一种用于骨瘤术后组织修复的新型微凝胶骨粉的制备方法

1.本发明涉及一种用于骨瘤术后组织修复的新型微凝胶骨粉的制备方法，属于医用修复材料领域。


背景技术：

2.骨肿瘤是发生在人体骨骼或者它的附属组织的肿瘤，它有良性和恶性的区别，恶性的骨肿瘤就是日常常说的骨癌。良性骨肿瘤易根治，预后良好，恶性骨肿瘤发展迅速，预后不佳，死亡率高。而良性骨肿瘤常常会发生恶变成为骨癌。骨肿瘤的治疗多以局部刮除植骨或切除为主。肿瘤性骨缺损在手术干预后，有可能会存在残余的肿瘤细胞而致使治疗失败。故对于手术去除骨肿瘤后造成的骨组织缺陷而植入骨修复填充材料，不仅要具有良好的生物学相容性、骨诱导活性，可控的降解性能等以促新骨生成，还应具有有效的抑制和杀死肿瘤细胞的能力。因此制备出可用于骨瘤术后组织缺损修复的性能优异的植入材料至关重要。


技术实现要素：

3.本发明针对骨肿瘤术后的骨组织缺损修复，提出了一种具有良好生物相容性、兼具促骨细胞生长和抑制癌细胞生长且能完全契合骨组织缺损形状的新型微凝胶骨粉的制备方法。
4.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种可用于骨瘤术后组织修复的新型微凝胶骨粉的制备方法，包括以下步骤：（1）介孔生物活性玻璃纳米微球的制备将硝酸钙、硝酸铈和亚硒酸钠加至十六烷基三甲基溴化铵、无水乙醇和氨水的混合液中，充分溶解后，再向其中加入磷酸三乙酯和硅酸四乙酯，待充分反应后，离心收集沉淀并洗涤干燥，进一步将沉淀进行煅烧获得含硒、铈元素的介孔生物活性玻璃纳米微球；（2）新型微凝胶骨粉的制备将步骤（1）制备的介孔生物活性玻璃纳米微球制备成分散液，并与海藻酸钠溶液和类人胶原蛋白溶液共混均匀得到混合液，用静电纺丝技术将混合液滴入氯化钙溶液中形成凝胶微球，离心收集凝胶微球后洗涤、冷冻干燥和co
‑
60灭菌处理，得到新型微凝胶骨粉。
5.上述步骤（1）中，硝酸钙、硝酸铈和亚硒酸钠的物质的量之比为10 :（0.1~2）:（0.1~2）。
6.上述步骤（1）中，磷酸三乙酯与硅酸四乙酯的体积比为1:（5~20），硅酸四乙酯与硝酸钙的体积质量比ml/g为1:（0.2~2）。
7.上述步骤（1）中，硝酸钙（单位：g）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（单位：ml）、氨水（单位：ml）、乙醇（单位：ml）的用量比g/ ml/ ml为（5~8）:（200~300）:（2~5）:（120~180），十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.01~0.03 g/ml，氨水的浓度为22~28%。
8.上述步骤（1）中，煅烧温度为500~850 ℃，煅烧时间为1~7 h。
9.上述步骤（1）中，所述的介孔生物活性玻璃纳米微球的介孔孔径为2~5nm，粒径280~350nm。
10.上述步骤（2）中，海藻酸钠溶液、类人胶原蛋白溶液、含介孔生物活性玻璃纳米微球的分散液的体积比为（0.5
‑
3）:（0.5
‑
3）:1，海藻酸钠溶液的浓度为0.01~0.08g/ml，类人胶原蛋白的溶液0.01~0.2g/ml，介孔生物活性玻璃纳米微球分散液中固液比g/ml为（0.5~4）:1000。
11.上述步骤（2）中，所述的微凝胶骨粉的粒径为500~700μm。
12.本发明专利针对上述问题，以具有良好生物相容性的海藻酸钙和类人胶原蛋白为有机主相，以富含硒、铈元素的介孔生物活性玻璃为无机填充相，制备了一种兼具促骨细胞生长和抑制癌细胞生长的，完全契合骨组织缺损形状的新型微凝胶骨粉，可有效实现骨瘤术后组织缺损修复。
