一种磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料

1.本发明属于生物组织工程医用领域，更具体地，涉及一种磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料。


背景技术：

2.聚醚醚酮(peek)是一种结晶度通常在30％之间的半结晶聚合物。聚醚醚酮(peek)具有无毒害、高熔融温度(tm＝340℃)、高玻璃化转变温度(tg＝143℃)、耐化学腐蚀性、耐磨性等优异性能。聚醚醚酮(peek)于1990年代初期首次引入医疗领域，它具有许多优异的性能，聚醚醚酮(peek)的弹性模量在3
‑
4gpa之间，接近皮质的弹性模量骨(～18gpa)，能够和人体骨有较好的对接，因此可作为人体硬组织植入材料。聚醚醚酮(peek)成型加工技术良好，可以通过包括注塑、挤出或机械加工在内的常规技术进行加工，因而为医疗器械制造提供了广泛的设计和制造灵活性。经过改性后可负载药物等促进细胞黏附、生长和分化。聚醚醚酮因其优异的力学性能以及无毒的特性，在医用材料领域等到了一定的研究和应用。
3.聚醚醚酮(peek)其本身具有一定的生物惰性，不适合直接将其用于人体植入材料，一般情况下，将聚醚醚酮(peek)进行表面改性处理，具体可分为表面涂层改性、化学刻蚀等。聚醚醚酮(peek)可通过浓硫酸磺化不同时间来对表面结构进行修饰或在未经磺化处理的聚醚醚酮(peek)表面涂布羟基磷灰石、二氧化钛(tio2)、氧化铝(al2o3)等。这两种改性方法为聚醚醚酮(peek)用于组织工程支架领域提供了一定的促进作用，但单纯表面化学改性和涂布改性对机体生理作用较为单一，无法做到多种性能统一。因而寻求一种新的改性方法或者将两者改性方法结合起来，采用优异的物质进行涂层改性，制备一种综合性能优异的共聚物材料是组织工程领域的一个重要方向和目标。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料，使其具有良好的生物相容性，从而满足其作为人体硬组织植入材料的性能要求。
5.本发明的技术方案之一，一种磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料，所述磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料以磺化聚醚醚酮为载体，表面负载有纳米蛋白。
6.进一步地，所述纳米蛋白来源为贝壳层粉料；所述纳米蛋白在磺化聚醚醚酮表面的负载量为2.5
‑
20μg。
7.进一步地，所述的贝壳层粉料为合浦珠母贝贝壳层粉料。
8.贝壳层粉料中的纳米蛋白经冷冻干燥后，可分离出不可溶性基质蛋白和可溶性基质蛋白等，其中不可溶性基质中的多糖(几丁质)和不可溶蛋白具有良好的生物相容性。不可溶性蛋白中的丝状蛋白，富含甘氨酸和丙氨酸等具有类似蛛丝氨基酸序列的蛋白质，可为矿物沉积的有机框架提供结构基础，同时，也能够指导理想的碳酸钙晶型的受控形态发生，丝状蛋白可能通过控制钙盐的结晶，间接作用于新生骨，体现其优越的成骨性。
9.本发明的技术方案之二，上述磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料的制备方法，包括
以下步骤：
10.步骤(1)：聚醚醚酮经酸液磺化处理后洗涤、水热化、干燥得到磺化聚醚醚酮；
11.步骤(2)：将纳米蛋白溶液滴加至磺化聚醚醚酮表面后冻干、冷冻干燥、消毒得到磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料。
12.本发明蛋白进行负载时为液体状态，在进行冷冻干燥之前必须进行冻干处理，否则液态蛋白无法进行冷冻干燥。
13.进一步地，所述步骤(1)中：所述聚醚醚酮厚度1
‑
2mm，直径为10
‑
20mm；所述酸液为浓度为18
‑
18.4mol/l的硫酸溶液，所述磺化处理时间为30
‑
40s，所述水热化温度110
‑
120℃，水热化时间3
‑
4h，所述干燥时间为12h
‑
24h。
14.水热化的过程不仅可以去除绝大部分对生物体有毒害作用的残留浓硫酸，还可以稳定对本材料表面3d网络结构的作用。稳定的3d纳米结构可对材料表面负载纳米蛋白提供了结构基础，使得纳米蛋白稳固的结合在材料表面。
15.水热化温度较低将会难以去除残留浓硫酸，进而导致样品中硫酸含量较高，水热化时间也会影响是否能将残存的浓硫酸去除干净，一般来说水热化温度越高，水热化处理时间越长，残留浓硫酸浓度越低，因而对细胞毒副作用越低。
16.进一步地，所述步骤(2)中：纳米蛋白溶液浓度为50μg/ml
‑
200ug/ml，所述纳米蛋白溶液滴加至磺化聚醚醚酮的质量比为1：20000
‑
1：3000，冻干温度
‑
20℃～
‑
4℃，冻干时间2
‑
4h，冷冻干燥时间12
‑
24h，消毒具体为用75％医用酒精浸泡2
‑
3h。
17.进一步地，所述步骤(2)中，纳米蛋白溶液的制备方法包括以下步骤：
18.步骤
①
：搅拌条件下向乙二胺四乙酸二钠盐溶液中加入碱性固体至溶液澄清，调整ph值至8.2
‑
8.5，过滤得到贝壳层溶解液；
19.步骤
②
：贝壳层粉料溶于步骤
①
制得的贝壳层溶解液中，搅拌、抽滤、透析、浓缩得到纳米蛋白母液，经磷酸缓冲溶液稀释得到纳米蛋白溶液。
20.进一步地，所述步骤
①
中：乙二胺四乙酸二钠盐溶液浓度为0.05
‑
