一种a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法
技术领域
1.本技术涉及疫苗结合物的技术领域，更具体地说，它涉及一种a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法。
背景技术：
2.流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏球菌(n.meninyitidis)引起的脑膜发炎的疫症，现引起人体病变的菌株分型主要有a群、b群、c群、y群及w135群，在我国90%以上的流脑病例是由a群脑膜炎奈瑟氏菌引起的。
3.疫苗是预防和控制脑膜炎球菌感染的有效途径，a群脑膜炎球菌结合疫苗是提取a群菌株脑膜炎球菌的细菌外荚膜多糖，将荚膜多糖与特定的蛋白或多肽进行偶联，制成多糖结合物，再制剂成疫苗，用于预防该菌株脑膜炎球菌的侵袭感染。
4.现有的a群脑膜炎球菌结合疫苗在制备时，需要先将荚膜多糖制成多糖衍生物，再将该多糖衍生物在交联剂介导下与载体蛋白偶联形成结合物，再对结合物依次进行超滤和纯化，以获得质量符合国家标准的多糖结合物。由此，a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的整个制备工序繁琐、耗时较长，进而使得a群脑膜炎球菌结合疫苗的生产周期较长。
技术实现要素：
5.为了缩短a群脑膜炎球菌结合疫苗的生产周期，本技术提供一种a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法，其通过对工艺参数的优化，使结合物在省去纯化工序后仍能获得质量符合国家标准的多糖结合物，进而简化了多糖结合物的制备工序，缩短了多糖结合物的制备周期。
6.本技术采用如下的技术方案：一种a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法，包括以下步骤：
①
、多糖衍生物的制备：将a群脑膜炎球菌荚膜多糖用生理盐水溶解为多糖溶液a，用氢氧化钠溶液调节多糖溶液a的ph为10.5
±
0.2，加入活化剂进行活化，获得多糖溶液b，向多糖溶液b中加入己二酰肼进行衍生，衍生反应的ph保持在9.0
±
0.2，获得多糖溶液c，于2
‑
8℃的温度下低温搅拌6
‑
20h，经超滤后获得多糖衍生物原液；
②
、混合配比：温度控制在4
‑
8℃的条件下，将步骤
①
获得的多糖衍生物原液用生理盐水和盐酸溶液配制成ph为6.0
±
0.3的衍生物溶液，且衍生物溶液中多糖衍生物的浓度为0.5
‑
5.0mg/ml，加入白喉crm197蛋白后搅拌混合，其中多糖衍生物与白喉crm197蛋白的重量比为1:(0.8
‑
2.5），获得平衡溶液；
③
、结合反应：温度控制在4
‑
8℃的条件下，向步骤
②
获得的平衡溶液中加入碳二亚胺进行结合反应，获得初反应物；
④
、时效处理：将步骤
③
获得的初反应物置于2
‑
8℃的无菌环境中，静置16
‑
20小时进行时效处理，获得时效反应物；
⑤
、超滤：将步骤
④
获得的时效反应物进行超滤，除去结合反应过程中多余的残留
试剂，获得结合物浓缩液；
⑥
、除菌：用除菌滤膜对步骤
⑤
获得的结合物浓缩液进行除菌过滤，获得a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物原液。
7.通过采用上述技术方案，本技术使用生理盐水（氯化钠浓度为0.154mol/l）溶解a群脑膜炎球菌荚膜多糖（下文简称为a群多糖），其能有效溶解分子量为50
‑
100kda的a群多糖；在溴化氢活化a群多糖过程中，本技术省去了ph调节的工序，但其对a群多糖的活化效果影响较小；在己二酰肼衍生a群多糖时，本技术设定衍生反应的ph保持在9.5
±
0.2，此时上述活化的a群多糖能快速有效地进行衍生，由此获得的多糖衍生物具有更好的活性以便于与白喉crm197蛋白结合。
8.在此基础上，本技术步骤
①
制得的多糖衍生物用生理盐水和盐酸溶液配制为衍生物溶液，该生理盐水能保证衍生物溶液均一稳定，随后调整多糖衍生物的反应浓度以及与白喉crm197蛋白的重量比，由此保证结合反应有效进行，其制得的结合物经超滤后，多糖收率可达85%及以上，蛋白收率可达90%及以上，且其他质量要求也符合国家标准。
9.由此，本技术的制备方法，其通过对各工艺参数的优化省去了活化过程中的ph调节以及结合物的纯化工序，但收获的多糖结合物的质量仍符合国家标准，由此简化了多糖结合物的制备工序，缩短了多糖结合物的制备周期。
