一种治疗肥胖及其代谢性疾病药物的提取方法及应用

1.本发明属于提取方法领域；尤其涉及治疗肥胖及其代谢性疾病药物的提取方法及应用。


背景技术：

2.蒙药肋柱花是一种蒙医传统用药，应用历史悠久，蒙药名哈比日跟一地格达。为龙胆科植物肋柱花lomatogoniumrotatum(l.)fries ex nym.的干燥全草。蒙药肋柱花味苦，性寒、钝、糙、轻、燥。具有平息“协日”、清热、健胃、愈伤的功效。用于“协日”热、瘟疫、流感、伤寒、中暑头热、肝胆热、黄疸、胃“协日”、伤热等，蒙医临床上主要用于治疗肝胆系统疾病。
3.肋柱花广泛分布于内蒙古、西藏、云南、四川、青海、甘肃、新疆等地。生于海拔4200m以下的山坡草坡及灌丛中。龙胆科植物大多具有泻肝胆实火、镇咳健胃、祛风湿、舒筋止痛等功效。用于肝胆囊炎，关节炎及消化系统疾病。因此蒙药肋柱花在肋柱花四味汤散、利胆八味散、地格达苏木汤、伊赫哈日十二味散、土木香十味汤散等经典和现代蒙药处方中作为主要或者配伍使用，在蒙医临床上主要用于治疗黄疸型肝炎、急性肠炎、痢疾、胆囊炎、肺炎等症。
4.肋柱花主要药理作用有保肝、抗炎、抗肿瘤、减脂。其化学成分主要以呫吨酮类、黄酮类、三萜类、环烯醚萜及裂环烯醚萜为主。裂环环烯醚萜苷类化合物是一类具有保肝、降血糖、调血脂、抗炎、抗肿瘤和神经保护作用的天然活性分子。苦味素(bitter principles)是一类具有苦味化合物的统称，可以分为一贴类、倍半萜类、二萜类和三萜类，具有很多的药用价值；例如富含苦味素的地黄是滋阴药物，针对降低血糖和利尿的药理有一定的作用；栀子的果实中含有多种苦味成分，具有清热泻火的作用；龙胆科植物大多性寒味苦，因健脾消食的功效被认为是苦味健胃的植物药。獐牙菜苦苷属环烯醚萜类化合物，现代药理研究表明，獐牙菜苦苷具有保肝调、调血脂、抗糖尿病、镇痛镇静和抗炎等多种作用。含量占肋柱花总物质的30.98％左右，具有提取苦味素的价值。肋柱花苦味素的提取纯化是提高其附加值的重要途径。近年来肥胖症成为现代社会中最常见的营养障碍性疾病。发生的基本机理是食物摄入超过能量消耗。脂肪是生物体储能的主要形式与机体的代谢密切相关。脂肪组织包括了脂肪前体细胞和处于分化各阶段的脂肪细胞，而肥胖的产生是由于脂肪细胞的过度增殖与分化所导致。据文献报道，苦味受体tas2r38在人类脂肪细胞的rna和蛋白水平上均存在，肥胖者的脂肪组织中苦味受体的表达高于瘦人。苦味化合物可以支持体重控制通过几个机制涉及tas2rs表达在身体的不同部位这包括脂肪组织，肥胖与ⅱ型糖尿病、心血管系统疾病、高血压和癌症密切相关。
5.因此，研究调控前脂肪细胞增殖和分化机制对防治肥胖及相关疾病的发生和发展十分关键。减少体内脂肪合成或者加快其分解等便成了一项需要攻克的难题。国内外一直有不少学者致力于研究从植物原料中分离提取的化合物是否有调节血脂代谢及脂肪分化方面的作用。药物干预在防止脂肪细胞分化和刺激脂质吸收方面具有重要意义。研发一种安全、有效、无副作用的药物对抗击肥胖流行至关重要。因此以肋柱花为原材料，设计正交
试验乙醇浓度、提取用量、提取时间、提取次数四个主要因素，研究肋柱花獐牙菜苦苷的最佳提取工艺，用獐牙菜苷的含量作为判定苦味素提取率的指标，为解决肥胖及其代谢性疾病的发生提供新的思路。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供了一种治疗肥胖及其代谢性疾病药物的提取方法及应用。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.本发明涉及一种治疗肥胖及其代谢性疾病药物的提取方法，包括如下步骤：
9.步骤1，将肋柱花粉碎制成粉末，称取肋柱花药粉5g，加入50
‑
90％浓度乙醇回流提取，得浸膏并冷冻干燥；
10.步骤2，干燥粉末加甲醇溶解后，用0.45μl滤膜过滤，按照色谱条件进行分析鉴定，计算苦味素的百分含量。
11.优选地，步骤1中，所述回流提取中乙醇浓度为60％，料液比1：10，提取的时间为2.0小时，提取次数为1次。