13.本发明首次在生物活性玻璃中同时引入铈、硒元素，并将生物活性玻璃与海藻酸钙和类人胶原蛋白复合构成粒径约为500~700μm的微凝胶骨粉。铈元素能够提高生物学相容性、骨诱导活性，以促新骨生成。硒元素是生物组织中必需的微量元素，对人类和动物的健康起着重要作用，并且它还具有杀死肿瘤细胞的能力。类人胶原蛋白具有良好的生物相容性、促细胞生长、骨诱导活性和新骨生成的性能。故，本发明所制备的新型微凝胶骨粉不仅具有良好的生物活性玻璃的促新骨生成功效，同时因有铈、硒元素而具有促骨细胞生长兼具抑制/杀灭癌细胞的功效，同时因类人胶原蛋白的存在具有优异的骨诱导活性和新骨生成的功能。此外，微凝胶骨粉的粒径约为500~700μm，具有很好的流动性和空间堆积能力，可有效契合骨瘤术后骨组织缺损形态，实现缺损组织修复，亦可作为骨水泥或人工骨预制支架的理想材料。本发明所述的新型微凝胶骨粉原料易得、合成工艺简易，性能稳定，生物学功效性显著，具有良好的市场应用价值。
附图说明
14.图1为实施例1中介孔生物活性玻璃纳米微球的sem图；图2为实施例1中介孔生物活性玻璃纳米微球的tem图；图3为实施例1中介孔生物活性玻璃纳米微球的eds图；图4为实施例1中介孔生物活性玻璃纳米微球的xrd图；图5为实施例1中新型微凝胶骨粉的显微镜照片；图6为实施例4中微凝胶骨粉的dmem浸提液培养的mg
‑
63细胞的mtt图（左）和对培养的mg
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63细胞进行ao/eb染色的细胞形态图（右）；图7为实施例4中微凝胶骨粉的dmem浸提液培养的hbmsc细胞的mtt图（左）和对培养的hbmsc细胞进行ao/eb染色的细胞形态图（右）。
15.具体实施实例下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法；所用的材料试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
16.实施例1一种可用于骨瘤术后组织修复的新型微凝胶骨粉的制备步骤一，介孔生物活性玻璃纳米微球的制备。
17.在500rpm磁力搅拌下，将0.02g/ml的十六烷基三甲基溴化铵溶液240ml、无水
乙醇160ml和25%的氨水3ml混合均匀，向其中加入7.11g四水合硝酸钙、1.30g六水合硝酸铈和0.52g亚硒酸钠并充分溶解后，再向其中加入1.4ml磷酸三乙酯和14ml硅酸四乙酯，待充分反应后，离心收集沉淀，用乙醇和超纯水交替洗涤三次后，将沉淀放入60℃烘箱中保持24h，再将烘干后的沉淀放入600℃马弗炉中煅烧3h，获得富含硒、铈元素的介孔生物活性玻璃纳米微球。
18.对介孔生物活性玻璃纳米微球进行孔径分析知其孔径为2~5nm。通过sem（图1）、tem（图2）检测结果知所获得的介孔生物活性玻璃纳米微球粒径约300nm，尺寸均匀；通过eds检测（图3）可以确认铈、硒元素均存在于介孔生物活性玻璃纳米微球中；通过xrd（图4）检测结果表明，介孔生物活性玻璃纳米微球的衍射峰是无定形峰包，为非晶态结构，吻合硅酸盐玻璃的典型特征；出现的氧化铈的特征峰（氧化铈的标准卡：pdf#43
‑
1002）也可以表明铈元素有效掺杂在生物玻璃中且以氧化态形式存在。
19.步骤二，新型微凝胶骨粉的制备。
20.在500rpm磁力搅拌下，将步骤一中制备的介孔生物活性玻璃纳米微球0.2g分散在100ml的超纯水中，再向其中加入0.02g/ml海藻酸钠溶液50ml和0.1g/ml类人胶原蛋白溶液50ml得到新的混悬液。采用静电纺丝仪将该混悬液滴入氯化钙溶液中形成凝胶微球，离心收集凝胶微球并用超纯水洗涤，再对凝胶微球进行冷冻干燥和co
‑
60灭菌处理，即制得最终的新型微凝胶骨粉，采用显微镜观察可以看到其粒径约600μm（图5）。
21.实施例2一种可用于骨瘤术后组织修复的新型微凝胶骨粉的制备步骤一，介孔生物活性玻璃纳米微球的制备。
