一种治疗骨关节炎的药物及其应用

1.本发明属于医药领域，涉及黄芩素的一种新用途，具体涉及一种治疗骨关节炎的药物及其应用。


背景技术：

2.骨关节炎是一种常见的关节退化性疾病，导致关节疼痛、活动受限甚至关节功能丧失，从而降低患者生活质量。全球有超过2.4亿症状性骨关节炎患者，随着人口老龄化等问题的日益严峻，骨关节炎患病率将快速增加，其难治性和高致残性已成为重大健康问题。
3.目前，针对于骨关节炎的治疗非常有限，临床上主要依据患者的症状、病变部位和病情严重程度，采用保守与手术治疗相结合的治疗方法，以非甾体抗炎药缓解其疼痛和炎症症状，晚期通常需要关节置换手术治疗。但是这不能解决骨关节炎早期发病和关节置换术的局限性，包括非甾体类抗炎药常伴有的胃肠道等严重副作用，以及手术不良后果的可能性和假体的有限寿命。中国中西医结合学会骨伤科专业委员会，美国骨科医师学会(aaos)，国际骨关节炎研究协会(oarsi)均推荐保守方法治疗早、中期骨关节炎，药物治疗则适用于更广泛与更早期病变的骨关节炎的患者。近年来，大量学者研究表明中医药防治骨关节炎具有独特的优势并发挥了至关重要的作用，从天然来源寻求治疗骨关节炎的药物具有广阔与重要的应用价值。因此，对于骨关节炎机制的进一步研究，并寻找新的有效药物非常有必要。
4.在骨关节炎疾病进程中，关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉的结构等均会发生一系列改变，而其主要特征是关节软骨的逐渐破坏。关节软骨是关节重要组成部分，在关节活动中起着重要作用。其是一种特殊类型的透明组织，主要由软骨细胞和细胞外基质构成，且仅依赖于软骨细胞维持细胞外基质。在骨关节炎晚期，软骨变得低细胞化，被认为是软骨细胞死亡是骨关节炎进展的一个中心特征的证据。骨关节炎的发生发展与软骨细胞功能和生存的损伤将导致关节软骨出现病理改变有关。凋亡是一种高度调节的、活跃的细胞死亡过程，涉及发育、体内平衡和衰老。细胞凋亡失调导致病理状态，如癌症、发育异常和退行性疾病。大量研究表明，凋亡明显发生在骨关节炎软骨中，软骨细胞凋亡在骨关节炎的进展中起着关键作用，因此抑制软骨细胞凋亡可作为治疗骨关节炎的重要方法。
5.黄芩素是一种黄酮类化合物，是中药黄芩的主要有效成分之一，分子式为c
15h10
o5。黄芩素是从唇形科植物黄芩中提取出的天然黄酮类化合物，广泛存在于黄芩、半夏、牛膝等中药药物中，具有抗菌、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化等药理作用。已有文献表明，黄芩素能够通过调控nf-κb信号通路抑制il-1β诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡及基质降解。现有技术中，已有的关于黄芩素的发明涉及从黄芩中提取高纯度黄芩素的方法(专利申请号：cn201810123298.3)及黄芩素或其衍生物的制备方法与应用(专利申请号：cn201911069729.3)。但是黄芩素对骨关节炎的疗效以及机制尚无明确的文献和研究提及。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种治疗骨关节炎的药物及其应用；本发明为了对天然产物进行开发利用，结合实验，希望提供一种潜在的治疗骨关节炎的小分子化合物。
7.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明公开了一种治疗骨关节炎的药物，所述药物包含有黄芩素。
8.作为优选，所述黄芩素以小分子化合物的形式存在。
9.作为优选，所述药物包括黄芩素与药物学上可接受的药物辅料混合形成散剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂、肠溶缓释制剂或注射剂。
10.作为优选，所述药物包含有黄芩素，所述黄芩素在制备防治骨关节炎的药物或保健品中的用途。