0.06mol/l，所述碱性固体为氢氧化钠固体、碳酸氢钠固体、碳酸钠固体和磷酸钠固体中的一种或多种，使用1mol/l的盐酸溶液调整ph值至8.2
‑
8.5。
21.进一步地，所述步骤
②
中：贝壳层粉料和贝壳层溶解液的质量比为5：16
‑
6：17，搅拌时间24
‑
48h，透析所使用的透析液为磷酸盐缓冲液和/或超纯水，透析时间24
‑
48h，浓缩使用的化学物质为peg8000、peg6000、peg4000中的一种或多种。
22.本发明中纳米蛋白溶液的制备方法采用碱性溶液溶解，与传统溶解液醋酸、稀盐酸等酸性溶解液相比，不会破坏其氨基，因而可以很好的与磺化聚醚醚酮磺酸基结合。采用的透析、浓缩等方法可最大限度的得到nsm纳米蛋白中可溶性基质及不可溶性基质。浓缩可轻易得到较高浓度的nsm纳米蛋白母液，从而易测得nsm蛋白的真实浓度。
23.由于蛋白中含有氨基等碱性基团，所以我们在提取蛋白的过程中所采取的edtana2由于是碱性溶液，与传统的贝壳溶解液醋酸、稀盐酸等酸性溶解液相比，其不会与破坏蛋白中的氨基，而氨基则是nsm纳米蛋白与磺化聚醚醚酮连接在一起的关键基团。传统的贝壳溶解液醋酸、稀盐酸等酸性溶解液无法使用碱性物质进行ph的调高，否则将会改变溶解液的化学性质，进而减少nsm纳米蛋白的产率甚至无法得到nsm纳米蛋白。
24.本发明的技术方案之三，上述磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料作为硬组织植入材
料的应用。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果：
26.本发明通过以聚醚醚酮(peek)出发，磺化得到磺化聚醚醚酮(s
‑
peek)，将nsm蛋白负载至磺化聚醚醚酮(s
‑
peek)，从而制备得到磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料，由于磺化聚醚醚酮(s
‑
peek)表面存在大量磺酸基团，可与nsm蛋白形成离子间的作用力，同时，磺化聚醚醚酮(s
‑
peek)表面存在3维纳米级网状孔洞，这使得nsm蛋白能够稳固的负载至磺化聚醚醚酮(表面)，从而进一步发挥其生物学作用。
27.本发明产品具有良好的生物相容性，经过试验验证，其能够促进sd大鼠骨髓间充质干细胞粘附、增殖和分化，同时，还具有抗氧化应激等优异的性能；本发明原料易得、合成制备简单、流程简便、制备效率高、可大批量生产。
附图说明
28.图1为实施例1所得的磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料的结构示意图；
29.图2为实施例1所得的聚醚醚酮的sem实拍图；
30.图3为实施例1所得的聚醚醚酮磺化后不同放大倍数的sem实拍图；
31.图4为实施例1所得的磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料的sem实拍图；
32.图5为实施例1所得的nsm纳米蛋白经冻干、冷冻干燥后的sem实拍图；
33.图6为实施例1所得的nsm纳米蛋白三个不同浓度的粒径大小图；
34.图7为实施例1所得的磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料的ft
‑
ir图；
35.图8为实施例1所得的sd大鼠骨髓间充质干细胞分别在聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上生长七天后的死活荧光染色图；
36.图9为实施例1所得的sd大鼠骨髓间充质干细胞分别在聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上生长24h后抗不同浓度过氧化氢(h2o2)的抗氧化应激示意图(p<0.05*,0.01<p<0.05**,p<0.001***)；
37.图10为实施例1所得的sd大鼠骨髓间充质干细胞分别在聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上生长7天14天alp定性染色及21天ars定性染色；
38.图11为实施例1所得聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上接种1
×
105金黄色葡萄球菌37℃恒温培养24h后稀释十倍后在600nm波长处的吸光度(吸光度大小代表细胞浓度)；
39.图12为实施例1所得的聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上接种1
×
105金黄色葡萄球菌，37℃恒温培养18h，稀释十倍后于琼脂固体培养基37℃培养18h后相机实拍图；
40.图13为实施例1所得的聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料植入大鼠体内8周后组织切片染色图；
41.图14为实施例1所得的聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上水接触角示意图；
42.图15为实施例1磺化聚醚醚酮表面eds能谱图。
具体实施方式
43.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
44.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
