淫羊藿次苷Ⅰ的用途的制作方法

淫羊藿次苷ⅰ的用途
技术领域
1.本发明涉及医药领域，尤其涉及一种淫羊藿次苷ⅰ的用途。


背景技术：

2.骨质疏松症是一种以骨量减少为特征、骨组织显微结构改变和骨折危险程度增加的疾病。成骨细胞的增殖抑制、分化程度降低是造成骨质疏松的重要原因。骨质疏松症的临床表现为腰酸背痛，四肢乏力，骨骼疼痛，因其在中老年人中发病率高、危害大而受到社会和医疗界的高度重视。现阶段骨质疏松症的治疗主要以雌激素、钙剂、活性维生素d、降钙素和氟化物等为常用药物，虽然有一定的疗效，但存在不良反应大及患者不能长期耐受等缺点。随着人口寿命的增长，老年的数量日益增多，骨质疏松这种病的危害就越来越严重。因此，寻找一种有效治疗骨质疏松症的药物是当前医学界中药的课题之一。中医认为，肾藏精，主骨生髓，髓藏于骨腔内，滋养骨骼，骨的生长发育依赖肾气的滋养与推动中医临床和实验证明中医药治疗原发性骨质疏松症疗效显著，淫羊藿为中医临床治疗骨质疏松或促进骨折愈合常用中药。目前有关中药淫羊藿治疗骨质疏松症的药物，国内的中药制剂有仙灵骨葆。但长期服用仙灵骨葆也会导致肝损伤。因此寻求一种副作用小，又有显著疗效的中药制剂是医学界亟待解决的难题。
3.另一方面，淫羊藿次苷i(icariside i)是中药材淫羊藿中的一种微量黄酮苷类化合物，目前有关淫羊藿次苷i的药理活性研究报道较少，在已有报道中，淫羊藿类药物能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效。淫羊藿次苷i作为淫羊藿苷主要体内代谢产物，在对抗骨质疏松症方面的研究很少。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种淫羊藿次苷i的新用途，即在制备预防和/或治疗骨质疏松症的药物或保健品中的用途。
5.其中，所述药物可制成任意剂型，示例性的为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂或注射剂，但不限于此。
6.具体的，使用该药物或保健品治疗或预防骨质疏松症时，淫羊藿次苷ⅰ的每日用量为5～50mg/kg
·
bw(体重)。
7.在本发明的一个实施例之中，所述淫羊藿次苷ⅰ由毕赤酵母工程菌gs115-ka对淫羊藿提取物发酵而得；发酵淫羊藿提取物中淫羊藿次苷ⅰ的含量大于等于1％；其中，毕赤酵母工程菌gs115-ka为鼠李糖苷酶tperha-k579a基因突变体。其中，鼠李糖苷酶tperha-k579a突变体的具体氨基酸序列、核苷酸序列参申请人的前序申请cn113136378b。
8.在本发明的一个实施例之中，毕赤酵母工程菌gs115-ka的制备方法为：
9.(1)将鼠李糖苷酶tperha-k579a基因连接到质粒(ppic9k)中，得到重组质粒；
10.(2)将所述重组质粒转化至毕赤酵母gs115细胞中，该菌株诱导表达，得到鼠李糖苷酶tperha-k579a突变体。
11.在本发明的一个实施例中，发酵淫羊藿提取物的制备方法为：
12.(1)提供发酵培养基；
13.(2)将所述毕赤酵母工程菌gs115-ka接种至所述发酵培养基中，20～40℃发酵2～5d，然后流加10～20ml/(l
·
h)的甲醇，诱导产酶80～150h，再将所述鼠李糖苷酶tperha-k579a突变体分离，得到发酵液；
14.(3)将1～3l发酵液与1.5～3kg淫羊藿提取物、60～100l水混合，然后在50～60℃下反应10～20h，得到发酵淫羊藿提取物。
15.在本发明的一个实施例中，淫羊藿次苷ⅰ由鼠李糖苷酶tperha-k579a酶对淫羊藿提取物酶解而得，酶解淫羊藿提取物中淫羊藿次苷ⅰ的含量大于等于1％。
16.相应的，本技术还公开了发酵淫羊藿提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松症的药物或保健品中的用途；其中，发酵淫羊藿提取物中淫羊藿次苷ⅰ的含量大于等于1％。
17.相应的，本技术还公开了酶解淫羊藿提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松症的药物或保健品中的用途；其中，酶解淫羊藿提取物中淫羊藿次苷ⅰ的含量大于等于1％。
18.其中，所述药物可制成任意剂型，示例性的为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂或注射剂，但不限于此。