11.作为优选，黄芩素起到缓解骨关节炎导致的软骨基质降解、关节软骨退变、骨赘形成、滑膜炎症的作用。
12.作为优选，黄芩素发挥的缓解骨关节炎进展的作用是通过其抑制软骨细胞凋亡实现的。
13.作为优选，黄芩素通过调控软骨细胞中bax、caspase3、bcl2蛋白的表达，从而抑制软骨细胞凋亡、缓解骨关节炎的进展。
14.作为优选，黄芩素抑制软骨细胞凋亡作用具体是指黄芩素通过减少软骨细胞中bax、caspase3的表达并增加bcl2的表达。
15.作为优选，黄芩素通过降低血清中il-1β、tnf-α等炎症因子的水平、抑制关节滑膜炎症，从而达到治疗骨关节炎的目的。
16.本发明借助网络药理学的方法筛选出黄芩素治疗骨关节炎的靶基因，并寻求黄芩素治疗骨关节炎的可能信号通路。
17.黄芩素是一种黄酮类化合物，分子式为c
15h10
o5，是从唇形科植物黄芩等植物中提取的有效成分。
18.黄芩素可以延缓骨关节炎的进程。黄芩素可延缓骨关节炎关节软骨退变、关节间隙狭窄、骨赘形成、慢性滑膜炎症、软骨下骨骨改建等，从而达到治疗骨关节炎的作用。
19.黄芩素增加软骨细胞外基质ⅱ型胶原的表达体现出对软骨退变的治疗作用，同时可抑制软骨下骨退变和关节滑膜增生，从而达到延缓骨关节炎进程的目的。
20.本发明技术方案中，黄芩素作为骨关节炎治疗药物，为主要有效成分制备的各种形式的药物或保健食品，可以用于预防和治疗骨关节炎。在使用时可以采取皮下、静脉注射或肛肠给药；注射液的使用可以任意选用生理盐水、葡萄糖、稳定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂等。
21.本发明随后进行了动物实验，建立c57bl小鼠膝骨关节炎模型。c57bl雄鼠8周，适应性饲养1周后，接受dmm手术诱导骨关节炎模型。分为假手术组、模型组和模型+黄芩素组，每组6只。模型组与黄芩素组用手术刀片在右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧带中间开0.5cm切口，显微镜下暴露并切断内侧半月板胫骨韧带，缝合切口，碘伏擦拭。假手术组在右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧带中间开0.5cm切口，暴露内侧半月板胫骨韧带，缝合切口，碘伏擦拭。按5mg/ml将黄芩素溶解于0.5％的羧甲基纤维素钠(cmc-na)制备成混悬液。黄芩素组每日予以0.1ml/10g灌胃，持续8周。经膝关节组织形态学观察，黄芩素可以减轻小鼠膝关节
关节软骨病理改变，且能减轻小鼠膝关节慢性滑膜炎症；micro-ct检测结果表明，黄芩素能减缓骨关节炎小鼠关节软骨下骨骨改建，减少骨赘的形成以及骨量流失；免疫组化显示黄芩素能增加ⅱ型胶原的表达；pcr与westernblot结果表明黄芩素可通过调控bax、bcl2、caspase3的表达来抑制软骨细胞凋亡；elisa结果显示黄芩素可降低血清中il-1β和tnf-α的浓度。因此，以黄芩素为主要有效成分制备的各种形式的药物或保健食品，为用于预防和治疗骨关节炎的潜在药物。
22.本发明的创新点在于：
23.1、本发明中运用网络药理学筛选黄芩素治疗骨关节炎的靶基因，并进行共同靶基因富集分析寻求黄芩素治疗骨关节炎的可能信号通路。
24.2、本发明中黄芩素具有缓解骨关节炎导致的关节软骨退变、关节间隙狭窄、骨赘形成、关节滑膜慢性炎症的作用。
25.3、本发明中黄芩素发挥的缓解骨关节炎进展的作用是通过其抑制软骨细胞凋亡实现的。
26.4、本发明中黄芩素小分子配体与细胞凋亡信号通路的bax、bcl2和caspase3蛋白受体进行分子对接均能良好结合。
27.5、本发明中黄芩素抑制软骨细胞凋亡作用具体是指黄芩素通过减少软骨细胞中bax、caspase3的表达并增加bcl2的表达。