10.优选的，在步骤
①
中，所述生理盐水预热至30
±
2℃后对a群脑膜炎球菌荚膜多糖进行溶解。
11.通过采用上述技术方案，预热后的生理盐水促使a群多糖快速溶解，进而能缩短多糖的溶解时间。
12.优选的，在步骤
①
中，所述多糖溶液a经离心后取上清液进行ph调节。
13.通过采用上述技术方案，离心操作能将多糖溶液a中少量未溶解的a群多糖以及其他杂质去除，由此收获纯度更高、性能更加稳定多糖结合物。
14.优选的，在步骤
①
中，所述活化的温度为25
±
2℃。
15.通过采用上述技术方案，若温度过高，溴化氢对a群多糖的活化速度过快，容易使a群多糖的活化不够彻底；若温度过低，溴化氢对a群多糖的活化速率较缓，因此本技术优选25
±
2℃的活化温度，有助于溴化氢对a群多糖进行有效活化。
16.优选的，步骤
①
中，所述多糖溶液c经搅拌后用生理盐水进行超滤。
17.通过采用上述技术方案，溶解a群多糖和超滤使用的溶剂保持一致，能避免反应体系中掺入其他溶剂，由此保证反应过程简单可控。
18.优选的，在步骤
①
中，所述活化剂为溴化氢溶液，所述a群脑膜炎球菌荚膜多糖与所述溴化氢溶液中的溴化氢的重量比为1:（1.2
‑
1.8）。
19.通过采用上述技术方案，溴化氢对a群多糖具有良好的活化效果，在活化完成后还能快速挥发去除，减少其对a群多糖后续衍生反应的干扰，在此基础上，本技术添加适当过量的溴化氢，有助于a群多糖尽可能多的被活化。
20.优选的，在步骤
①
中，所述活化剂为碳二亚胺，所述碳二亚胺添加至其浓度为0.01
‑
0.2mol/l。
21.通过采用上述技术方案，该浓度下的碳二亚胺能活化羧基，促使酰胺和酯的生成，进而对a群多糖进行活化；待a群多糖活化完成后，该碳二亚胺还能与己二酰肼共同作用参
与a群多糖的衍生反应，提高a群多糖的衍生效果。
22.优选的，在步骤
①
中，所述a群脑膜炎球菌荚膜多糖与所述己二酰肼的重量比为1:（2
‑
5）。
23.通过采用上述技术方案，该重量比的己二酰肼能有效促使a群多糖进行衍生，其用量过少容易导致a群多糖的衍生不够彻底，若其用量过多则会造成试剂的浪费，本技术优选1:（2
‑
5），此时多糖衍生物的衍生率较高。
24.优选的，在步骤
③
中，所述初反应物中碳二亚胺的浓度为10
‑
100mmol/l。
25.通过采用上述技术方案，该浓度的碳二亚胺能有效促使a群多糖与白喉crm197蛋白进行结合反应，由此获得的多糖结合物具有更高的多糖收率和蛋白收率，因此将其作为进一步优选。
26.优选的，在步骤
③
中，所述平衡溶液中还加入有海藻糖，海藻糖添加至其浓度为1
‑
5mmol/l。
27.通过采用上述技术方案，本技术在平衡溶液中加入适量的海藻糖，其对a群多糖与白喉crm197蛋白结合的影响可以忽略不计，此外其还能在一定程度上增加多糖结合物的稳定性，由此获得多糖收率和蛋白收率更高的多糖结合物。
28.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、本技术通过对各工艺参数的优化省去了活化过程中的ph调节以及结合物的纯化工序，但收获的多糖结合物的质量仍符合国家标准，由此简化了多糖结合物的制备工序，缩短了多糖结合物的制备周期。
29.2、本技术在平衡溶液中加入适量的海藻糖，能在一定程度上增加多糖结合物的稳定性，由此获得多糖收率和蛋白收率更高的多糖结合物。
具体实施方式
30.以下结合实施例和对比例对本技术作进一步详细说明。
31.原料和/或中间体的制备例a群脑膜炎球菌荚膜多糖的提取a群脑膜炎球菌的菌种购自菌种库，经传代培养6代后，收获含a群脑膜炎球菌的培养液。取1l上述培养液用甲醛杀菌，以确保杀菌安全并不损伤菌体多糖为宜。将已杀菌的培养液离心去菌体，收集上清液，用50
‑
100kd截留分子量的超滤膜浓缩已收获的上清液至原体积的1/8，加入十六烷基三甲基溴化铵混匀，室温搅拌60min，4℃静置8h，15000r/min高速离心收集沉淀物，沉淀物中加入氯化钙溶液，终浓度为1mol/l，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，过滤除去不溶物，加入乙醇至最终浓度为30％(v/v)。4℃静置3h以上，离心去除核酸沉淀物，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷乙醇至最终浓度为75％(v/v)，充分振摇。离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物(a群脑膜炎球菌荚膜多糖)保存在
