一种由细胞蛋白包裹的黑磷及其制备方法

1.本发明属于纳米材料表面改性和修饰技术，涉及一种由细胞蛋白包裹的黑磷及其制备方法，属于生物医学工程领域，可用于生物材料的表面改性。可赋予植入体抗氧化性能、靶向性和高生物活性，促进相应的部位修复。


背景技术：

2.多功能二维(2d)材料已被探索和用于在生物医学的各个领域中，其中从黑磷(bp)块体材料中分离出来具有二维结构的黑磷纳米片(bp
s
)就是这一种新兴的二维材料。在单层bp中，每个磷原子与三个相邻的磷原子共价键合，从而形成沿之字形方向的双层结构和沿扶手椅方向的褶皱结构。这种结构的各向异性使其具有特殊的性质，包括光学性质、机械性质、导电性、热电性质和拓扑特征，使其有别于其他材料，因为其具有较大的比表面积、较好的光热性能、良好的生物相容性并且对癌细胞有着选择性毒性等优点，让其在光热治疗、光动力治疗、生物成像以及药物释放等肿瘤治疗中的理想材料。但由于结构中的孤对电子的存在，使得bp纳米片具有很高的化学反应活性，从另一个层面说具有化学不稳定性，在水、氧和光中容易被氧化，逐渐转化为磷酸根，这是其实际应用的障碍。且有研究发现bp纳米片的降解速率与其层数成反比关系，其层数越少，降解速率越快。
3.基于此针对黑磷的氧化，需要许多策略来提高黑磷的稳定性。例如表面包覆、共价官能化、金属离子修饰、离子液体辅助表面钝化和掺杂。包覆是一种物理方法，包覆一般选用无机物（氮化硼、石墨烯、al2o3）和有机高分子材料等具有代表性的涂层材料。但这些包覆会降低黑磷纳米片的生物活性（近红外、杀菌等性能）和必要的降解性，甚至会影响到黑磷在肿瘤治疗和组织修复时的性能。因此开发一种在减缓黑磷纳米片降解速度的同时，还不会影响其在肿瘤治疗和组织修复中的性能的方法是非常有必要的。
4.目前，除上述无机物和聚合物包覆黑磷表面之外，还有用红细胞膜和血小板膜包被黑磷纳米片和量子点的研究，主要是其应用领域不同。


技术实现要素：

5.为了使黑磷在降低氧化速率的同时，还兼备近红外发热、靶向宿主细胞功能以及促进正常细胞分化等，将剥离好的黑磷纳米片和黑磷量子点分别与多种细胞的总蛋白进行复合覆盖于黑磷表面，在保留黑磷的优良性质同时更有利于提高黑磷稳定性。细胞总蛋白种类多，且具有多种天然生物活性，此外，与裸露的黑磷纳米片相比，细胞蛋白中的亲水性多糖有助于细胞蛋白包裹黑磷的稳定作用，从而提高其胶体稳定性；直接超声和物理挤压即可将细胞蛋白与黑磷简单巧妙地结合起来，无需复杂的化学反应和工艺方法即可赋予黑磷新的性质，还提高了细胞蛋白包裹黑磷的多功能和多任务处理能力，使其更适应生物系统的复杂性，促进黑磷在生物医学领域应用。
6.本发明在温和的条件下，通过安全简单的方法在黑磷纳米片和黑磷量子点表面制得了同时具有抗氧化性能和生物活性的细胞蛋白涂层。
7.一种由细胞蛋白包裹的黑磷，其特征是：所述黑磷包括黑磷纳米片和黑磷量子点，黑磷纳米片的粒径是50
‑
300 nm，细胞蛋白包裹之后黑磷的粒径是30
‑
200 nm；黑磷量子点粒径分布为4
‑
20 nm，细胞蛋白包裹之后的黑磷量子点粒径分布为5
‑
30 nm；所述细胞包括人骨肉瘤mg63、小鼠胚胎成骨细胞前体细胞mc3t3
‑
e1、人子宫颈癌hela、人卵巢癌sk
‑
ov
‑
3以及人肝癌细胞huh
‑
7。
8.一种由细胞蛋白包裹的黑磷的制备方法，包括以下步骤：1、 黑磷纳米片和黑磷量子点的制备：取30 mg块状黑磷晶体，在滴加有n,n
‑
二甲基甲酰胺（dmf）的玛瑙研钵中研磨成黑磷粉末，然后将黑磷粉末置于20ml n,n
‑
二甲基甲酰胺中，使用超声波细胞破碎仪探头（上海比朗仪器制造有限公司，型号为bilon
‑
r1200, 变幅杆标配为10 mm, 最大功率为1000 w）冰浴超声10 h，得到黑磷纳米片分散液；将分散液以4000 rpm的转速离心15 min，去除过大的产物，再将上清液以13000 rpm的转速离心20 min，并将得到的沉淀物用异丙醇和除氧水进行洗涤2
