白桦脂酮酸衍生物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种白桦脂酮酸衍生物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.随着生活水平的提高和人口老龄化加剧，同时受社会、环境等因素影响，心血管疾病发病率逐年增加，已成为人类死亡率最高的疾病之一。在心肌梗死，缺血再灌注损伤等多种心血管疾病的发生发展过程中多伴有心肌细胞损伤，进而发生细胞凋亡等，引起心血管功能的紊乱。心肌缺血和氧化应激是心血管疾病产生的重要因素。
3.白桦脂酮酸又称桦木酮酸，是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，主要来源于桦树的树皮,也存在于苹果、使君子、黄荆和黄杨等植物中。现代药理研究发现，白桦脂酮酸具有抗肿瘤、抗病毒和抗炎等生物活性，其中以抗黑色素瘤而闻名。白桦脂酮酸作为白桦酸的氧化产物，是药物化学研究的重要中间体。有研究发现，白桦脂酮酸经过结构改造后产物的抗hiv活性得以增强。现有技术中，化学结构修饰的位点主要为白桦脂酮酸3位的羰基和28位的羧基。由于五环三萜类化合物结构的特殊性，母核缺乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以对母核结构进行修饰，获得母核上具有羟基、羰基等修饰的衍生物，因此，具有母核结构修饰的白桦脂酮酸衍生物的研究较少。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的是提供一种白桦脂酮酸衍生物或其药学上可成的盐在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
5.本发明提供的技术方案如下：
6.一种如下任一结构式所示的白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗心血管疾病的药物中的应用，
[0007][0008]
上述白桦脂酮酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
1)发酵培养微生物，向培养基中加入白桦脂酮酸，培养基中白桦脂酮酸的浓度为2
‑
5000μg/ml，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为根霉，犁头霉，毛霉或共头霉属的菌株；
[0010]
2)将所述发酵液经有机溶剂萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物，其中，有机溶剂优选乙酸乙酯；
[0011]
3)转化粗提物经反相硅胶柱色谱，以甲醇：水作为流动相进行梯度洗脱，收集流份后经hplc分析合并得5个组分，其中，梯度洗脱条件优选采用甲醇：水20:80
‑
40:60
‑
60:40
‑
80:20
‑
100:0；
[0012]
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到白桦脂酮酸衍生物。
[0013]
优选的，所述心血管疾病包括心肌细胞凋亡、心力衰竭或心肌缺血再灌注损伤引起的心血管疾病。
[0014]
优选的，所述心血管疾病包括心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病或慢性心力
衰竭。
[0015]
优选的，所述药物还含有药学上可以接受的辅料。
[0016]
优选的，所述药学上可接受的辅料为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。
[0017]
本发明利用微生物转化技术对白桦脂酮酸的母核结构进行修饰得到的白桦脂酮酸衍生物，具有较好的心肌细胞保护活性，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分，在医药领域具有广泛的用途。
具体实施方式
[0018]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细描述。
[0019]
实施例1：结构式为式
ⅰ‑
式xvi的化合物的制备
[0020]
本发明采用微生物转化方法，以白桦脂酮酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。根霉(rhizopus)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。
[0021]
以少根根霉rhizopus arrhizus cgmcc 3.868为例，制备结构式为式
ⅰ‑
式xvi的化合物的过程如下：
[0022]
1)发酵、转化以及萃取
[0023]
将少根根霉rhizopus arrhizus cgmcc 3.868接入2个250ml三角瓶(装有100ml马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1ml的种子液，加入到20个1000ml摇瓶(装有400ml马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20mg白桦脂酮酸(0.2ml，100mg/ml dmso溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.78g。
[0024]
2)反相柱色谱分离
[0025]
转化粗提物经反相硅胶柱色谱ods
‑
c18(100g，60
×
3cm，50μm)进行分离。甲醇：水梯度洗脱(20:80，40:60，60:40，80:20，100:0)。收集流份，经hplc分析后合并，得合并组分a
‑
e。
[0026]
3)反相高效液相色谱纯化
[0027]
合并组分a
‑
e分别用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱ymc ods a
‑
5μm，10.0
×
250mm，乙腈
‑
水(35:65，42:58，55:45，58:42，v/v)，流速2.5ml/min，检测波长203nm。得到结构式为式
ⅰ‑
式xvi的16个转化产物，其质谱和波谱数据如下所示。
[0028]
化合物ⅰ：7β
‑
乙酰氧基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
7β
‑
acetoxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点286
–
288℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3562,3029,2921,1741,1707,1693,1376,1214,1061cm
‑1；高分辨质谱m/z 511.3426[m
–
h]
‑
(calcd.for c
32
h
47
o5,511.3423)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
[0029]
化合物ⅱ：11α,15α
‑
二羟基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
11α,15α
‑
dihydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点324
–
325℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3457,3035,2943,1745,1712,1382,1241,1076cm
‑1；高分辨质谱m/z 485.3264[m
–
h]
‑
(calcd.for c
30
h
45
o5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
[0030]
化合物ⅲ：7β,11β
‑
二羟基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
7β,11β
‑
dihydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点318
–
320℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3524,3041,2938,1742,1705,1365,1231,1086cm
