FGF21调控糖尿病缺血创面细胞焦亡的机制的应用

fgf21调控糖尿病缺血创面细胞焦亡的机制的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及fgf21调控糖尿病缺血创面细胞焦亡的机制的应用。


背景技术：

2.糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer，dfu)是糖尿病患者特有而常见的并发症，患有糖尿病足部溃疡的患者5年后的死亡风险是没有足部溃疡的糖尿病患者的2.5倍，超过半数以上的dfu患者溃疡创面合并感染，超过20％的中度至重度溃疡感染患者需要采取不同程度的截肢手术治疗，而仅仅只有2/3的糖尿病患者在得到治疗后足部溃疡会痊愈。糖尿病足部溃疡的创面愈合受到多种细胞因子和人类生长因子的调节，并涉及不同类型细胞的协同作用。生长因子在糖尿病足创伤愈合的进程中起着至关重要的作用，影响多种细胞的增殖和迁移、内皮细胞的刺激、成纤维细胞和炎症细胞的血管生成和趋化作用，有助于防止细胞凋亡，并影响细胞外基质的产生和重塑。
3.成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)相对于血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，pdgf)与血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，vegf)等其他生长因子来说，成血管作用更为强大，可以刺激血管生成和成纤维细胞增殖，形成肉芽组织。其中fgf-21在人体内的糖脂代谢过程中发挥着不可或缺的作用，是脂肪细胞葡萄糖摄取的驱动力。 fgf21可加速人体葡萄糖摄取、脂肪分解代谢和能量代谢构成，防止心血管应激损伤并抑制细胞凋亡，介导了一系列与糖脂代谢紊乱及其相关并发症相关的有益效应，在糖尿病及其各种并发症中有潜在的应用前景。细胞焦亡(pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种近年来新发现的细胞内源性死亡机制，其激活的信号通路主要包括依赖caspase-1的经典途径以及依赖caspase-4、5、11的非经典途径，而nlrp3炎症小体属于核苷酸结合寡聚结构域样受体(nlr)蛋白家族，是目前研究最广泛的炎症体。当糖尿病足创面细菌感染等刺激下，nlrp3炎症小体激活，模式识别受体通过接头蛋白asc与caspase-1的前体结合，激活caspase-1 后切割gasdermin d，生成含氮端活性域的肽段，激活细胞焦亡，同时活化的 caspase-1对il-1β和il-18的前体进行切割，形成有活性的il-1β和il-18，并释放到胞外，募集炎症细胞聚集并扩大炎症反应。


