一种二价锰佐剂和cpg佐剂的疫苗佐剂组合物及其制作方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术与疫苗技术领域，特别是一种二价锰佐剂和cpg佐剂的疫苗佐剂组合物及其制作方法。
背景技术：
2.佐剂是一类添加到疫苗中以提高抗原免疫原性的物质。根据作用机制的不同，佐剂可分为两类：免疫增强剂(immune potentiators)和递送系统(delivery systems)。免疫增强剂包括：一些由病原相关分子模式(pathogen
‑
associated molecular patterns, pamps)或合成的模式识别受体(pattern
‑
recognition receptor, pprs)激活剂，它们能激活先天免疫反应，随后诱导细胞因子和趋化因子的产生。其他还包括免疫细胞或细胞因子，如树突状细胞(dendritic cells，dcs)、il
‑
12或gm
‑
csf，它们能直接参与到免疫反应中，更快地发挥作用。递送系统包括脂质体(liposome)、胶束(micelles)、类病毒体(virosome)、纳米颗粒(nanoparticles)、微球(microsphere)、油/水乳剂(oil/water emulsion)、病毒样颗粒(virus
‑
like particles，vlp)和免疫刺激复合物(immune stimulating complexes，iscom)，它们的作用机制是将抗原携带到靶细胞，促进抗原呈递细胞(antigen presenting cells，apcs)的抗原递呈。
3.铝佐剂是最先被发现的一种无机盐佐剂，自从1926年被发现至今已使用接近100年，能激活th2免疫反应，即体液免疫反应，但是铝佐剂的局限性在于不能激活细胞免疫。细胞免疫主要参与对胞内寄生的病原微生物的免疫应答及对肿瘤细胞的免疫应答，因此在抵抗病毒感染和肿瘤治疗中发挥重要的作用。
4.cpg佐剂是一种含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的脱氧核苷酸序列，能激活tlr9受体，产生多种细胞因子，增强抗原的加工递呈，诱导th1免疫反应。由于cpg 通过toll样受体 9（toll
‑
like receptor4，tlr 9）作用于不同动物，不同的细胞组织表达差异很大，所以将cpg 分为三类，分别为k型odn、d型odn、c型odn。k型odn活化树突状细胞（dc）分泌tnf
‑
α和il
‑
6，活化b细胞，产生抗体；d型odn刺激抗原提呈细胞（apc）成熟和分泌ifn
‑
α；c型odn刺激b细胞和dc细胞分泌il
‑
6和ifn
‑
α。
5.现有技术公开了用于增强免疫的二价锰胶体或二价锰新生沉淀，以及其用于增强免疫的用途，这种免疫增强用途例如可用于作为免疫佐剂、抗病毒或抗肿瘤。然而，在进一步研究中，发现胶体锰佐剂激活免疫效果还可以通过与cpg佐剂组合进一步提高，更适合于疫苗研发。在研究锰佐剂增强免疫效果时发现，锰佐剂可以在机体中产生免疫增强作用，但是这种作用还不够强。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种二价锰佐剂和cpg佐剂的疫苗佐剂组合物及其制作方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种二价锰佐剂和cpg佐剂的疫苗佐
剂组合物，包括以下步骤：包括二价锰佐剂和cpg佐剂，锰元素与cpg的质量比为1：0.001～1:0.1，cpg佐剂包含：k型odn、d型odn、c型odn。
8.本发明的进一步改进在于：cpg佐剂为odn d
‑
sl01，其序列为5
’‑
tcg cga cgt tcg ccc gac gtt cgg ta
‑3’ꢀ
(26 mer)，硫代修饰。
9.一种二价锰佐剂和cpg佐剂的疫苗佐剂组合物的制作方法，将疫苗抗原和二价锰佐剂、cpg佐剂做成稳定形式组合，疫苗抗原浓度为50
‑
100 ug/ml，二价锰佐剂浓度为1 mg/ml，cpg佐剂浓度为1
‑
100 ug/ml，稳定剂明胶的浓度为2
‑
3%；先将二价锰佐剂与cpg佐剂在磁力搅拌器上搅拌混匀10
‑
30 min，温度为室温，转速设置为800
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1000 rpm；再将10%的明胶溶液加入搅拌10
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30min，温度为50
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60摄氏度，转速设置为800
‑
1000rpm；最后将疫苗抗原加入搅拌10
‑
30 min，温度为室温，转速设置为800
‑
1000rpm。
10.本发明的进一步改进在于：疫苗抗原包括灭活病原体或者提取的病原体亚单位抗原及其组合。
11.本发明的进一步改进在于：病原体包括常见对的病毒、细菌和/或寄生虫。
12.本发明的进一步改进在于：病毒选自：dna病毒和rna病毒，dna病毒为疱疹病毒科、嗜肝dna 病毒科、乳头瘤病毒科或痘病毒科；rna病毒为弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、小rna病毒科、黄病毒科或逆转录病毒科。
13.本发明的进一步改进在于：细菌选自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
14.本发明的进一步改进在于：细菌选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、脑膜炎双球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓假单胞菌和波美不动杆菌。
15.本发明的进一步改进在于：寄生虫选自疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、丝虫和利什曼原虫。
16.一种二价锰佐剂和cpg佐剂的疫苗佐剂组合物的使用方法，包括肌肉注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射、粘膜施用及其任意组合。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用cpg佐剂与二价锰佐剂组合，可以提高二价锰佐剂的免疫增强效果。
附图说明
18.图1是二价锰佐剂加cpg佐剂皮下免疫效果图；图2是二价锰佐剂加cpg佐剂肌肉免疫效果图。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相
ul针剂中加铝佐剂100 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。mnj组：200 ul针剂中加二价锰佐剂100 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。mnj+cpg组：200 ul针剂中加二价锰佐剂100 ug、cpg佐剂10 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。分别在第0天和第14天肌肉免疫小鼠，第21天检测特异性抗体。二价锰佐剂加cpg佐剂组增强抗体产生效果显著高于二价锰佐剂组和铝佐剂组。
29.图2示了四种免疫方案:ctl表示单独免疫狂犬g蛋白10 ug，alhy表示免疫铝佐剂100 ug加狂犬g蛋白10 ug，mnj表示免疫二价锰佐剂100 ug加狂犬g蛋白10 ug，mnj+cpg表示免疫二价锰佐剂100 ug加cpg佐剂10 ug加狂犬g蛋白10 ug。免疫途径是肌肉免疫。免疫动物为c57bl/6小鼠。免疫时间是在第0天和第14天，第21天时取血清用elisa方法检测血清中特异性igg抗体。
30.二价锰纳米颗粒可以直接激活免疫反应，二价锰佐剂和cpg佐剂都有免疫效果，在二价锰纳米颗粒中加入cpg佐剂可以提升原来的免疫效果。
31.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
32.需要说明的是，本技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的术语在适当情况下可以互换，以便这里描述的本技术的实施方式，例如，能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、产品或设备固有的其它步骤或单元。
33.为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在
……
之上”、
ꢀ“
在
……
上方”、“在
……
上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在
……
上方”可以包括“在
……
上方”和“在
……
下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
34.现在，将参照附图更详细地描述根据本技术的示例性实施方式。然而，这些示例性实施方式可以由多种不同的形式来实施，并且不应当被解释为只限于这里所阐述的实施方式。应当理解的是，提供这些实施方式是为了使得本技术的公开彻底且完整，并且将这些示例性实施方式的构思充分传达给本领域普通技术人员，在附图中，为了清楚起见，有可能扩大了层和区域的厚度，并且使用相同的附图标记表示相同的器件，因而将省略对它们的描述。
35.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。