‑1；高分辨质谱m/z 485.3266[m
–
h]
‑
(calcd.for c
30
h
45
o5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
[0031]
化合物ⅳ：7β
‑
羟基
‑
30
‑
乙酰氧基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
30
‑
acetoxy
‑
7β
‑
hydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点304
–
305℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3481,3036,2952,1738,1715,1698,1388,1235,1057cm
‑1；高分辨质谱m/z 527.3372[m
–
h]
‑
(calcd.for c
32
h
47
o6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
[0032]
化合物
ⅴ
：15α
‑
羟基
‑
30
‑
乙酰氧基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
30
‑
acetoxy
‑
15α
‑
hydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点297
–
299℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3506,3041,2953,1748,1711,1695,1368,1227,1050cm
‑1；高分辨质谱m/z 527.3370[m
–
h]
‑
(calcd.for c
32
h
47
o6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
[0033]
化合物
ⅵ
：30
‑
过氧羟基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
30
‑
hydroperoxyl
‑
lup
‑
28
‑
oic acid)；熔点296
–
298℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3577,3039,2963,1735,1701,1371,1243,1075cm
‑1；高分辨质谱m/z 485.3264[m
–
h]
‑
(calcd.for c
30
h
45
o5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
[0034]
化合物
ⅶ
：7β,23
‑
二羟基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
7β,23
‑
dihydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点322
–
324℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3497,3044,2962,1753,1712,1384,1207,1055cm
‑1；高分辨质谱m/z 509.3239[m+na]
+
(calcd.for c
30
h
46
o5na,509.3243)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
[0035]
化合物
ⅷ
：7β,15α,23
‑
三羟基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
7β,15α,23
‑
trihydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点343
–
345℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3559,3035,2955,1751,1714,1379,1235,1033cm
‑1；高分辨质谱m/z 501.3215[m
–
h]
‑
(calcd.for c
30
h
45
o6,501.3216)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
[0036]
化合物
ⅸ
：7β
‑
羟基
‑
23
‑
乙酰氧基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
23
‑
acetoxy
‑
7β
‑
hydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点311
–
312℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3543,3032,2941,1742,1715,1697,1376,1214,1028cm
‑1；高分辨质谱m/z 527.3373[m
–
h]
‑
(calcd.for c
32
h
47
o6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表
3。
[0037]
化合物
ⅹ
：15α
‑
羟基
‑
23
‑
乙酰氧基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
23
‑
acetoxy
‑
15α
‑
hydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点305
–
306℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3537,3046,2938,1750,1712,1698,1384,1228,1031cm
‑1；高分辨质谱m/z 527.3376[m
–
h]
‑
(calcd.for c
32
h
47
o6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
[0038]
化合物
ⅺ
：2
‑
羰基
‑
3β,7β
‑
二羟基白桦脂酮酸(2
‑
oxo
‑
3β,7β
‑
dihydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点332
–
334℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3455,3046,2936,1724,1706,1388,1215,1024cm
‑1；高分辨质谱m/z 485.3263[m
–
h]
‑
(calcd.for c
30
h
45
o5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
[0039]
化合物
ⅻ
：2α,7β
‑
二羟基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
2α,7β
‑
dihydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点315
–
317℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3527,3046,2981,1746,1701,1382,1237,1022cm
‑1；高分辨质谱m/z 485.3262[m
–
h]
‑
(calcd.for c
30
h
45
o5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
[0040]
化合物xiii：7β,22β
‑
二羟基白桦脂酮酸(3
‑
oxo
‑
7β,22β
‑
dihydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid)；熔点324
–
325℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3471,3053,2973,1757,1711,1379,1213,1027cm
‑1；高分辨质谱m/z 485.3261[m
–
h]
‑
(calcd.for c
30
h