技术实现要素：

4.基于以上问题，本发明提供fgf21调控糖尿病缺血创面细胞焦亡的机制的应用，依据本发明的机制制备的治疗药物具有安全性好、药效持续时间长的优势，对于糖尿病缺血创面的治疗和预防具有重大价值。
5.为解决以上技术问题，本发明提供了fgf21调控糖尿病缺血创面细胞焦亡的机制在制备预防或治疗与糖尿病缺血创面相关的疾病的药物中的应用，所述机制如下：fgf21通过调控nf-κb/nlrp3信号通路来抑制炎症反应，进而发挥改善糖尿病缺血创面预后的作用。
6.进一步的，所述药物为fgf21蛋白，所述fgf21蛋白的有效剂量为0.1～ 100mg/kg。
7.进一步的，所述药物通过fgf21降低血管内皮细胞及成纤维细胞nlrp3、 asc、nf-κb、caspase-1、nf-κb p65、il-1β和il-18的表达水平，nf-κb过表达后fgf21对nlrp3、asc、nf-κb、caspase-1、nf-κb p65、il-1β和il-18表达的抑制作用减弱，nf-κb沉默后fgf21对nlrp3、asc、nf-κb、caspase-1、 nf-κb p65、il-1β和il-18表达的抑制作用增强。
8.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次提出fgf21具有治疗糖尿病缺血创面的作用，其能抑制血管内皮细胞及成纤维细胞的细胞焦亡，能够显著降低糖尿病缺血创面的大小，由fgf21作为活性物质制备的糖尿病缺血创面的治疗药物将具有安全性好、药效持续时间长的优势，对于糖尿病缺血创面的治疗和预防具有重大价值。
附图说明
9.图1、图2和图3为本发明的实施例研究提升糖浓度对细胞增殖、迁移、焦亡的影响的结果图；
10.图4和图5为本发明的实施例研究nf-κb p65激活nlrp3炎症小体在糖尿病足创面愈合过程中的作用的结果图；
11.图6和图7为本发明的实施例研究不同糖浓度处理对细胞焦亡的发生及焦亡相关分子标志物的表达水平的影响结果图；
12.图8为本发明的实施例的透射电镜图；
13.图9为本发明的实施例中fgf-21对脐静脉内皮细胞模型中nf-κb p65/nlrp3通路相关蛋白表达及炎性因子的影响结果分析图；
14.图10为本发明的实施例中高糖模型组细胞il-1β的基因表达量结果图；
15.图11为本发明的实施例研究nf-κb p65对fgf-21介导的细胞焦亡的影响结果图；
16.图12为本发明的实施例的体外实验结果图；
17.图13为本发明的实施例的动物实验结果图；
18.图14为本发明的部分作用示意图。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
20.实施例：
21.本实施例提供的fgf21蛋白是一个由约209个氨基酸组成的分泌蛋白， fgf21蛋白的氨基酸序列如下所示(https://www.uniprot.org/uniprot)： mdsdetgfehsglwvsvlaglllgacqahpipdsspllqfggqvrqrylytd daqqteahleiredgtvggaadqspesllqlkalkpgviqilgvktsrflcqr pdgalygslhfdpeacsfrellledgynvyqseahglplhlpgnksphrdpap rgparflplpglppalpeppgilapqppdvgssdplsmvgpsqgrspsyas。
22.本实施例在体外实验中，用不同糖浓度的培养基(4.5、10.0、16.5、32.5g/l) 刺激脐静脉内皮细胞、成纤维细胞，用cck8法检测细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移能力，annexin v-fitc/pi检测细胞总死亡水平；不同浓度fgf-21(100、 200、800nm)分别预处理脐静脉内皮细胞及成纤维3h，透射电镜检测各组细胞焦亡水平，q-pcr及western blotting
检测焦亡相关标志物表达水平。实验中需利用足够数量糖尿病db/db小鼠模型来进行分组并操作，按照不同给药途径分为两大组：局部涂抹组、皮下注射组，每组中，采用随机数字表法分为对照组、fgf-21 15mg/kg组、fgf-2120mg/kg组、fgf-2130mg/kg组，每组5只。同周龄同品系db/m小鼠5只为正常组。对照组给予等体积0.9％生理盐水创面局部涂抹或创周皮下注射，均干预14d。
23.50只小鼠适应性喂养7d后开始实验，检测小鼠fbg＞11.1mmol/l为小鼠模型建模成功。50只小鼠鼠背部以硫化钠脱毛24h后，麻醉后，切除背部中央直径6mm全层皮肤，制作创面模型。各组药物干预前及干预后第0、3、7、14、 30天时，进行空腹剪尾采血，采用血糖仪检测血糖，并使用数码相机拍摄带有标尺的创面照片，采用imagej图像分析软件计算创面面积，统计各组平均残余创面面积及创面完全愈合时间。干预30d后，每组随机挑选1-2只小鼠麻醉，头颈部迅速脱臼处死后，切取背部创面组织置于10％甲醛中固定，经梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋切片，再经脱蜡，进行常规苏木精-伊红(he)染色，观察创面组织病理变化。分析组织新生血管情况以及纤维增生程度。
24.分子机制研究中，为明确nf-κb p65/nlrp3通路在调控糖尿病足难治性创面中的作用，采用q-pcr及western blotting方法检测fgf-21对nf-κb p65、nlrp3、asc、caspase1信号通路相关蛋白和基因表达的影响。后分别在成纤维细胞及脐静脉内皮细胞中转染si-nf-κb p65和nf-κb p65过表达载体质粒 (pcdna-nf-κb p65)后采用western blotting和q-pcr检测nlrp3、asc、 caspase1、il-1β的表达情况。进一步在转染si-nf-κb p65和pcdna-nf-κb p65 后加入fgf-21，采用western blotting和q-pcr法检测fgf-21对nlrp3、asc、 caspase1、il-1β表达的影响。