22.在500rpm磁力搅拌下，将0.02g/ml的十六烷基三甲基溴化铵溶液240ml、无水乙醇160ml和25%的氨水3ml混合均匀，向其中加入7.10g四水合硝酸钙、2.60g六水合硝酸铈和0.52g亚硒酸钠并充分溶解后，再向其中加入0.80ml磷酸三乙酯和14ml硅酸四乙酯，待充分反应后，离心收集沉淀，用乙醇和超纯水交替洗涤三次后，将沉淀放入60℃烘箱中保持24h，再将烘干后的沉淀放入600℃马弗炉中煅烧3h，获得富含硒、铈元素的介孔生物活性玻璃纳米微球，其理化性质与实施例1中所获得的介孔生物活性玻璃纳米微球的理化性质相似。
23.步骤二，新型微凝胶骨粉的制备。
24.在500rpm磁力搅拌下，将步骤一中制备的介孔生物活性玻璃纳米微球0.2g分散在100ml的超纯水中，再向其中加入0.04g/ml海藻酸钠溶液50ml和0.2g/ml类人胶原蛋白溶液50ml得到新的混悬液。采用静电纺丝仪将该混悬液滴入氯化钙溶液中形成凝胶微球，离心收集凝胶微球并用超纯水洗涤，再对凝胶微球进行冷冻干燥和co
‑
60灭菌处理，即制得最终的新型微凝胶骨粉，其理化性质与实施例1中所获得的微凝胶骨粉的理化性质相似。
25.实施例3一种可用于骨瘤术后组织修复的新型微凝胶骨粉的制备步骤一，介孔生物活性玻璃纳米微球的制备。
26.在500rpm磁力搅拌下，将0.02g/ml的十六烷基三甲基溴化铵溶液240ml、无水乙醇160ml和25%的氨水3ml混合均匀，向其中加入7.10g四水合硝酸钙、0.65g六水合硝酸铈和0.52g亚硒酸钠并充分溶解后，再向其中加入0.7ml磷酸三乙酯和7ml硅酸四乙酯，待充分反应后，离心收集沉淀，用乙醇和超纯水交替洗涤三次后，将沉淀放入60℃烘箱
中保持24h，再将烘干后的沉淀放入600℃马弗炉中煅烧3h，获得富含硒、铈元素的介孔生物活性玻璃纳米微球，其理化性质与实施例1中所获得的介孔生物活性玻璃纳米微球的理化性质相似。
27.步骤二，新型微凝胶骨粉的制备。
28.在500rpm磁力搅拌下，将步骤一中制备的介孔生物活性玻璃纳米微球0.3g分散在100ml的超纯水中，再向其中加入0.06g/ml海藻酸钠溶液50ml和0.05g/ml类人胶原蛋白溶液50ml得到新的混悬液。采用静电纺丝仪将该混悬液滴入氯化钙溶液中形成凝胶微球，离心收集凝胶微球并用超纯水洗涤，再对凝胶微球进行冷冻干燥和co
‑
60灭菌处理，即制得最终的新型微凝胶骨粉，其理化性质与实施例1中所获得的微凝胶骨粉的理化性质相似。
29.实施例4新型微凝胶骨粉的细胞学实验。
30.采用实施例1中所制备的新型微凝胶骨粉为研究对象，考察其对促细胞生长和抑制或杀灭癌细胞的功效，具体为：（1）新型微凝胶骨粉的dmem浸提液的制备
①
dmem细胞完全培养液：在dmem基础培养基中加入10%胎牛血清，100μg/ml的链霉素，100u/ml的青霉素，混和均匀，放入4
°
c冰箱，备用。
31.②
pbs溶液的配制：分别称取氯化钾0.01g，氯化钠0.40g，磷酸氢二钾0.01g，磷酸氢二钠0.17g，加入1000ml双重蒸馏水，超声溶解后，调节ph至7.40，121
°
c灭菌30min，保存在4
°
c冰箱待用。
32.③
0.25%胰酶的配制：称取胰酶100mg，加入40mlpbs，用0.22μm滤膜将其过滤，放于4
°
c冰箱，保存待用。
33.④
新型微凝胶骨粉的dmem浸提液的制备：称取1g实施例1中的新型微凝胶骨粉放入无菌的中性pbs溶液中浸泡至溶胀平衡，去除掉pbs溶液，向其中加入10ml的dmem培养液，放于37
°
c恒温箱中保持三天后，再用0.22μm滤膜将其过滤，得到新型微凝胶骨粉的dmem浸提液，放于4
°
c冰箱待用。
34.（2）细胞培养选取hbmsc细胞和mg
‑