28.6、本发明使用黄芩素作为一种新的能缓解骨关节炎症状的药物，强调黄芩素对于骨关节炎的治疗作用，阐述了黄芩素通过调控细胞凋亡的方式，减少软骨细胞中bax、caspase3的表达，并增加bcl2的表达，从而抑制骨关节炎软骨细胞凋亡，最终达到缓解骨关节炎导致的软骨退变、减少骨赘形成、关节间隙狭窄、滑膜炎症的治疗目的。
29.综上，本发明为骨关节炎的临床治疗提供了一种新的药物，同时阐述了此新型治疗药物的机制。为更好地理解骨关节炎的病理过程、以及今后对治疗骨关节炎药物的开发提供了思路与借鉴。
附图说明
30.为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见的，对于本领域技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1：黄芩素的结构简式。
32.图2：a是骨关节炎疾病相关基因venn图；b是黄芩素靶基因网络图；c-1是黄芩素与骨关节炎靶基因venn图；c-2是黄芩素与骨关节炎共同靶基因网络图。
33.图3：a是黄芩素治疗骨关节炎靶基因go分析气泡图；b是黄芩素治疗骨关节炎靶基因kegg信号通路富集分析气泡图；c是黄芩素通过调控细胞凋亡治疗骨关节炎的注释结果通路图。
34.图4：黄芩素与细胞凋亡信号通路中bcl2、bax、caspase3分子对接图。
35.图5：a是小鼠关节番红o-固绿染色结果图；b是关节软骨orasi评分柱状图；c是胫骨侧软骨面积柱状图；d是骨赘评分柱状图。
36.图6：a是小鼠关节滑膜he染色结果图；b是滑膜炎症评分柱状图。
37.图7：a是小鼠关节micro-ct三维重建结果图；b是micro-ct扫描层面图。
38.图8：a是小鼠关节骨量柱状图；b是小鼠关节骨体积分数柱状图；c是骨小梁厚度柱状图；d是骨小梁分离度柱状图；e是骨小梁数量柱状图。
39.图9：a小鼠关节软骨ⅱ型胶原、bax和bcl2免疫组化染色结果图；b是ⅱ型胶原面积柱状图；c是bax阳性率柱状图；d是bcl-2阳性率柱状图。
40.图10：a是动物关节软骨细胞中bax、bcl2、caspase3蛋白westernblot检测结果图；b、c、d是蛋白/内参灰度值柱状图。
41.图11：a、b、c分别是bax、bcl2、caspase3mrna柱状图。
42.图12：a是血清中il-1β柱状图；b是血清tnf-α柱状图。
具体实施方式
43.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护范围。
44.下面通过实施例对本发明作进一步详细描述。
45.实施例：一种治疗骨关节炎的药物，所述药物包含有黄芩素。
46.所述黄芩素以小分子化合物的形式存在。所述药物包括黄芩素与药物学上可接受的药物辅料混合形成散剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂、肠溶缓释制剂或注射剂。
47.所述药物包含有黄芩素，所述黄芩素在制备防治骨关节炎的药物或保健品中的用途。
48.黄芩素起到缓解骨关节炎导致的软骨基质降解、关节软骨退变、骨赘形成、滑膜炎症的作用。
49.黄芩素发挥的缓解骨关节炎进展的作用是通过其抑制软骨细胞凋亡实现的。
50.黄芩素通过调控软骨细胞中bax、caspase3、bcl2蛋白的表达，从而抑制软骨细胞凋亡、缓解骨关节炎的进展。
51.黄芩素抑制软骨细胞凋亡作用具体是指黄芩素通过减少软骨细胞中bax、caspase3的表达并增加bcl2的表达。
52.黄芩素通过降低血清中il-1β、tnf-α等炎症因子的水平、抑制关节滑膜炎症，从而达到治疗骨关节炎的目的。