‑
3次，冷冻干燥得到黑磷纳米片；再将上清液以50000 rpm的转速离心4小时沉淀得到黑磷量子点；2、细胞蛋白的制备：用细胞培养基dmem培养细胞（人骨肉瘤mg63、小鼠胚胎成骨细胞前体细胞mc3t3
‑
e1、人子宫颈癌hela、人卵巢癌sk
‑
ov
‑
3以及人肝癌细胞huh
‑
7）至80 %，去掉细胞上清液，浓度为1
×
的磷酸盐缓冲液（pbs）洗涤后加入10ml 浓度为0.05mol/l的tris
‑
hcl（即三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）缓冲液，通过反复冻融法裂解细胞（
‑
20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3次），接着在4 ℃下以2000g离心20min提取上清液去除细胞和死细胞；在4 ℃下以20000 g离心提取上清液去除细胞碎片，使用0.22 μm过滤器过滤上清液得到细胞蛋白溶液；3、细胞蛋白包裹黑磷：将浓度为0.05
‑
0.5mg/ml黑磷纳米片或黑磷量子点分散液以及浓度为1.5 mg/ml的蛋白溶液混合后超声5 min；使用一次性无菌注射器和孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤器进行过滤挤出，此过程在三通道推进器上匀速进行，反复挤出 4~5 次；高速离心收集挤出后溶液中的纳米粒子，重悬于少量1
×
磷酸盐缓冲液（pbs）或5wt%蔗糖溶液中，
‑
80 ℃冻存。
9.步骤1中为得到纯净的黑磷纳米片，需要洗涤和分离操作。采用的方法很多，在本发明中优选为梯度离心法，制备黑磷纳米片时离心速度优选为12000
‑
14000 rpm，离心时间优选为15
‑
30分钟，离心次数为5次。
10.如制黑磷量子点，离心速度优选为50000 rpm，离心时间优选为4 小时，离心次数为3次。
11.用于洗涤沉淀的试剂为异丙醇和除氧水，洗涤次数为5次，前三次为异丙醇洗涤，后两次为除氧水洗涤。分离纯化后的黑磷纳米片或者量子点储存在通有氩气的手套箱或真空干燥器内。
12.步骤3所述的细胞蛋白包裹黑磷中，所述黑磷的浓度为0.05
‑
0.5mg/ml，优选为0.1
‑
0.3 mg/ml。所述黑磷纳米片过低得到的细胞蛋白包裹的黑磷纳米片浓度过低，浓度过高则会出现一部分黑磷纳米片没有包覆上细胞蛋白，影响后续的结果。
13.本发明黑磷表面形成的蛋白涂层包覆完好，形貌规整。
14.本发明在温和的条件下，通过安全简单的方法在黑磷纳米片和黑磷量子点表面制得了同时具有抗氧化性能和生物活性的细胞蛋白涂层。
15.本发明先是根据超声和物理挤压方式制备得到表面修饰有细胞蛋白的黑磷纳米片或者黑磷量子点。由于黑磷纳米片表面修饰有细胞蛋白，且肿瘤细胞的细胞蛋白被证明具有靶向肿瘤细胞性质，因此在提高黑磷纳米片的生物相容性以及抗氧化能力的同时也赋予了黑磷纳米片靶向肿瘤细胞的性质。成骨细胞的蛋白证明其具有一定的归巢能力，且赋予黑磷更多的骨结合性和骨诱导性能。
16.本发明成本低，制备工艺简单，可实现安全、高效的生产。本发明为防止黑磷氧化、赋予黑磷目的细胞靶向性以及促进黑磷在植入环境中热疗以及光动力治疗领域方面具有广泛的应用价值。
附图说明
17.图1是细胞蛋白包裹的黑磷纳米片的sem图。
具体实施方式
18.实施例1取30 mg块状黑磷晶体（实验室自制）在滴加有n,n
‑
二甲基甲酰胺（dmf）的玛瑙研钵中研磨成黑磷粉末，然后将上述粉末置于20ml dmf中，使用超声波细胞破碎仪探头冰浴超声10 h，得到黑磷纳米片分散液。
19.将分散液以4000 rpm的转速离心15 min，去除过大的产物，再将上清液以13000 rpm的转速离心20 min，并将得到的沉淀用异丙醇和除氧水进行洗涤2
‑
3次，冷冻干燥得样品得到黑磷纳米片；再将上清液以50000 rpm的转速离心4小时得到沉淀为黑磷量子点。采用梯度离心法提取外泌体。