19.具体的，使用该药物或保健品治疗或预防骨质疏松症时，淫羊藿次苷ⅰ每日用量为5～50mg/kg bw(体重)。
20.实施本发明，具有如下有益效果：
21.本发明通过药理实验表明淫羊藿次苷i可用于治疗骨质疏松症。具体的，体外实验结果显示，淫羊藿次苷i对成骨细胞具有明显的促进增殖作用，体内实验结果显示，淫羊藿次苷i可显著提高小鼠骨密度，促进成骨细胞形成，抑制破骨细胞的形成。并且，通过体内实验证明，当剂量范围在5-50mg/kg
·
bw具有最好的治疗效果，高剂量下(200mg/kg
·
bw)，无治疗效果。另外，本发明利用发酵的或酶解的淫羊藿提取物添加药学上可接受的载体制备成各种制剂，该制剂毒副作用低，弥补了市售要长期服用毒副作用较大的弊端。
附图说明
22.图1是实施例2中各试验组对小鼠肝脏重量的影响图；
23.图2是实施例2中sham组小鼠肝脏切片图；
24.图3是实施例2中ovx组小鼠肝脏切片图；
25.图4是实施例2中aln组小鼠肝脏切片图；
26.图5是实施例2中l组小鼠肝脏切片图；
27.图6是实施例2中m组小鼠肝脏切片图；
28.图7是实施例2中h组小鼠肝脏切片图；
29.图8是实施例2中各试验组对总骨密度的影响图；
30.图9是实施例2中各试验组对皮质骨骨密度的影响图；
31.图10是实施例2中各试验组对松质骨骨密度含量的影响图；
32.图11是实施例2中各试验组对小鼠骨钙素的影响图；
33.图12是实施例3中各试验组对rbmscs细胞中alp活性的影响图；
34.图13是实施例3中各试验组对rbmscs细胞中alp mrna表达的影响图；
35.图14是实施例3中各试验组对rbmscs细胞中run
×
2mrna表达的影响图。
具体实施方式
36.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。仅此声明，本发明在文中出现或即将出现的上、下、左、右、前、后、内、外等方位用词，仅以本发明的附图为基准，其并不是对本发明的具体限定。
37.实施例1
38.本实施提供一种发酵淫羊藿提取物的制备方法，其包括：
39.(1)将鼠李糖苷酶tperha-k579a基因连接到质粒ppic9k上，将该质粒转化到毕赤酵母gs115中，得到工程菌gs115-ka；
40.(2)提供发酵培养基；具体的，发酵培养基体积为3.5l，培养基配方为：85％(w/v)h3po
4 26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so
4 18.2g/l，koh 4.13g/l，mgso4·
7h2o 14.9g/l，甘油40g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，微量元素ptm14.4ml/l，消泡油15ml，30ml氨水调ph至5.0。
41.(3)在发酵培养基中接种5wt％工程菌gs115-ka，并在30℃，200rpm条件下发酵3d，以15ml/l/h的速度流加甲醇进行诱导产酶100h，将菌种分离，得发酵液2l。
42.(4)取淫羊藿提取物(含20％朝藿定c和10％淫羊藿苷)2kg，80l的纯净水，加入到100l的反应釜，采用缓冲盐调节ph至5，在温度55℃下加入发酵液2l，反应16h后，灭酶，浓缩，干燥，即得发酵淫羊藿提取物。
43.实施例2
44.发酵淫羊藿提取物对骨质疏松小鼠的影响体内实验
45.(1)造模：将小鼠卵巢切除进行模型构建。
46.(2)分组：以做了手术未切除卵巢的小鼠为假手术组(sham)，将步骤(1)造好的小鼠骨质疏松模型随机分为造模后对照组(ovx)、阿伦磷酸钠干预组(aln)、发酵或酶解的淫羊藿提取物(以淫羊藿次苷1剂量计)低中高剂量组l、m、h共6组，每组三只小鼠。
47.(3)给药：采用灌胃方式给药，其中sham组、ovx组给予0.2ml/kg
·
bw玉米油；aln组给予90mg/kg
·
bw阿伦磷酸钠，l组为低剂量组，给予5mg/kg
·
bw的淫羊藿次苷i；m组为中剂量组，给予50mg/kg
·
bw的淫羊藿次苷i；h组为高剂量组，给予200mg/kg
·
bw的淫羊藿次苷i，连续给药4周。