‑
20℃以下待用。
32.白喉crm197蛋白、碳二亚胺（edac）、氯化钠、盐酸等试剂均为市售产品，其中氯化钠和盐酸均为分析纯；蒸馏水由纯水机现场制备，同样为分析纯。
33.生理盐水：0.9wt%的氯化钠水溶液，摩尔浓度为0.154mol/l。
实施例
34.实施例1一种a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法，包括以下步骤：
①
、多糖衍生物的制备称量1.0g的a群脑膜炎球菌荚膜多糖，置于烧杯中，加入200ml生理盐水（25℃），室温下用磁力搅拌器搅拌30min，搅拌转速为400r/min，溶解为多糖溶液a；用摩尔浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液调节多糖溶液a的ph为10.5，且该ph允许在
±
0.2范围内波动（该范围内的波动对产物性能的影响较小），加入质量浓度为1g/l的溴化氢溶液1.2l进行活化，获得多糖溶液b；向多糖溶液b中加入摩尔浓度为1g/l的己二酰肼溶液3.0l衍生15min，期间，衍生反应的ph保持在9.0，且该ph允许在
±
0.2范围内波动（该范围内的波动对产物性能的影响较小），获得多糖溶液c；将多糖溶液c移至无菌冷库内，在搅拌转速为600r/min、温度为4℃的条件下低温搅拌10h，其中，冷库温度可在2
‑
8℃范围内波动，搅拌时间可根据多糖溶液的搅拌状态在6
‑
20h范围内波动，获得多糖溶液d；随后将多糖溶液d用装有50kd超滤膜包的超滤机进行换膜超滤，加入20l生理盐水（4℃），启动超滤机，超滤至体积为5l的液体，更换超滤膜包重复上述过程6次，完成超滤后获得多糖衍生物原液。
35.②
、混合配比温度控制在4
‑
8℃的条件下，将步骤
①
获得的多糖衍生物原液用生理盐水（4℃）和摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液（4℃）配制成ph为6.0的衍生物溶液，且衍生物溶液中多糖衍生物的浓度为1.2mg/ml，其中衍生物溶液的ph允许在
±
0.2范围内波动（该范围内的波动对产物性能的影响较小），加入白喉crm197蛋白后搅拌混合，其中多糖衍生物与白喉crm197蛋白的重量比为1:1，获得平衡溶液。
36.③
、结合反应温度控制在4
‑
8℃的条件下，向步骤
②
获得的平衡溶液中加入碳二亚胺进行结合反应，添加至反应物中碳二亚胺的浓度为40mmol/l，控制反应温度保持在4
‑
8℃范围内反应3h，获得初反应物。
37.④
、时效处理将步骤
③
获得的初反应物置于2
‑
8℃的无菌冰箱中，静置16小时进行时效处理，其中的时效处理时间可根据需要在16
‑
20h的范围内进行调整，获得时效反应物。
38.⑤
、超滤将步骤
④
获得的时效反应物进行超滤，用超滤机和100kd的超滤膜包进行6次换液超滤，每次以时效反应物的5倍体积的蒸馏水进行稀释，除去结合反应过程中多余的残留试剂之后，获得结合物浓缩液。
39.⑥
、除菌用0.22μm滤膜对步骤
⑤
获得的结合物浓缩液进行除菌过滤，获得a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物原液。
40.其中的a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物原液为a群脑膜炎结合疫苗制备过程中的
中间产品，多以原液形式进行暂存，在此不再进一步展开其结合疫苗的制备方法。
41.实施例2
‑
4实施例2
‑
4在实施例1的方法基础上，对步骤
②
中的工艺参数进行调整，具体调整情况参见下表一。
42.表一 实施例1
‑
4的工艺参数调整表 实施例1实施例2实施例3实施例4多糖衍生物的反应浓度（mg/ml）1.20.51.65.0多糖衍生物与白喉crm197蛋白的重量比1:11:0.81:1.51:2.5
实施例5本实施例在实施例1的方法基础上，将步骤
①
中的生理盐水预热至30℃后对a群脑膜炎球菌荚膜多糖进行溶解，其中的预热温度可在
±
2℃范围内波动，该范围内的波动对产物性能的影响较小。
43.实施例6本实施例在实施例1的方法基础上，将步骤
①
