一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法与流程

1.本发明涉及一种提取物的提取方法，特别是一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法。


背景技术：

2.七叶一枝花是百合科重楼属植物，与云南重楼一同作为中药重楼的法定基原植物收载于2015版《中国药典》。又名蚤休、重台草等，因其叶多为7片轮生于茎项，而花单生于轮生叶片之上而得名，在我国四川、云南、广西、贵州、江西、湖南等地均有分布。七叶一枝花根茎药用历史悠久，因其根茎入药具有解毒、止痛、定惊、清热多种功效，此外七叶一枝花还是云南白药、宫血宁、夺命丹等一些重要中药的主要原料。
3.七叶一枝花化学成分复杂，其主要有效成分为多种甾体皂苷。近年来，对于七叶一枝花所属的重楼属植物的研究主要集中于其有效成分甾体皂苷的分离及其药理研究、重楼总皂苷应用基础研究等。目前重楼药材标准采用2个偏诺皂苷(重楼皂苷
ⅶ
和
ⅵ
)和2个薯蓣皂苷(重楼皂苷ⅰ和ⅱ)之和不低于0.6％进行限量控制。甾体皂苷类是七叶一枝花产生抗炎作用的主要成分，作用强度与皂苷元的结构类型密切相关，而其中偏诺皂苷、薯蓣皂苷均表现出较强的抗炎活性。
4.由于七叶一枝花，为块根类植物，由于其细胞壁多由纤维素构成，有效成分往往包裹在细胞壁内，因此对于化妆品用的七叶一枝花的有效成分的提取，有效成分从内向外的传质阻力较大，有效成分的提取难度较大，总皂苷的提取率最高只能达到30％，导致目前市面上用于化妆品的七叶一枝花提取物多为混合物，抗炎有效成分纯度最高为40％，很难用于放大生产。
5.因此，现有的用于化妆品的七叶一枝花有效成分的提取方法，存在提取率不高、提取成分纯度较低的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，提供一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法。本发明具有提高有效成分提取率和提取纯度的特点。
7.本发明的技术方案：一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法，包括以下步骤：
8.a、预处理：将七叶一枝花的根茎粉碎，过筛，得七叶一枝花的粉末；
9.b、酶解：将七叶一枝花的粉末加入纯水中，加入纤维素酶酶解，分离滤渣和滤液；
10.c、提取脱色：向滤渣中加入乙醇回流提取，合并提取液和滤液，再加入活性炭回流，得脱色液；
11.d、减压浓缩：将脱色液减压浓缩至无醇味,加水溶解，得七叶一枝花的粗提取物水溶液；
12.e、初步纯化：将七叶一枝花的粗提取物水溶液上大孔吸附树脂柱，收集未吸附部
分，然后经洗脱液洗脱，收集体积分数分别为50％、70％和95％的乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得中间产物a；
13.f、进一步纯化：将中间产物a上硅胶柱，经洗脱液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得中间产物b；
14.g、终纯化：将中间产物b上反相柱，经洗脱液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得七叶一枝花皂苷提取物粉末。
15.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤b中，七叶一枝花和纯水的料液比为1g：15
‑
25ml。
16.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤b中，纤维素酶酶解为，纤维素酶在酸性条件下，温度为50
‑
55℃下恒温反应88
‑
95min后，灭活。
17.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤b中，纤维素酶酶解为，纤维素酶在酸性条件下，温度为52℃下恒温反应92min后，于100℃下灭活。
18.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤c具体为，向滤渣中加入体积分数为70
‑
80％的乙醇回流提取2
‑
3次，每次1.5
‑
2.5h，合并提取液和滤液，加入0.4％，g/ml的活性炭回流0.3
‑
0.8h，得脱色液。
19.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤c中，滤渣和乙醇的料液比为1g：3
‑
6ml。
20.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤e中，洗脱具体为，依次以3
‑
7个柱体积的水、体积分数为30％的乙醇、体积分数为50％的乙醇、体积分数为70％的乙醇和体积分数为95％的乙醇进行洗脱。
21.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤f的洗脱液为二氯甲烷
‑
甲醇
‑
水，其中二氯甲烷：甲醇：水的体积比为4
‑
7：l：0.1。
22.前述的一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法中，所述步骤g中的洗脱液为甲醇
‑
水，其中甲醇：水的体积比为7
‑
11：1。
23.与现有技术相比，本发明通过改进提取方法，从七叶一枝花中提取得到的抗炎有效成分提取物为淡黄色粉末，无刺激性气味，易溶于水，且对人体安全无刺激，具有较强的抗炎效果，更加适合应用在化妆品中；七叶一枝花利用酶解可以有效除去外层的细胞壁，促进有效成分的溶出，减小有效成分从内向外的传质阻力，从而提高皂苷的提取率，然后依次经过大孔吸附树脂柱、硅胶柱、反相柱层层纯化，使得最终得到的提取物中有效抗炎成分偏诺皂苷含量可以达到38％，薯蓣皂苷含量可达到49％，七叶一枝花抗炎有效成分的纯度高于60％。
