物，从副产物中提取活性物质将副产物再利用，符合绿色环保可持续发展的理念。
附图说明
41.图1是实验例2中不同组合物对炎症因子表达含量影响的比较图；
42.图2是实验例4中实施例9组合物对于羰基化蛋白含量影响的比较图；
43.图3是实验例6中含有实施例9组合物的精华液对于经皮水分散失的影响；
44.图4是实验例7中含有实施例9组合物的精华液对皮肤粗糙度的影响；
45.图5是实验例7中含有实施例9组合物的精华液对皮肤弹性的影响；
46.图6是实验例7中含有实施例9组合物的精华液对皮肤紧致度的影响。
具体实施方式
47.以下将通过实施例来详细说明本技术的实施方式，借此对本技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
48.本技术中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本技术中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
49.本技术还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本技术权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。
[0050]“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本技术的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由
……
组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本技术的范围内。
[0051]
实施例1
[0052]
下述的实施例及对比例中，一种抗衰老组合物所采用的具体制备工艺如下：
[0053]
1)洋蔷薇花渣清洗干净，加入3倍质量份的去离子水打碎匀浆，用高压均质机200mpa，均质7次，离心取上清液，减压浓缩至五分之一到二分之一，干燥成粉末加入1.5质量倍溶剂溶解均匀即得洋蔷薇花提取物；所述溶剂为去离子水、丁二醇质量比为1:1；
[0054]
2)将北美乔松树皮清洗干净，加入6倍质量份去离子水，用均质机进行湿法超微粉碎，离心，取上清液进行减压浓缩至三分之一，烘箱烘干成粉末，即得北美乔松树皮提取物；
[0055]
3)选用乳酸杆菌接种在无菌培养基中，厌氧发酵培养，移除培养基并水洗，再与透明质酸钠混合并后发酵；然后巴氏灭菌30min，4℃离心收集乳酸杆菌菌体，加入6倍量去离子水，将乳酸杆菌菌体重悬、破壁处理释放出营养物质，高压均质后过滤得到乳酸杆菌发酵溶胞产物。
[0056]
4)将洋蔷薇花提取物和北美乔松树皮提取物混合均匀，加入乳酸杆菌发酵溶胞产物混合均匀，依次用微滤膜10μm、超滤膜0.45μm、0.2微米过滤得到组合物。
[0057]
所述步骤3)所述乳酸杆菌乳酸杆菌为：genbank登记号mz208824的乳酸杆菌；
[0058]
所述乳酸杆菌发酵溶胞产物的制备中所用的乳酸杆菌接入量为匀浆质量的10％，含菌量为6.0*109cfu/ml,厌氧发酵时间为24h，透明质酸钠的用量为菌液重量的5％，后发酵的时间为12h。
[0059]
表1所示为实施例1
‑
12及对比例1
‑
4中各组合物的组成质量比例(乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物)。根据表1并采用上述方法制备各实施例及对比例的组合物，并对所得组合物进行功效测试。
[0060]
表1.
[0061][0062][0063]
实施例2：抗衰老精华液的制备
[0064]
本发明还制备了包含上述实施例9制备的抗衰老精华液，组成及份数如表4所示。
[0065]
制备方法如下：
[0066]
(1)将水、螯合剂、保湿剂、ph调节剂、抗氧化剂混合，加热至70
‑
80℃溶解得到a相，保温备用；
[0067]
(2)将溶剂、增溶剂、抗菌剂混合均匀，加热至40
‑
45℃得到c相，保温备用；
[0068]
(3)将作为增稠剂的b相投入a相，均质3分钟，控制温度为70
‑
80℃，确认分散状态；
[0069]
(4)向步骤(3)所得物料中冷却至40
‑
45℃，加入c相，均质3分钟；
[0070]
(5)向步骤(4)所得物料中加入d相，均质3
‑
5分钟，得到舒缓修复精华液样品1。
[0071]
对照样品为空白对照，即在步骤(4)后不加入d相，补足余量水，搅拌均匀得到对照样品。
[0072]
表4
[0073][0074][0075]
实验例1：细胞毒性试验
[0076]