25.为了明确提升糖浓度对细胞增殖、迁移、焦亡的作用，发明人选择高糖浓度培养基培养的成纤维细胞及脐静脉内皮细胞损伤模型。见附图1，结果发现，与对照组相比，高糖处理后成纤维细胞及脐静脉内皮细胞增殖在第三天时出现明显减缓。见附图2，高糖刺激后，成纤维细胞在4h、8h、12h的迁移能力降低，说明高糖处理成纤维细胞及脐静脉内皮细胞造成增及迁移能力的抑制。见附图3， annexin v-fitc/pi双染检测不同糖浓度处理成纤维细胞总死亡水平，发现在高糖处理后细胞死亡数目增多。上述结果表明，高糖诱导成纤维细胞及脐静脉内皮细胞的增殖、迁移能力受损，并诱导细胞死亡。
26.为了明确nf-κb p65激活nlrp3炎症小体在糖尿病足创面愈合过程中的关键作用，发明人选择高糖浓度培基培养的成纤维细胞及脐静脉内皮细胞损伤模型。见附图4，结果发现，与对照组相比，高糖处理后成纤维细胞及脐静脉内皮细胞 nf-κb p65的mrna表达显著增强，说明高糖诱导的成纤维细胞及脐静脉内皮细胞损伤造成nf-κb p65表达显著上调。同时，见附图5，高糖刺激后，成纤维细胞及脐静脉内皮细胞中nlrp3的mrna水平也显著上调，说明高糖诱导的成纤维细胞及脐静脉内皮细胞损伤造成nlrp3表达显著上调，与高糖诱导的成纤维细胞及脐静脉内皮细胞损伤后nf-κb p65的变化一致。上述结果表明，高糖诱导成纤维细胞及脐静脉内皮细胞损伤过程中发生了nf-κb p65、nlrp3的激活。
27.为了探究高糖对细胞焦亡发生的作用影响，采用q-pcr及western blotting 方法对成纤维细胞及脐静脉内皮细胞检测了不同糖浓度处理对细胞焦亡的发生及焦亡相关分子标志物的表达水平。见附图6，q-pcr结果显示，脐静脉内皮细胞及成纤维细胞在高糖处理后细胞焦亡及炎症相关分子标志物的mrna表达水平均有不同程度的增高。见附图7，
western blotting结果显示，脐静脉内皮细胞及成纤维细胞在高糖处理后细胞焦亡及炎症相关分子标志物的蛋白表达水平有不同程度的增高。上述结果说明，高糖处理能诱导成纤维细胞及脐静脉内皮细胞发生细胞焦亡。
28.综上所述，上述研究结果表明，焦亡发生及焦亡相关标志物mrna及蛋白水平在高糖应激细胞模型中相较于正常组细胞表达增高，高糖可能是成纤维细胞及血管内皮细胞发生焦亡的促进因素。
29.本实施例在fgf-21改善糖尿病创面的分子机制研究中，得到了如下实验结果。见附图8，透射电镜结果显示，高糖处理下的血管内皮细胞中，较fgf21 干预组出现线粒体膨胀，甚至外膜破裂的现象。见附图9，其中：a为fgf-21 脐静脉内皮细胞模型中nf-κb p65/nlrp3通路焦亡相关蛋白表达及炎性因子的影响，b为fgf-21对脐静脉内皮细胞模型中nf-κb p65/nlrp3通路相关蛋白表达的结果分析；结果表明，fgf-21降低高糖诱导的nf-κb p65表达上调并抑制高糖诱导nlrp3炎性小体信号通路激活。见附图10，相比于正常对照组，高糖模型组细胞il-1β的基因表达量明显升高，而随着fgf-21给药，il-1β的表达量逐渐下降；结果表明，fgf-21抑制高糖诱导的炎症因子il-1β释放。见附图11，在高糖应激下的细胞模型中，下调nf-κb p65可协同增强fgf-21介导的对细胞焦亡的抑制作用，过表达nf-κb p65可逆转fgf-21介导的对细胞焦亡的抑制作用。体外实验中，见附图12a和图12b，分别采用fgf21及等体积的pbs处理背部创面，记录创面愈合的时间，发现创面愈合时间存在统计学差异。见附图 12c和图12d，在fgf21处理后，he染色显示创面伤口处注射fgf-21组明显可见更多血管结构与增生组织，两种处理方法的闭合时间差异具有意义。这些结果说明fgf-21增加糖尿病创面的血管生成，促进糖尿病创面快速愈合。
30.见附图13，在动物实验中，图a为不同给药剂量fgf-21(局部涂抹)对创面nf-κb p65表达的影响，图b为不同给药剂量fgf-21(皮下注射)对创面nf-κbp65表达的影响，c为不同给药剂量fgf-21(皮下注射)对糖尿病db/db小鼠创面nf-κb p65/nlrp3通路相关蛋白表达的结果；d为不同给药剂量fgf-21(皮下注射)对糖尿病db/db小鼠创面nf-κb p65/nlrp3通路相关标志物mrna水平的结果，分析结果表明，fgf-21不同给药途径对于细胞焦亡的抑制作用略有不同，局部注射给药有一定优势；fgf-21剂量依赖的降低糖尿病db/db小鼠创面nf-κb p65表达的升高，fgf-21剂量依赖的抑制糖尿病db/db小鼠创面nlrp3 炎性小体信号通路的激活；本实施例的研究结果显示：fgf-21可抑制糖尿病小鼠创面模型及成纤维细胞及内皮细胞模型中nf-κb p65/nlrp3信号通路；附图 14为本发明的fgf-21治疗糖尿病足溃疡的机制示意图，本发明的fgf-21改善 2型糖尿病足溃疡创面的修复机制可应用于制备预防或治疗与糖尿病足缺血相关的疾病的药物中。
31.如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
32.见附图14，为本发明的部分作用示意图。综上所述，本发明首次发现fgf21 蛋白的新功能，即其可以抑制高血糖条件下的血管平滑肌细胞及成纤维细胞 nf-κb/nlrp3炎症体的活化，从而抑制细胞焦亡，最终改善糖尿病缺血创面预后。由fgf21作为活性物质制备的糖尿病缺血创面的治疗药物具有安全性好、药效持续时间长的优势，对糖尿病缺血创面的
治疗和预防具有重大价值。也可直接使用fgf21蛋白作为药物治疗糖尿病缺血创面，fgf21蛋白的有效剂量为 0.1～100mg/kg，给药途径包括口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射或肌肉注射。
33.如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。