63细胞作为正常细胞和癌细胞的模型细胞，利用新型微凝胶骨粉的dmem浸提液分别进行培养，考察浸提液对模型细胞生长的影响。
35.①
细胞的传代将mg
‑
63细胞与hbmsc细胞分别转入含有dmem培养液的培养皿并放于37
°
c、5%co2培养箱中培养12h，弃去培养液，再加入3mlpbs清洗细胞后，加入2ml胰酶，放入培养箱消化1.5min，取出培养皿向其中加入3ml培养液终止消化，用移液枪吹打细胞培养液数次后，将含mg
‑
63细胞分与hbmsc细胞的培养液分别移入15ml离心管中，在1000rpm离心5min，弃去上清液，再向各自离心管中加入2ml培养液，吹匀后，再分别分成两份加入含有9mldmem培养液的新培养皿中十字摇匀，平放入37
°
c、5%co2培养箱中培养24h。
36.②
细胞的布板将
①
中培养好的细胞从培养箱中取出，弃去培养液，再加入3mlpbs清洗细胞后，加入2ml胰酶，放入培养箱消化1.5min，待消化完成后，用移液枪吹打细胞培养液数次后，分别加入5
‑
8ml培养液并吹打细胞数次，然后将各个细胞样品分别打入50μl至细胞计数
板，计数后，按一定比例稀释细胞，然后在96孔板中布入细胞，细胞密度约为1
×
104个/孔，放入37
ꢀ°
c，5% co2培养箱中再培养24 h。
37.③
微凝胶骨粉的dmem浸提液培养细胞将
②
中培养细胞的96孔板取出，弃掉培养液，向其中分别加入本实施例中（1）所制备的微凝胶骨粉的dmem浸提液（实验组）和等体积的dmem培养液（对照组），置于培养箱进行培养，每个浓度设置5个复孔。待培养24 h后，向每孔加入mtt 50
ꢀµ
l，继续培养2
‑
4 h后，分别向每孔加入150
ꢀµ
l dmso，用酶标仪在490 nm处检测每个孔对应的吸光度(od)值，根据od值来计算细胞存活率。实验结果表明，当微凝胶骨粉在dmem培养液中的浓度为350
ꢀµ
g/ml时，微凝胶骨粉的dmem浸提液对mg
‑
63细胞具有强毒性，对hbmsc细胞具有低微的毒性。
38.图6是微凝胶骨粉的dmem浸提液培养的mg
‑
63细胞的mtt图（左）和对培养的mg
‑
63细胞进行ao/eb染色的细胞形态图（右）。从mtt图的可以看出，微凝胶骨粉的dmem浸提液对mg
‑
63细胞培养24 h后细胞活力约为10%，ao/eb染色的细胞形态图表明，相对于对照组细胞而言，利用浸提液培养的mg
‑
63细胞存活数量稀少，且细胞严重变形，表明微凝胶骨粉的dmem浸提液对mg
‑
63细胞具有强烈的抑制和杀灭作用，即微凝胶骨粉对癌细胞具有有效的抑制和杀死肿瘤细胞的能力。
39.图7是微凝胶骨粉的dmem浸提液培养的hbmsc细胞的mtt图（左）和对培养的hbmsc细胞进行ao/eb染色的细胞形态图（右）。从mtt图的可以看出，微凝胶骨粉的dmem浸提液对hbmsc细胞培养24 h后细胞活力约为80%以上，ao/eb染色的细胞形态图表明，相对于对照组细胞而言，利用浸提液培养的hbmsc细胞存活数量与对照组相近，两种条件下培养的细胞形态相似，表明微凝胶骨粉的dmem浸提液对hbmsc细胞具有良好的生物相容性。
40.通过细胞学实验表明，本发明以具有良好生物相容性的海藻酸钙和类人胶原蛋白为有机主相，以富含硒、铈元素的介孔生物活性玻璃为无机填充相，制备了一种兼具促骨细胞生长和抑制癌细胞生长的新型微凝胶骨粉，可有效实现骨瘤术后组织缺损修复。
41.最后应当说明的是，尽管结合实施例对本发明做了以上描述，但本发明并不局限于上述实施例及应用领域，上述方案仅仅做示意及指导用途，而不是限制性的。本领域普通技术人员在本说明书的启发下和在不脱离本发明权力要求所保护的范围的情况下，对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。