mtt assay是通过对活细胞数进行测定，在检测细胞毒性或细胞增殖时广泛使用的实验方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使水溶性的黄色盐mtt(3
‑
(4，5
‑
二甲基噻唑
‑
2)
‑
2，5
‑
二苯基四氮唑溴盐)还原为水不溶性的蓝色的甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。生成的结晶甲臜一般加入dmso(二甲亚砜)，溶解后测定吸光度。具体的实验方法是在96多孔板中按照1x104个/孔的密度接种含有10％牛血清的dmem培养基和角质形成细胞(hacat)各100μl，培养24小时后换成无血清培养基。在无血清培养基中
分别加入不同浓度的实施例及对比例(用去离子水进行稀释)24小时。之后去除培养基，用20μl的mtt溶液进行处理，在37℃下使其反应2小时。在去除mtt溶液的细胞中加入200μl异丙醇，轻轻地震荡30min，完全溶解结晶甲臜，在570nm处测定吸光度，根据如下公式计算细胞存活率。
[0077][0078]
表2为实施例1
‑
12和对比例1
‑
4的细胞毒性结果。
[0079]
表2
[0080]
[0081][0082]
实验例2：调节皮肤菌群平衡，减少炎症因子的产生
[0083]
将金黄色葡萄球菌：表皮葡萄球菌按3:1的比例接种到重组人类表皮上，应用空白组、实施例1
‑
12和对比例1
‑
4(1％wt，用去离子水进行稀释)后，用qpcr检测白介素1α(il
‑
1α)表达含量，空白组的il
‑
1α表达含量为100％，il
‑
1α是一种炎症细胞因子，当皮肤微生物菌群失调，金黄色葡萄球菌过度繁衍的时候产生，测试结果见图1。
[0084]
实验结果表明：
[0085]
(1)实施例和对比例均有调节皮肤菌群，减少炎症因子il
‑
1α的作用，实施例1
‑
12所得组合物对炎症因子的抑制作用均高于对比例1
‑
4，说明组合物之间三种组分之间存在协同增效的效果，不是单一的组分也不是组合物中两个组分之间存在协同增效作用；
[0086]
(2)对比实施例1
‑
4，il
‑
1α表达的相对含量先降低后趋于平缓，说明洋蔷薇花提取物的质量比例大于0.3，对炎症因子的抑制效果不明显增强，对比实施例2、5
‑
7，北美乔松树皮提取物的比例增加，il
‑
1α表达的相对含量先降低后趋于平缓，北美乔松树皮提取物的质量比例大于0.4，效果增强不明显；对比实施例5、8
‑
11、12，乳酸杆菌发酵溶胞产物的质量比例在大于4时，抑制效果增强不明显。因此，综合抑制il
‑
1α的效果、稳定性、价格和外观等因素的考虑，组合物优选为乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物＝(2
‑
4)：(0.3
‑
0.5)：(0.4
‑
0.6)，本实验的最优比为乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物＝3:0.3:0.5。
[0087]
实验例3：抗氧化能力测试
[0088]
dpph又称1,1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的无水乙醇溶液呈紫色，加入自由基清除剂时，自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，可评价清除自由基的能力。
[0089]
取所得组合物用去离子水稀释到0.2％wt，用移液器取40μl，再加入160μl的dpph乙醇溶液(200μg/ml)。混匀后于室温避光条件下反应30min，再于517nm处测吸光度a，每组设置3组平行实验计算平均值，计算方法如下：
[0090]
清除率％＝[1
‑
(a1‑
a2)/a0]
×
100
[0091]
式中：a0为未加入各组合物的dpph溶液的吸光度；
[0092]
a1为加入各组合物后的dpph溶液反应后的吸光度；
[0093]
a2为dpph溶液与各组合物混合后反应前的吸光度。实验结果见表3。
[0094]
表3
[0095][0096][0097]
实验结果表明：
[0098]
(1)对比实施例1
‑
12和对比例1
‑
4，组合物的抗氧化能力要比单一组分或其中两个组分的组合要强，说明组合物组分之间存在协同增效作用；
[0099]
(2)对比实施例1
‑
4，洋蔷薇花提取物抗氧化能力在质量比例为0.1
‑
0.3时，抗氧化
能力增强比较明显，对比实施例2、5
‑
7，抗氧化能力在北美乔松树皮提取物的质量比例为0.1
‑
0.4时增长比较明显，
[0100]
(3)实施例5、8
‑
11、12，抗氧化能力在乳酸杆菌发酵溶胞产物的质量比例大于4时增长不明显，结合抗氧化能力和稳定性，组合物优选为乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物＝(2