53.检索tcmsp数据库得到黄芩素对应的靶点。通过genecards、omim、pharmgkb、ttd、drugbank数据库检索骨关节炎相关靶基因。筛选出黄芩素与骨关节炎的共同靶基因，并进行富集分析以寻求黄芩素治疗骨关节炎的可能信号通路。然后进行动物实验验证，建立c57bl小鼠膝骨关节炎模型，并将18只小鼠分为假手术组、模型组和模型+黄芩素组。黄芩素组每日黄芩素灌胃，持续8周。取小鼠血清和膝关节进行相关检测。使用番红o-固绿染色观察小鼠膝关节软骨；使用he染色观察小鼠膝关节滑膜；使用micro-ct观察小鼠软骨下骨；使用免疫组织化学染色观察关节软骨中ⅱ型胶原、bax、bcl-2的阳性率；使用westernblot检测关节软骨中bcl-2、bax、caspase3蛋白的表达；使用rt-qpcr检测关节软骨中bcl-2、bax、caspase3mrna的表达；使用elisa检测血清中il-1β和tnf-α的浓度。
54.黄芩素与骨关节炎共同靶点筛选：以“osteoarthritis”为关键词检索骨关节炎相关靶基因的关键词，通过genecards数据库、omim数据库、pharmgkb数据库、ttd数据库、drugbank数据库得到骨关节炎发病过程中相关靶基因。将五个数据库检索到的基因合并，得到venn图见图2中a。检索tcmsp数据库筛选黄芩素对应的靶点，使用uniprot数据库标准化基因名称，借助cytoscape3.8.0构建黄芩素靶点网络图见图2中b。将黄芩素的靶点和骨关节炎潜在治疗靶点合并取交集，得到venn图见图2中c-1，构建骨关节炎与黄芩素的共同靶基因网络图如图2中c-2。
55.黄芩素与骨关节炎共同靶点富集分析：将黄芩素治疗骨关节炎的潜在靶点做富集分析，以进一步了解得到的交集网络在基因功能和相关信号通路上的具体作用。运用r4.0.3对黄芩素治疗骨关节炎相关靶点进行信号通路与生物学过程、细胞组分和分子功能富集分析。结果显示：黄芩素主要参与的生物学过程包括对氧化应激的反应、转录调节因子复合物、泛素样蛋白连接酶结合等，见图3中a。并进行kegg通路富集分析，得到黄芩素在骨关节炎治疗中的主要作用通路，发现黄芩素治疗骨关节炎参与的通路主要有细胞凋亡、pi3k-akt通路等，见图3中b。细胞凋亡是黄芩素干预骨关节炎的重要通路，共有9个靶蛋白富集在此通路上，其中包括与凋亡密切相关的bcl-2、bax、casp3等蛋白，借助r4.0.3对黄芩素通过调控细胞凋亡通路结果注释进行可视化处理，见图3中c。
56.分子对接验证：为进一步了解黄芩素和所筛选体内受体靶点的结合模式和亲和力，进入pubchem数据平台，下载黄芩素的3d结构。利用rcsb数据平台下载bcl-2、bax、casp3蛋白的3dpdb格式文。将小分子配体与蛋白受体文件进行相应处理，利用vina软件进行分子对接并进行结合能预测。导入pymol2.4.1软件进行可视化处理见图4，发现均能良好结合。
57.实验验证：建立c57bl小鼠膝骨关节炎模型。8周龄c57bl雄鼠，适应性饲养1周后，接受dmm手术诱导骨关节炎模型。分为假手术组、模型组和模型+黄芩素组，每组6只。模型组与黄芩素组用手术刀片在右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧带中间开0.5cm切口，显微镜下暴露并切断内侧半月板胫骨韧带，缝合切口，碘伏擦拭。假手术组在右膝关节内侧髌韧带与内侧副韧带中间开0.5cm切口，暴露内侧半月板胫骨韧带，缝合切口，碘伏擦拭。将黄芩素溶解于0.5％的羧甲基纤维素钠(cmc-na)制备成混悬液。黄芩素组每日予以0.1ml/10g灌胃，持续8周后，取小鼠血清和膝关节进行相关检测。
58.关节软骨番红o-固绿染色：小鼠膝关节取材后，多聚甲醛固定48h，10％edta脱钙4周，组织脱水、石腊包埋、4um矢状位连续切片，常温保存备用。切片脱蜡至水(二甲苯i、ii各5min
→
无水乙醇2min
→
95％乙醇2min
→
85％乙醇2min
→
75％乙醇2min
→
水洗)
→
weigert染色5min
→
盐酸乙醇15s
→
水洗1min
→
固绿染色5min
→
水洗1min
→
safranino染色2min
→
水洗1min
→
乙酸溶液洗涤1min
→