中的多糖溶液a经4000r/min离心5min后，取上清液进行ph调节。
44.实施例7本实施例在实施例1的方法基础上，将步骤
①
中的活化温度保持在25℃，且该活化温度允许在
±
2℃范围内波动，该范围内的波动对产物性能的影响较小。
45.实施例8本实施例在实施例1的方法基础上，将超滤实用的生理盐水换成摩尔浓度为0.2mol/l的氯化钠水溶液。
46.实施例9
‑
10实施例9
‑
10在实施例1的方法基础上，将步骤
①
中的溴化氢的添加量进行调整。其中，实施例9中加入质量浓度为1g/l的溴化氢溶液1.5l进行活化；实施例10中加入质量浓度为1g/l的溴化氢溶液1.8l进行活化。
47.实施例11
‑
13实施例11
‑
13在实施例1的方法基础上，将步骤
①
中的活化剂溴化氢溶液替换为碳二亚胺。其中，实施例11中碳二亚胺添加至其浓度为0.01mol/l；实施例12中碳二亚胺添加至其浓度为0.1mol/l；实施例13中碳二亚胺添加至其浓度为0.2mol/l。
48.实施例14
‑
16实施例14
‑
16在实施例1的方法基础上，将步骤
①
中的己二酰肼的添加量进行调整。其中，实施例14中加入摩尔浓度为1g/l的己二酰肼溶液2.0l进行衍生；实施例15中加入摩尔浓度为1g/l的己二酰肼溶液5.0l进行衍生；实施例16中加入摩尔浓度为1g/l的己二酰肼溶液6.0l进行衍生；实施例17
‑
19实施例17
‑
19在实施例1的方法基础上，将步骤
③
初反应物中的碳二亚胺的浓度进行调整。其中，实施例17中初反应物中碳二亚胺的浓度为10mmol/l；实施例18中初反应物中碳二亚胺的浓度为60mmol/l；实施例19中初反应物中碳二亚胺的浓度为100mmol/l。
49.实施例20
‑
22
本实施例在实施例1的方法基础上，在步骤
③
中，所述平衡溶液中还加入有海藻糖。其中，实施例20的平衡溶液中海藻糖的浓度为1mmol/l；实施例21的平衡溶液中海藻糖的浓度为3mmol/l；实施例22的平衡溶液中海藻糖的浓度为5mmol/l。
50.对比例对比例1本对比例在实施例1的方法基础上，将步骤
①
和
②
中的生理盐水替换为摩尔浓度为0.2mol/l的氯化钠水溶液。即，使用摩尔浓度为0.2mol/l的氯化钠水溶液（25℃）溶解a群脑膜炎球菌荚膜多糖；使用摩尔浓度为0.2mol/l的氯化钠水溶液（5℃）进行超滤；使用摩尔浓度为0.2mol/l的氯化钠水溶液（4℃）和摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液（4℃）配制成ph为6.0的衍生物溶液。
51.对比例2本对比例在实施例1的方法基础上，将步骤
①
中活化反应时的ph保持在10.5
±
0.2，将衍生反应时的ph保持在9.0
±
0.2。
52.对比例3本对比例在实施例1的方法基础上，在步骤
⑥
除菌之前还进行纯化处理，具体用aktapure 150m蛋白纯化仪对所述结合物浓缩液进行柱层析纯化，纯化填料为sepharose 4 fast flow，纯化线性流速为30
‑
50cm/h，上样纯化体积不超过装柱体积的5％，收集v0附近kd≤0.2的a280吸收峰处的物质，获得结合物纯化液。
53.性能检测试验检测方法/试验方法将上述实施例1
‑
22以及对比例1
‑
3对应制得的a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物原液，按《中国药典2015版》中的检测标准测定其对应的多糖收率、蛋白收率和结合物原液的各项质量项目，具体检测结果见下表二。
54.表二 实施例1
‑
22以及对比例1
‑
3的多糖结合物的多糖收率和蛋白收率 多糖收率/%蛋白收率/%实施例186.891.7实施例287.091.5实施例388.593.2实施例487.192.0实施例586.991.7实施例689.193.0实施例787.292.4实施例885.990.0实施例987.592.5实施例1087.292.1实施例1185.090.1实施例1291.894.2实施例1392.094.7实施例1488.193.0
实施例1587.592.4实施例1687.392.4实施例1785.490.1实施例1888.193.0实施例1986.091.1实施例2091.895.4实施例2193.597.8实施例2292.095.9对比例183.181.8对比例282.780.4对比例386.091.4上述实施例1