20.用dmem完全培养基培养人骨肉瘤细胞mg63至80 %，去掉细胞上清液，pbs洗涤后加入10ml 浓度为0.05mol/l的tris
‑
hcl缓冲液，通过反复冻融法裂解细胞（
‑
20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3次），接着在4 ℃下以2000 g离心20min提取上清液去除细胞和死细胞。在4 ℃下以20,000 g离心提取上清液去除细胞碎片，使用0.22 μm过滤器过滤上清液得到细胞蛋白溶液。
21.将浓度为0.05
‑
0.3mg/ml黑磷纳米片或黑磷量子点分散液以及浓度为1.5 mg/ml的蛋白溶液混合后超声5 min；使用一次性无菌注射器和孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤器进行过滤挤出，此过程在三通道推进器上匀速进行，反复挤出 4~5 次；高速离心收集挤出后溶液中的纳米粒子，重悬于少量磷酸盐缓冲液pbs或5wt%蔗糖溶液中，
‑
80 ℃冻存。
22.实施例2取40 mg块状黑磷晶体（实验室自制）在滴加有n,n
‑
二甲基甲酰胺（dmf）的玛瑙研钵中研磨成黑磷粉末，然后将上述粉末置于20ml dmf中，使用超声波细胞破碎仪探头冰浴超声10 h，得到黑磷纳米片分散液。将分散液以4000 rpm的转速离心15 min，去除过大的产物，再将上清液以13000 rpm的转速离心20 min，并将得到的沉淀用异丙醇和除氧水进行洗涤2
‑
3次，冷冻干燥得样品得到黑磷纳米片；再将上清液以50000 rpm的转速离心4小时得到沉淀为黑磷量子点。采用梯度离心法提取外泌体。用dmem完全培养基培养小鼠胚胎成骨细胞前体细胞mc3t3
‑
e1至80 %，去掉细胞上清液，pbs洗涤后加入10ml 浓度为0.05mol/l的tris
‑
hcl缓冲液，通过反复冻融法裂解细胞（
‑
20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3
次），接着在4 ℃下以2000 g离心20min提取上清液去除细胞和死细胞。在4 ℃下以20,000 g离心提取上清液去除细胞碎片，使用0.22 μm过滤器过滤上清液得到细胞蛋白溶液。准备一定浓度的黑磷纳米片或者黑磷量子点分散液以及高于黑磷纳米片分散液浓度的蛋白溶液，二者混合后超声5 min；使用一次性无菌注射器和孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤器进行过滤挤出，此过程在三通道推进器上匀速进行，反复挤出 4~5 次；高速离心收集挤出后溶液中的纳米粒子，重悬于少量pbs或5wt%蔗糖溶液中，
‑
80 ℃冻存。
23.实施例3取40 mg块状黑磷晶体（实验室自制）在滴加有n,n
‑
二甲基甲酰胺（dmf）的玛瑙研钵中研磨成黑磷粉末，然后将上述粉末置于20ml dmf中，使用超声波细胞破碎仪探头冰浴超声10 h，得到黑磷纳米片分散液。将分散液以4000 rpm的转速离心15 min，去除过大的产物，再将上清液以13000 rpm的转速离心20 min，并将得到的沉淀用异丙醇和除氧水进行洗涤2
‑
3次，冷冻干燥得样品得到黑磷纳米片；再将上清液以50000 rpm的转速离心4小时得到沉淀为黑磷量子点。采用梯度离心法提取外泌体。用dmem完全培养基培养人子宫颈癌细胞hela至80 %，去掉细胞上清液，pbs洗涤后加入10ml 浓度为0.05mol/l的tris
‑
hcl缓冲液，通过反复冻融法裂解细胞（
‑
20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3次），接着在4 ℃下以2000 g离心20min提取上清液去除细胞和死细胞。在4 ℃下以20,000 g离心提取上清液去除细胞碎片，使用0.22 μm过滤器过滤上清液得到细胞蛋白溶液。将浓度为0.05