水洗1min
→
脱水透明
→
中性树胶封片。通风橱中放置4h后显微镜下观察采片，见图5中a。观察黄芩素对骨关节炎模型小鼠关节软骨和骨赘形成的影响。
59.图5中b是依据oarsi(国际骨关节炎研究协会)制定的评分技术，对3组小鼠膝关节进行评分。结果显示，黄芩素干预的骨关节炎评分明显降低，说明黄芩素可以有效减少骨关节炎引起的关节软骨退变。oarsi评分标准如下表1。
60.表1 oarsi评分标准
[0061][0062]
将3组小鼠膝关节胫骨侧软骨面积进行统计，得到图5中c。结果显示，黄芩素处理的小鼠关节软骨面积较模型组明显升高，差异具有统计学意义，说明黄芩素可以有效减少骨关节炎引起的关节软骨丢失。
[0063]
图5中d是依据关节软骨骨赘评分技术，对3组小鼠膝关节骨赘形成进行的评分。结果显示，黄芩素处理的小鼠骨赘形成评分较模型组评分明显降低，具有显著性差异，说明黄芩素可以有效缓解骨关节炎引起的骨赘形成。骨赘评分标准如下表2。
[0064]
表2 骨赘评分标准
[0065][0066][0067]
小鼠关节滑膜he染色：切片脱蜡至水(二甲苯i、ii、iii各5min
→
无水乙醇2min
→
95％乙醇2min
→
85％乙醇2min
→
75％乙醇2min
→
水洗)
→
苏木素染色10min
→
0.5％盐酸酒精分色10s
→
水洗15min
→
0.5％伊红染色3min
→
脱水透明
→
中性树胶封片。通风橱中放置4h后显微镜下观察采片，如图6中a，观察小鼠滑膜炎症情况并进行滑膜炎评分。发现假手术组小鼠膝关节关节滑膜正常，无明显病理表现；模型组小鼠膝关节出现关节滑膜明显增生、炎性细胞浸润等病理表现；黄芩素组小鼠膝关节滑膜病理改变明显小于模型组。
[0068]
图6中b是3组小鼠膝关节滑膜炎症评分。结果显示，黄芩素处理的小鼠慢性滑膜炎评分较模型组评分明显降低，具有显著性差异，说明黄芩素可以有效缓解骨关节炎引起的
慢性滑膜炎症。慢性滑膜炎评分方案如下表3。
[0069]
表3 慢性滑膜炎评分方案
[0070][0071]
总分：0-1无滑膜炎；2-4轻度滑膜炎；5-9高度滑膜炎
[0072]
小鼠关节micro-ct检测：小鼠膝关节取材后，多聚甲醛固定后进行micro-ct扫描，见图8中b显示了黄芩素对骨关节炎模型小鼠关节软骨下骨骨改建的影响，可以观察到黄芩素组软骨下骨骨量流失较模型组对比有明显改善。将图像进行三维重建，见图8中a，分别为小鼠膝关节正面观、侧面观和后面观。显示了黄芩素对骨关节炎模型小鼠的骨赘形成与关节间隙的影响，可以观察到黄芩素组关节间隙狭窄与骨赘形成与模型组对比均有明显改善。说明黄芩素在骨关节炎的治疗方面具有改善关节间隙狭窄、骨赘形成的作用。
[0073]
图9中a是小鼠膝关节骨量柱状图，可见黄芩素处理的小鼠骨量较模型组明显升高；图9中b是小鼠膝关节骨体积分数柱状图，黄芩素处理的小鼠骨体积分数较模型组明显升高；图9中c是小鼠膝关节骨小梁厚度柱状图，黄芩素处理的小鼠骨小梁厚度较模型组明显升高；图9中d是小鼠膝关节骨小梁分离度柱状图，黄芩素处理的小鼠骨小梁分离度较模型组明显降低；图9中e是小鼠膝关节骨小梁数量柱状图，黄芩素处理的小鼠骨小梁数量较模型组明显升高。由此可见黄芩素可以有效缓解骨关节炎引起的骨量流失与骨改建。
[0074]
关节软骨免疫组化染色：切片脱蜡至水
→
3％h2o2灭活内源性过氧化物酶20min
→
胰酶修复15min，37℃
→
4％bsa室温封闭30min
→
一抗4℃孵育过夜
→
二抗孵育3h
→
pbs洗
×3→
滴加sab复合物40min
→
pbs洗
×3→
dab显色
→
水洗
×3→
苏木素复染，90s
→
盐酸乙醇分化15s
→
氨水返蓝30s
→
75％乙醇2min
→
85％乙醇2min
→
95％乙醇2min
→
无水乙醇2min
→
二甲苯i、ii、iii各5min
→