12.本发明还涉及一种治疗肥胖及其代谢性疾病药物的应用，用于治疗肥胖及其代谢性疾病药物的制备。
13.本发明具有以下优点：
14.本发明以獐牙菜苦苷的含量为指标，结合单因素考察和正交试验，对影响蒙药肋柱花獐牙菜苦苷提取的因素和条件进行筛选，最终确定最优提取工艺参数，为进一步综合开发肋柱花药材奠定了基础。
附图说明
15.图1是肋柱花hplc色谱图；
16.图2是獐牙菜苦苷标准品hplc色谱图；
17.图3是獐牙菜苦苷标准曲线图；
18.图4是不同乙醇浓度对应獐牙菜苦苷含量对比图；
19.图5是不同提取溶剂量对应獐牙菜苦苷含量对比图；
20.图6是不同提取时间对应獐牙菜苦苷含量对比图；
21.图7是不同提取次数对应獐牙菜苦苷含量对比图。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
23.实施例1
24.1、本实施例主要仪器
25.(1)agilent 1260infinity ii液相色谱仪，
26.(2)sqp型十万分之一分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，
27.(3)kq
‑
800e型超声波清洗器，
28.(4)shz
‑
95b型循环水式多用真空泵，
29.(5)kdm型调温电热套。
30.2、主要药品与试剂
31.肋柱花批号肋柱花(2020.9.25)采集于锡林郭勒盟，经内蒙古民族大学蒙医药学院拉西那木吉拉教授鉴定为龙胆科肋柱花lomatogoniumrotatum(l.)fries ex nym的全草。獐牙菜苦苷标准品(批号b21644纯度≥98％)，购自原叶生物。甲醇，磷酸，无水乙醇为分析纯，水为纯净水。
32.本实施例涉及一种治疗肥胖及其代谢性疾病药物的提取方法，包括如下步骤：
33.步骤1，将肋柱花粉碎制成粉末，称取肋柱花药粉5g，加入50
‑
90％浓度乙醇回流提取，得浸膏并冷冻干燥；
34.步骤2，精密称取獐牙菜苦苷2.18mg置25ml量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀。超声波脱气10min后再通过0.45nm水系膜过滤，制成1ml含0.0872
㎎
，进样量为10μl，以獐牙菜苦苷质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
35.由图1、2、3可知，獐牙菜苦苷保留时间为6.775，得到回归方程：y＝641.66x+5.2603，结果表明，线性范围r2＝0.9997；精密度实验中rsd为0.26％，表明仪器的精密度良好；样品24小时内獐牙菜苦苷含量测定结果的rsd为0.002％，表明供试品溶液在24h内稳定；重复性实验中rsd为0.026％，表明重复性良好；加样回收率实验中rsd为0.084％。表明该法符合含量测定要求。
36.色谱条件：采用高效液相色谱法。色谱柱：zorbax sb
‑
c18(4.6
×
250mm)5
‑
micron；流动相：水－0.1％磷酸水溶液梯度洗0
→
70:30,15
→
65:35,25
→
50:50；流速：1.0ml
·
min
－1
；检测波长：254nm；柱温：30℃。
37.对比实验
38.肋柱花獐牙菜苦苷提取工艺中单因素实验
39.本实验以蒙药材肋柱花全草为材料，建立獐牙菜苦苷提取工艺优化方法。以此作为判定苦味素提取率的指标。药材阴凉处晾干粉碎后设计乙醇浓度
×
提取用量
×
提取时间
×
提取次数四个因素的正交实验，获得獐牙菜苦苷的最佳提取工艺，其数据见表1所示。
40.表1
[0041] abcd 乙醇浓度(％)料液比提取时间(h)提取次数(次)150％1：100.51260％1：201.02370％1：301.53480％1：402.04590％1：502.55
[0042]
(1)乙醇浓度的选择
[0043]