‑
0.1mg/ml黑磷纳米片或黑磷量子点分散液以及浓度为1.5 mg/ml的蛋白溶液混合后超声5 min；使用一次性无菌注射器和孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤器进行过滤挤出，此过程在三通道推进器上匀速进行，反复挤出 4~5 次；高速离心收集挤出后溶液中的纳米粒子，重悬于少量pbs或5wt%蔗糖溶液中，
‑
80 ℃冻存。
24.实施例4取20 mg块状黑磷晶体（实验室自制）在滴加有n,n
‑
二甲基甲酰胺（dmf）的玛瑙研钵中研磨成黑磷粉末，然后将上述粉末置于20ml dmf中，使用超声波细胞破碎仪探头冰浴超声10 h，得到黑磷纳米片分散液。将分散液以4000 rpm的转速离心15 min，去除过大的产物，再将上清液以13000 rpm的转速离心20 min，并将得到的沉淀用异丙醇和除氧水进行洗涤2
‑
3次，冷冻干燥得样品得到黑磷纳米片；再将上清液以50000 rpm的转速离心4小时得到沉淀为黑磷量子点。采用梯度离心法提取外泌体。用dmem完全培养基培养人卵巢癌sk
‑
ov
‑
3至80 %，去掉细胞上清液，pbs洗涤后加入10ml 浓度为0.05mol/l的tris
‑
hcl缓冲液，通过反复冻融法裂解细胞（
‑
20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3次），接着在4 ℃下以2000 g离心20min提取上清液去除细胞和死细胞。在4 ℃下以20,000 g离心提取上清液去除细胞碎片，使用0.22 μm过滤器过滤上清液得到细胞蛋白溶液。将浓度为0.05
‑
0.3mg/ml黑磷纳米片或黑磷量子点分散液以及浓度为1.5 mg/ml的蛋白溶液混合后超声5 min；使用一次性无菌注射器和孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤器进行过滤挤出，此过程在三通道推进器上匀速进行，反复挤出 4~5 次；高速离心收集挤出后溶液中的纳米粒子，重悬于少量pbs或5wt%蔗糖溶液中，
‑
80 ℃冻存。
25.实施例5取20 mg块状黑磷晶体（实验室自制）在滴加有n,n
‑
二甲基甲酰胺（dmf）的玛瑙研钵中研磨成黑磷粉末，然后将上述粉末置于20ml dmf中，使用超声波细胞破碎仪探头冰浴
超声10 h，得到黑磷纳米片分散液。将分散液以4000 rpm的转速离心15 min，去除过大的产物，再将上清液以13000 rpm的转速离心20 min，并将得到的沉淀用异丙醇和除氧水进行洗涤2
‑
3次，冷冻干燥得样品得到黑磷纳米片；再将上清液以50000 rpm的转速离心4小时得到沉淀为黑磷量子点。采用梯度离心法提取外泌体。用dmem完全培养基培养huh
‑
7至80 %，去掉细胞上清液，pbs洗涤后加入10ml 浓度为0.05mol/l的tris
‑
hcl缓冲液，通过反复冻融法裂解细胞（
‑
20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3次），接着在4 ℃下以2000 g离心20min提取上清液去除细胞和死细胞。在4 ℃下以20,000 g离心提取上清液去除细胞碎片，使用0.22 μm过滤器过滤上清液得到细胞蛋白溶液。将浓度为0.05
‑
0.4mg/ml黑磷纳米片或黑磷量子点分散液以及浓度为1.5 mg/ml的蛋白溶液混合后超声5 min使用一次性无菌注射器和孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤器进行过滤挤出，此过程在三通道推进器上匀速进行，反复挤出 4~5 次；高速离心收集挤出后溶液中的纳米粒子，重悬于少量pbs或5wt%蔗糖溶液中，
‑
80 ℃冻存。