45
o5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
[0041]
化合物xiv：20(s)
‑
7β
‑
羟基
‑
29
‑
乙酰氧基白桦脂酮酸(20(s)
‑3‑
oxo
‑
7β
‑
hydroxy
‑
29
‑
acetoxy
‑
lup
‑
28
‑
oic acid)；熔点302
–
304℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3538,2963,1745,1713,1702,1369,1223,1033cm
‑1；高分辨质谱m/z 529.3531[m
–
h]
‑
(calcd.for c
32
h
49
o6,529.3529)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
[0042]
化合物xv：20(s)
‑
7β
‑
羟基
‑
29
‑
乙酰氧基白桦脂酮酸(20(r)
‑3‑
oxo
‑
7β
‑
hydroxy
‑
29
‑
acetoxy
‑
lup
‑
28
‑
oic acid)；熔点311
–
313℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3533,2977,1744,1716,1701,1361,1227,1039cm
‑1；高分辨质谱m/z 529.3533[m
–
h]
‑
(calcd.for c
32
h
49
o6,529.3529)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
[0043]
化合物xvi：7β
‑
羟基白桦脂酮酸
‑
28
‑
o
‑
β
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷(3
‑
oxo
‑
7β
‑
hydroxy
‑
lup
‑
20(29)
‑
en
‑
28
‑
oic acid
‑
β
‑
d
‑
glucopyranosyl ester)；熔点386
–
388℃；旋光度(c＝0.1,meoh)；红外光谱主要的吸收峰(kbr)ν
max
：3575,3047,2967,1741,1709,1355,1237,1035cm
‑1；高分辨质谱m/z 631.3847[m
–
h]
‑
(calcd.for c
36
h
55
o9,631.3846)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
[0044]
表1.化合物ⅰ、化合物ⅱ、化合物ⅲ和化合物ⅳ的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
[0045][0046][0047]
表2.化合物
ⅴ
、化合物
ⅵ
、化合物
ⅶ
和化合物
ⅷ
的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
[0048][0049]
表3.化合物
ⅸ
、化合物
ⅹ
、化合物
ⅺ
和化合物
ⅻ
的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
[0050][0051]
表4.化合物xiii、化合物xiv、化合物xv和化合物xvi的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
[0052][0053]
以上结果表明，所得化合物结构正确。
[0054]
实施例2：化合物
ⅰ‑
xvi对由过氧化氢损伤的心肌细胞保护活性
[0055]
(1)实验材料
[0056]
co2培养箱(jouan igo150)；酶标仪(bio
‑
tek elx800)；荧光倒置显微镜(olympus ix51)；mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、dmem高糖培养基(gibcol brl)，胎牛血清、二甲基亚砜(dmso)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、30％的过氧化氢(h2o2)(天津市瑞金特化学品有限公司)、h9c2细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)。
[0057]
(2)实验方法
[0058]
采用mtt法测定各受试化合物对h2o2损伤的h9c2细胞活性的影响：用胰酶消化后进行细胞计数，调整细胞悬液的细胞密度至5
×
104个/ml，于96孔培养板中每孔加入200μl，置于5％co2，37℃恒温co2培养箱中培养12h。待细胞贴壁后分组处理：对照组、模型组(h2o
2 600μmol/l损伤6h)、模型+受试化合物(10、20、40μm)组。每孔终体积均为200μl，每个浓度设3个平行。药物处理24h后，于各孔内加入mtt溶液10μl(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。酶标仪490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率：细胞存活率＝加药组od值/对照组od值。
[0059]
(3)实验结果
[0060]
根据mtt法测试结果，计算白桦脂酮酸衍生物
ⅰ‑
xvi对h2o2损伤的h9c2细胞存活率的结果如表5所示。
[0061]
表5测试化合物对h2o2损伤的h9c2细胞存活率的影响
[0062]
[0063][0064]
(与对照组相比较，
#
p<0.05；与模型组相比较，
*
p<0.05，
**
p<0.01)
[0065]
与对照组比较，h2o2处理组的细胞存活率显著降低，说明细胞造模成功。与h2o2处理组比较，白桦脂酮酸衍生物
ⅰ‑
xvi均能显著提高细胞的生存率，表明白桦脂酮酸衍生物
ⅰ‑
xvi具有显著的心肌细胞保护作用，且在一定的剂量范围内呈现良好的剂量依赖关系，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分。
[0066]
实施例3本发明化合物
ⅰ‑
xvi对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用
[0067]
1)实验材料
[0068]
co2培养箱(jouan igo150)；酶标仪(bio
‑
tek elx800)；荧光倒置显微镜(olympus ix51)；mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、dmem高糖培养基(gibcol brl)，胎牛血清、二甲基亚砜(dmso)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、h9c2细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)。
[0069]
测试样品：白桦脂酮酸及实施例1所合成得到的化合物
ⅰ–
xvi，纯度在95％以上，各化合物均以dmso溶解后稀释。
[0070]
2)实验方法
[0071]
取对数生长期的h9c2细胞，用含10％小牛血清及1％青霉素
‑
链霉素双抗液的dmem培养液，调整细胞浓度为5
×
104个/ml，接种于96孔培养板，约24h后更换新无糖、无血清鲜培养液，并加入化合物，放入无氧工作站内缺氧损伤1h，取出后加入糖和血清再培养24h，24h后用mtt染色法检测各孔细胞成活率。
[0072]
3)实验结果
[0073]
根据mtt法测试结果，计算白桦脂酮酸衍生物
ⅰ‑
xvi对缺血再灌注损伤的h9c2细胞
存活率的影响结果如表6所示。
[0074]
表6测试样品对缺血再灌注损伤的h9c2细胞存活率的影响
[0075]
[0076][0077]
(与对照组相比较，
#
p<0.05；与模型组相比较，
*
p<0.05，
**
p<0.01)
[0078]
结果表明，与模型组比较不同浓度的化合物
ⅰ–
xvi处理后均可明显升高心肌细胞存活率，表明本发明的化合物
ⅰ–
xvi可有效保护缺氧/复氧对h9c2心肌细胞的损伤，且具有一定的剂量依赖性，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分。
[0079]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。