‑
4)：(0.3
‑
0.5)：(0.4
‑
0.6)，本实验的优选比例为实施例9，乳酸杆菌发酵溶胞产物：洋蔷薇花提取物：北美乔松树皮提取物＝3:0.3:0.5
[0101]
实验例4：减少蛋白质羰基化测试
[0102]
蛋白质羰基化是蛋白质的非酶促的不可逆羰基修饰，减少蛋白质羰基化，有助于保持肌肤透明度，营造水晶肌，增强皮肤弹性。培养人角质形成细胞，用4
‑
羟基壬烯醛(hne)诱导蛋白羰基化，不添加或添加用去离子水稀释的0.1％(wt)或0.2％(wt)的实施例9，hne用作羰基化诱导剂(阳性对照)，用免疫印迹法测定羰基化蛋白的含量，不添加的作为空白对照表达量为100％，结果如图2。
[0103]
结果表明，实施例9具有明显的减少因hne诱导的蛋白质羰基化的量，也就是说组合物具有明显的减少蛋白羰基化效果。
[0104]
实验例5：安全性斑贴测试
[0105]
取实施例2制备的精华液样品1于斑试器中，对照孔为空白对照；将加有受试物的斑试器贴到受试人员前臂屈侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24小时；分别于去除受试物斑试器后30min、24小时、48小时后按表5观察皮肤刺激性和致敏性，并记录观察结果。
[0106]
表5.皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
[0107][0108][0109]
实验结果：对样品进行人体皮肤斑贴测试，结果见表6。人体皮肤斑贴试验结果显示，30人中无皮肤不良反应。
[0110]
表6.化妆品人体皮肤斑贴试验结果
[0111][0112]
实验例6：皮肤屏障测试
[0113]
选取35名面部容易敏感皮肤屏障受损的志愿者，左右脸分别使用实施例2制备的样品1，空白样品，每天早晚各使用一次，其中在涂用过程中会保证患处的精华液涂抹厚度保持一致(不排除存在统计学允许范围内的偏差)，分别在产品使用前、使用4周后用经表皮失水率测试探头tewameter(ck,germany)测量面部经表皮失水率,同一个点测定3次，取平均值。
[0114]
经皮水分散失(trans epidermal water loss,tewl)反应角质层的屏障功能，可用来评价化妆品对皮肤屏障的修复能力。在测试条件下，得到的tewl值越高，代表单位时间、单位横截面积的经表皮水分流失量越多，皮肤屏障功能较差，反之皮肤屏障功能较好，即tewl值降低越多，产品对皮肤屏障的修复能力越强。
[0115]
tewl值变化率＝(产品使用后tewl值/使用前tewl值)
×
100％。
[0116]
实验结果见图3。
[0117]
实验结果表明，样品1可有效修复皮肤屏障，组合物具有明显修复皮肤屏障的功效。
[0118]
实施例7：皮肤紧致度、弹性、粗糙度测试
[0119]
选取35名志愿者，使用实施例2制备的样品1，每天早晚各使用一次，其中在涂用过程中会保证患处的精华液涂抹厚度保持一致(不排除存在统计学允许范围内的偏差)，分别在产品使用前、使用4周后用cutometer(ck,germany),antera 3d(miravex；ireland)测量使用前后面部f4，面部r2值,皮肤粗糙度的变化，结果见图4(f4越小，表示皮肤紧致度越好)，图5(注：r2:无负压时皮肤的回弹量与有负压时最大拉伸之比，比值越接近1，说明皮肤弹性越好)，图6为志愿者使用前后的对比图。
[0120]
由图4可知，使用四周后，眼角紧致度降低了34.85％(f4越小，表示皮肤紧致度越好)，证明皮肤紧致度明显改善；由图5可知，使用产品四周，皮肤回弹比增长16.85％，说明产品具有明显的改善皮肤弹性的效果；由图6可知，使用产品四周后，皮肤粗糙度明显改善，证明组合物具有明显的改善皮肤粗糙度的功效。
[0121]
本技术说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。
[0122]
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差
范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。
[0123]
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
[0124]
上述说明示出并描述了本技术的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本技术并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本技术的精神和范围，则都应在本技术所附权利要求的保护范围内。