中性树胶封片。通风橱中放置4h后显微镜下观察采片，见图10。通过ii型胶原免疫组化染色发现，模型组小鼠膝关节关节软骨严重缺损，ii型胶原含量明显
减少；而经黄芩素处理的小鼠膝关节关节软骨ii型胶原含量明显多于模型组。bax和bcl2免疫组化染色发现，经黄芩素处理的小鼠膝关节关节软骨bax阳性率明显少于模型组，bcl2阳性率明显多于模型组。
[0075]
如图11中a所示，ii型胶原免疫组化染色发现阳性面积数据统计三组间具有明显差异，差异具有统计学意义。bax和bcl2免疫组化染色的阳性率数据统计三组间具有明显差异，差异具有统计学意义，见图11中b和c。
[0076]
小鼠关节软骨westernblot检测：蛋白提取：组织称重，切成小块放入放入管中，加入预冷的蛋白抽提试剂，用匀浆机30秒/次低速匀浆，每次匀浆冰浴间隔1min，至组织完全裂解；裂解液于预冷的离心机中14000r/m离心15min，4℃，上清液立即转移至新的离心管中，bca法测蛋白浓度。蛋白定量，加入5
×
上样buffer，金属浴100℃变性15min。电泳：配制分离胶、浓缩胶
→
加入500ml电泳液
→
上样25ul
→
上部胶80v，30min，待样品至浓缩胶与分离胶交界处时，转为100v至样品完成电泳
→
转膜：pvdf膜甲醇浸5min，将胶、膜置入转膜液中，90v，70min，同时加冰散热。孵育显色：5％bsa封闭1h
→
一抗摇床孵育过夜，4℃洗膜5min
×3→
二抗室温孵育1h
→
洗膜5min
×3→
显色。观察bcl2、bax、caspase3蛋白的表达水平。结果如图10中a所示，黄芩素组bax、caspase3蛋白表达较模型组低，而bcl2蛋白表达较模型组高。
[0077]
图10中b、c、d是蛋白/内参灰度值统计柱状图，三组间bax、caspase3、bcl2蛋白表达具有明显差异，差异具有统计学意义。说明黄芩素能够抑制关节软骨细胞凋亡，从而延缓骨关节炎的进程。
[0078]
小鼠关节软骨rt-qpcr检测：称取约0.02g的组织，加入1mltrizol于匀浆器中充分研磨匀浆，混匀后室裂解5min；加入200ul三氯甲烷，剧烈振荡15s，室温静置3min；12000rpm，4℃，离心15min。取上层液相，转移到新的rnase-free离心管中；加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；12000rpm，4℃，离心10min，去上清，加入1ml75％乙醇(无菌depc处理水配制)洗涤沉淀；12000rpm，4℃，离心3min，去上清；空气干燥5～10min。加入20～30ul无菌无酶水溶解沉淀；紫外分光光度计测定浓度。反转录20ul体系(水+rna样品13ul，primersriptbuffer4ul，primersriptrtenzyme1ul，oligodtprimer1ul，radom6mers1ul)，37℃，15min
→
85℃，5sec
→
4℃保存。所得cdna样品稀释5倍后备用。pcr反应体系20ul：sybr10ul，水7μl，cdna1ul，前后引物各1ul；95℃，5min
→
95℃，30s
→
58℃，30s
→
72℃，40s，30个循环，72℃，7min，4℃保存。结果见图11中a、b、c，是bax、bcl2、caspase3mrna表达统计柱状图，三组间差异具有统计学意义。
[0079]
小鼠血清elisa检测：标准孔每孔加浓度梯度标准样品100ul，样品孔加检测缓冲液80ul和20ul血清。振荡、室温孵育，洗涤，每孔加100ul稀释的hrp标记的链-青霉素。振荡、室温孵育，洗涤，加入显示底物，避光室温再次孵育，加入终止液，酶标仪测定。实验结果如图7。可见黄芩素处理的小鼠血清中il-1β、tnf-α浓度较模型组明显降低，表明黄芩素能够降低炎症因子水平。
[0080]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。