48.(4)观察与检测：给药期间，每日观察小鼠食欲、排便、尿液、活动等情况；给药4周后对活体小鼠骨密度和小鼠血清，以及小鼠的肝脏进行检测。
49.结果如图1-11所示。其中，图1是各试验组对各试验组对小鼠肝脏重量的影响图。从图1可以看出，sham组和aln组小鼠的肝脏正常，没有受到影响，造模组小鼠的肝脏受到影响，而在低中高三种剂量下，小鼠的肝脏解剖形态学正常。
50.图2～图7是各试验组小鼠的肝脏切片图，从图中来看，在服用发酵淫羊藿苷提取物后，小鼠的肝脏恢复正常，说明发酵淫羊藿提取物毒性较低，或有可能具有修复肝脏的作用。
51.图8～图10是个试验组对骨密度的影响图。从图中可以看出，小鼠给药4周后与ovx相比低剂量组(l)和中剂量组(m)对骨密度都有所提升，且低剂量组(l)的效果最好，低剂量(l)和中剂量组(m)和药物阿伦磷酸钠组相比，效果要比阿伦磷酸钠组(aln)好，高剂量组
(h)则没有改善效果。说明小鼠每天的给药剂量在5-50mg/kg
·
bw，对骨密度的改善不是剂量依赖性的，高剂量下起到相反的作用。
52.图11是各试验组对小鼠骨钙素的影响图，从图中可以看出，在给药4周后，小鼠血液中，sham组骨钙素含量最高，表现的是正常小鼠的骨质情况，ovx组的骨钙素最低，说明通过卵巢切除造摸后，小鼠的骨流失严重，也表明骨质疏松模型造摸成功，给药后，l组的治疗效果最好，强于阳性对照aln组，而m组的治疗效果不及l组，但也有一定的效果，比ovx组好，h组表现出了负面的效果，说明，淫羊藿次苷ⅰ对骨质疏松的治疗在5-50mg/kg
·
bw的剂量下具有作用，最优的剂量为5mg/kg
·
bw，高剂量下会有相反的结果。达不到治疗骨质疏松的作用。
53.实施例3
54.发酵淫羊藿提取物对骨质疏松小鼠的影响体内实验
55.(1)方法：贴壁筛选法体外培养rbmscs(大鼠骨髓间充质干细胞)，以不同浓度的发酵淫羊藿提取物对rbmscs的成骨性分化进行药物干预，elisa法检测alp(碱性磷酸酶)的活性，以rt-time pcr法检测alp和run
×
2mrna基因的表达。
56.(2)实验分组
57.对照组：基础培养液：dmem+10ml/dl胎牛血清(含100u/ml青、链霉素)，发酵淫羊藿提取物干预组：基础培养液+发酵后的或酶解后的淫羊藿提取物1
×
10-5
mol/l、1
×
10-6
mol/l、1
×
10-7
mol/l、1
×
10-8
mol/l、1
×
10-9
mol/l、1
×
10-10
mol/l。
58.结果如图12～14所示。
59.具体的，图12是各试验组对rbmscs细胞中alp活性的影响图，从图中可以看出，不同浓度的发酵淫羊藿提取物干预rbmscs，alp活性都比对照组高，且在1
×
10-7
mol/l、1
×
10-8
mol/l、1
×
10-9
mol/l、1
×
10-10
mol/l效果最显著。
60.图13是各试验组对rbmscs细胞中alp mrna表达的影响图；从图中可以看出，在1
×
10-6
mol/l浓度下alp mrna表达水平显著升高。
61.图14是各试验组对rbmscs细胞中run
×
2mrna表达的影响图；从图中可以看出，在1
×
10-7
mol/l的浓度下run
×
2mrna的表达水平远远高于对照组。其中，run
×
2是成骨细胞的特异转录因子和成骨细胞分化的关键调节因子，是骨发育过程中激活与启动bmscs向成骨细胞分化并调节成骨细胞成熟的重要转录因子。
62.综合图12～图14的结果可以看出：发酵淫羊藿提取物能够促进原代成骨细胞的增殖。且在1
×
10-6-1
×
10-10
mol/l的范围内对原代成骨细胞增殖具有很好的促进作用。
63.综上，本发明通过安全性实验证明发酵后淫羊藿提取物对宿主的毒性影响很小；通过骨质疏松小鼠的体内实验，证明了发酵淫羊藿提取物能够提高小鼠骨密度，对成骨细胞具有促进增殖的作用，对破骨细胞具有抑制的作用。且淫羊藿次苷ⅰ对骨质疏松的治疗在5-50mg/kg
·
bw的剂量下具有作用，高剂量下会有相反的结果，达不到治疗骨质疏松的作用。通过体外实验，证明了发酵淫羊藿提取物对成骨细胞具有增殖作用。根据以上实施例证明，淫羊藿次苷ⅰ、发酵淫羊藿提取物可以作为治疗骨质疏松症的药物使用。
64.以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。