精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5g，乙醇用量20倍，提取次数3次，提取时间2.0h，分别设50％、60％、70％、80％、90％乙醇5个浓度进行提取，计算獐牙菜苦苷峰面积含量，结果如图4所示，獐牙菜苦苷含量在乙醇浓度为60％时达到峰值，故选择60％乙醇为提取溶剂。
[0044]
(2)提取次数的选择
[0045]
精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5g，乙醇用量20倍，提取浓度50％，提取时间2.0h，分别设1，2，3，4，5个次数进行提取，计算獐牙菜苦苷峰含量。如图5所示，獐牙菜苦苷含量在次数2时达到峰值，故选择2次。
[0046]
(3)提取时间的选择
[0047]
精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5g，乙醇用量20倍，提取浓度50％，提取次数为1次，分别设0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h等5个时间进行提取，计算獐牙菜苦苷含量。如图6所示，獐牙菜苦苷含量在时间2.0h时达到峰值，故选择2.0h为提取时间。
[0048]
(4)提取溶剂量的选择
[0049]
精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5g，提取时间为2.0h，提取浓度50％，提取次数为1次，分别设1：10、1：20、1：30、1：40、1：50的料液比进行提取，计算獐牙菜苦苷含量。如图7所示，獐牙菜苦苷含量在倍数1：10时达到峰值，故选:1：10倍量乙醇提取。
[0050]
正交实验及验证
[0051]
根据单因素实验结果，选择适宜的乙醇浓度，提取用量，提取时间，提取次数建表设计正交实验，见表2所示。
[0052]
表2
[0053]
试验编号abcd 乙醇浓度(％)料液比提取时间(h)提取次数(次)150％1：101.51260％1：202.02370％1：302.53
[0054]
正交实验结果
[0055]
正交实验方案及结果见表3，方差分析表见表4。结果表明，从r值和表4方差分析得知提取时间的影响最为显著。且提取最佳工艺为a2b1c2d1，即提取浓度60％，料液比1：10，提取时间2.0，提取次数1。
[0056]
表3
[0057][0058][0059]
表4
[0060]
因素偏差平方和自由度f比f临界值显著性提取浓度0.52221.2064.460*提取用量0.22220.5134.460
‑
提取时间0.97222.2454.460*提取次数0.01620.0374.460
‑
误差1.738
ꢀꢀꢀ
[0061]
本发明从单因素实验来看峰面积分别在60％乙醇，提取次数2次，提取时间2.0h，料液比1:10时到达顶峰，随着浓度，次数，时间，比重的增加峰面积呈现下降的趋势。按上述结果进行正交试验的结果为a2b1c2d1，由于药材成分复杂，增加了反应的复杂性和不可控性，故同一方法测定不同药材，甚至同一药材不同提取物中总环烯醚萜苷含量会存在差异。环烯醚萜类及其苷类性质不稳定，回流加热时间太长，对肋柱花化学成分有一定的影响。准确的测定提取物中的含量，以及筛选出正确专一的方法，还有待进一步的完善。
[0062]
本实验通过乙醇浓度，提取用量，提取时间，提取次数四个主要因素进行单因素实验分析并以回流提取法为基础，采用正交实验验证得到的最佳提取工艺为提取浓度60％乙醇，乙醇用量10倍，提取时间2.0h，提取次数为1次。
[0063]
因此本实验以獐牙菜苦苷的含量为指标，结合单因素考察和正交试验，对影响苦味蒙药肋柱花獐牙菜苦苷提取的因素和条件进行筛选，最终优化了提取工艺参数，为进一步综合开发肋柱花药材奠定了基础。
[0064]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。