24.且提取工艺可放大生产，有工业实际应用价值，且对人体安全无刺激，具有较强的抗炎效果可应用在化妆品中。
25.因此，本发明具有提高有效成分提取率和提取纯度的特点。
附图说明
26.图1是七叶一枝花提取物水溶液对rbl
‑
2h3细胞增殖/毒性的影响图；
27.图2是在rbl
‑
2h3细胞上七叶一枝花提取物水溶液对组胺释放的影响图。
具体实施方式
28.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
29.一种从七叶一枝花中提取化妆品用有效成分的方法，包括以下步骤：
30.a、预处理：将七叶一枝花的干燥根茎粉碎，过三号筛，得七叶一枝花的粉末；
31.b、酶解：将七叶一枝花的粉末加入纯水中，七叶一枝花和纯水的料液比为1g：15
‑
25ml，用naac
‑
hac缓冲溶液调整ph至4.6，加入32u/g的纤维素酶在50
‑
55℃下恒温反应88
‑
95min后，灭活，室温下抽滤分离滤渣和滤液；纤维素酶的添加可以有效除去外层的细胞壁，促进有效成分的溶出，减小有效成分从内向外的传质阻力，从而提高皂苷的提取率，还安全，低毒，高效的特点。
32.c、提取脱色：向滤渣中加入体积分数为70
‑
80％的乙醇，滤渣和乙醇的料液比为1g：3
‑
6ml，回流提取2
‑
3次，每次1.5
‑
2.5h，合并提取液和滤液，加入0.4％，g/ml的活性炭回流0.3
‑
0.8h，得脱色液；活性炭可以采用767型活性炭；
33.d、减压浓缩：将脱色液减压浓缩至无醇味,加水溶解，得七叶一枝花的粗提取物水溶液；
34.e、初步纯化：将七叶一枝花的粗提取物水溶液上大孔吸附树脂柱进行吸附分离，收集未吸附部分，然后依次以3
‑
7个柱体积的水、体积分数为30％的乙醇、体积分数为50％的乙醇、体积分数为70％的乙醇和体积分数为95％的乙醇进行洗脱，收集体积分数分别为50％、70％和95％的乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得中间产物a；
35.f、进一步纯化：将中间产物a上硅胶柱层析，经二氯甲烷
‑
甲醇
‑
水洗脱液洗脱，其中二氯甲烷：甲醇：水的体积比为4
‑
7：l：0.1，收集洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得中间产物b；
36.g、终纯化：将中间产物b上c18反相柱层析，经甲醇
‑
水洗脱液洗脱，其中甲醇：水的体积比为7
‑
11：1，收集洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得七叶一枝花皂苷提取物粉末。
37.检测：使用hplc仪器，并用偏诺皂苷(重楼皂苷
ⅶ
和
ⅵ
)和薯蓣皂苷(重楼皂苷ⅰ和ⅱ)的纯品作为标准品检测七叶一枝花皂苷提取物粉末中各皂苷的含量，检测结果为：偏诺皂苷含量为24％
‑
38％，薯蓣皂苷含量为36
‑
49％。
38.对二甲苯引起的小鼠耳肿胀炎症模型的影响试验：
39.取体质量为19
‑
23g的雄性小鼠110只，将雄性小鼠随机分为11组(每组10只)，分别为模型对照组、七叶一枝花提取物样品总皂苷组和泼尼松组，灌胃给药，每天2次，总共6次，给药体积均为0.1ml/10g，在末次给药后30min在小鼠左耳均匀涂抹二甲苯(0.05ml/只)，30min处死动物，用直径为8mm的不锈钢冲子取下左右耳片称重，以其左右耳片的重量差作为肿胀度，并计算抑制率。抑制率％＝(对照组平均肿胀度
‑
给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度。结果见表1。
40.表1重楼皂苷单体和醇提取物对小鼠耳廓肿胀的影响(xˉ
±
s,n＝10)
[0041][0042]
注:与空白对照组比较,*p<0.05,**p<0.01
[0043]
通过对造模动物的一般情况观察可见各实验组动物二甲苯涂抹侧鼠耳不同程度变红、变大，鼠耳部分血管清晰可见。从表2可见，七叶一枝花提取物能使小鼠耳廓肿胀度明显降低，其差异具有统计学意义(p<0.01,p<0.05)。
[0044]
七叶一枝花提取物对组胺释放影响的试验：
[0045]
最大安全浓度筛选：取对数生长期的rbl
‑
2h3细胞4
×
105cells/ml，接种于96孔板，100μl/孔，置于37℃、95％rh、5％co2的培养箱孵育24h；分别向样品孔加入100μl含样品的培养液，每个剂量设3个复孔，同时设置空白对照组，并加入等体积的无药培养液，37℃下培养箱孵育24h，分别向每孔加入20μl的mtt试剂，37℃下培养箱孵育1
‑
4h，用酶标仪测定在490nm处的吸光度。
[0046]
组胺释放量检测
‑
elisa法：按照4
×
105cells/ml细胞密度种板，置于37℃、95％rh、5％co2培养箱孵育24h，弃掉培养基，筛选出的最大安全剂量进行加样，继续置于37℃、95％rh、5％co2培养箱孵育30
‑
60min后；取上清液，按照组胺(his)酶联免疫吸附测定试剂盒说明书，检测样本中组胺含量。
[0047]
选取1.25
‑
20mg/ml(共5个浓度梯度)进行mtt细胞毒性筛选。由图1可以看出，当七叶一枝花提取物水溶液浓度为10mg/ml时，rbl
‑
2h3细胞相对活性为88％。利用预实验结果选择10mg/ml的样品浓度作为组胺释放检测的最大安全浓度，依次2倍稀释出5个浓度，用受试物处理rbl
‑
2h3细胞24h，收集上清液，利用elisa试剂盒进行组胺定量检测。以七叶一枝花提取物水溶液浓度和对组胺释放的抑制率作图，通过图2可以看出，不同浓度的七叶一枝花提取物水溶液对rbl
‑
2h3细胞组胺释放均有一定程度的抑制能力，当受试物浓度大于5mg/ml，抑制组胺释放能力最强，抑制率为72.19％
±
0.18％。