‑
22制得的a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物原液内毒素含量均≤1.0eu/μg（标准≤10eu/μg），游离多糖含量≤9.7%（标准≤20%），游离蛋白含量≤0.9%（标准≤5%），分子大小kd值＜0.2的洗脱液回收率≥90.3%（标准≥60%），edac残留≤0.5μmol/l（标准≤5μmol/l），氰化物残留≤0.4ng/mg（标准≤5ng/mg），无菌检测均为未检出（标准未检出）。由此，本技术实施例制得的a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的质量符合国家检测标准。
55.结合表二，将实施例1与对比例1
‑
4的检测结果进行比较，可以得到，本技术采用生理盐水溶解a群脑膜炎球菌荚膜多糖，其能有效溶解分子量为50
‑
100kda的a群多糖；在溴化氢活化a群多糖过程中，本技术省去了ph调节的工序，但其对a群多糖的活化效果影响较小；在己二酰肼衍生a群多糖时，本技术设定衍生反应的ph保持在9.0
±
0.2，此时上述活化的a群多糖能快速有效地进行衍生，其制得的多糖衍生物用生理盐水和盐酸溶液配制为衍生物溶液，随后调整多糖衍生物的反应浓度以及与白喉crm197蛋白的重量比，由此保证结合反应有效进行，其制得的结合物经超滤后，多糖收率可达85%及以上，蛋白收率可达90%及以上，且其他质量要求也符合国家标准；由此，本技术的制备方法作为一个整体方案，其通过对各工艺参数的优化省去了结合物的纯化工序，但收获的多糖结合物的质量仍符合国家标准，由此简化了多糖结合物的制备工序，缩短了多糖结合物的制备周期，具有良好的应用前景。
56.其中，实施例5在制备过程中，a群脑膜炎球菌荚膜多糖的溶解时间为18min，明显少于室温搅拌的30min。
57.将实施例1与实施例6的检测结果进行比较，实施例6的多糖收率和蛋白收率均高于实施例1，由此可以得到，离心操作能将多糖溶液a中少量未溶解的a群多糖以及其他杂质去除，由此收获纯度更高、性能更加稳定多糖结合物。
58.将实施例1与实施例7的检测结果进行比较，可以得到，本技术优选25
±
2℃的活化温度，有助于溴化氢对a群多糖进行有效活化，进而获得多糖收率和蛋白收率更高的多糖结合物。
59.将实施例1与实施例8的检测结果进行比较，可以得到，溶解a群脑膜炎球菌荚膜多糖和超滤使用的溶剂保持一致，能避免反应体系中掺入其他溶剂，由此保证反应过程简单可控，获得多糖收率和蛋白收率更高的多糖结合物。
60.将实施例1与实施例9
‑
10的检测结果进行比较，可以得到，溴化氢对a群多糖的活化效率有限，本技术按a群脑膜炎球菌荚膜多糖与溴化氢的重量比为1:（1.2
‑
1.8）添加溴化氢时，有助于a群多糖尽可能多的被活化，进而能进一步提高多糖结合物的多糖收率和蛋白收率。
61.将实施例1与实施例11
‑
13的检测结果进行比较，可以得到，本技术选用碳二亚胺为活化剂，且碳二亚胺添加至其浓度为0.01
‑
0.2mol/l时，该碳二亚胺能活化羧基，促使酰胺和酯的生成，进而对a群多糖进行活化；待a群多糖活化完成后，该碳二亚胺还能与己二酰肼共同作用参与a群多糖的衍生反应，提高a群多糖的衍生效果，进而提高多糖结合物的多糖收率和蛋白收率。其中，进一步优选浓度为0.1
‑
0.2mol/l的碳二亚胺，且其效果优于溴化氢作为活化剂时的效果。
62.将实施例1与实施例14
‑
16的检测结果进行比较，可以得到，溴化氢对a群多糖的活化效率有限，在本技术优选步骤
①
中a群脑膜炎球菌荚膜多糖与己二酰肼的重量比为1:（2
‑
5），此时多糖衍生物的衍生率较高，进而能进一步提高多糖结合物的多糖收率和蛋白收率。
63.将实施例1与实施例17
‑
19的检测结果进行比较，可以得到，本技术设定初反应物中碳二亚胺的浓度为10
‑
100mmol/l时，该碳二亚胺能有效促使a群多糖与白喉crm197蛋白进行结合反应。其中，进一步优选的浓度为40
‑
60mmol/l。
64.将实施例1与实施例20
‑
22的检测结果进行比较，可以得到，本技术在平衡溶液中加入适量的海藻糖，其对a群多糖与白喉crm197蛋白结合的影响可以忽略不计，此外其还能在一定程度上增加多糖结合物的稳定性，有效提高多糖结合物的多糖收率和蛋白收率。
65.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。