45.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
46.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
47.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
48.实施例1
49.(1)将直径为10mm，厚度为1mm的圆柱形聚醚醚酮(peek)一面抛光至镜面光滑度，使用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗3次，每次15分钟，然后室温干燥24小时得到备用聚醚醚酮(peek)；在通风台中，将聚醚醚酮(peek)经18.4mol/l的浓硫酸旋转磺化40s处理后经超纯水洗涤去除残留浓硫酸、水热化处理除去硫(水热化条件为：120℃，4h)、在n2气流中干燥24h后得到磺化聚醚醚酮(s
‑
peek)。
50.(2)称取33.62g edtana2(乙二胺四乙酸二钠盐)，溶于2000ml超纯水中，搅拌制成0.05m/l的edtana2溶液，边搅拌边加入naoh固体颗粒，溶液澄清后，停止加入naoh固体，使用1mol/l的稀盐酸溶液将ph值调至8.4，过滤得到溶解液a。
51.(3)取合浦珠母贝贝壳层粉料10.0g，用配制好的溶解液a溶解，置于4℃冰箱中磁力搅拌48h，过滤，转移至透析袋中，使用自制超纯水透析24h，得到透析液，重复透析操作3次，停止透析，得到透析液b；将得到的透析液b置于透析袋中转移至2000ml烧杯中，加入2000ml无菌磷酸盐缓冲液(pbs)至烧杯中，加入约50g peg8000对浓缩液b进行浓缩处理，得到浓缩的nsm蛋白母液。
52.(4)使用无菌pbs溶液对浓缩的nsm蛋白母液进行稀释，得到50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的nsm蛋白溶液c。
53.(5)在无菌条件下，将100μl，50μg/ml的nsm蛋白溶液c滴加至磺化聚醚醚酮(s
‑
peek)表面使的nsm蛋白溶液充盈材料表面，
‑
20℃冻干2h，
‑
60
‑‑
80℃冷冻干燥24h，75％医用酒精浸泡2h杀菌，得到所述磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料。
54.图1为本实施例1中磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料的结构示意图。其中，1表示nsm蛋白，2表示磺化聚醚醚酮(speek)，3表示磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料。从图1可知，
nsm蛋白结合在磺化聚醚醚酮表面，形成紧密覆盖。
55.图2为实施例1所得的聚醚醚酮的sem实拍图；
56.图3为实施例1所得的聚醚醚酮经磺化、水热处理、干燥后不同放大倍数的sem实拍图；
57.图4为实施例1所得的磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料的sem实拍图；
58.图5为实施例1所得的nsm纳米蛋白经冻干、冷冻干燥后的sem实拍图；
59.图6为实施例1所得的nsm纳米蛋白三种不同浓度(分别对应50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的粒径大小图，由图可知三种不同浓度的nsm纳米蛋白其粒径皆是纳米级别；
60.图7为实施例1所得的磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料的ft
‑
ir图；
61.由数据图7ftir图可知，1050cm
‑1为s＝o的对称伸缩振动，1255cm
‑1为o＝s＝o的非对称伸缩振动；1109cm
‑1为多糖的吸收峰，2885cm
‑1为
‑
conh
‑
(酰胺键)的吸收峰，因此磺化聚醚醚酮表面存在大量磺化后产生的磺酸基团，而nsm纳米蛋白富含氨基，因此氨基和磺酸基之间可存在静电作用力而使得nsm纳米蛋白负载至磺化聚醚醚酮表面。
62.(6)将得到的磺化聚醚醚酮基骨修复复合材料置于48孔细胞培养板中，以聚醚醚酮(peek)、磺化聚醚醚酮(speek)为对照组，用于培养sd大鼠骨髓间充质干细胞；
63.图8为实施例1所得的sd大鼠骨髓间充质干细胞分别在聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上生长七天后的死活染色荧光染色图；
64.图9为实施例1所得的sd大鼠骨髓间充质干细胞分别在聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上生长24h后抗不同浓度过氧化氢(h2o2)的抗氧化应激示意图(p<0.05*,0.01<p<0.05**,p<0.001***)；
65.图10为实施例1所得的sd大鼠骨髓间充质干细胞分别在聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上生长7天、14天alp定性染色及21天ars定性染色，无论是alp定性还是ars定性，磺化聚醚醚酮骨修复复合材料皆是最好；
66.图11为实施例1所得聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上接种1
×
105金黄色葡萄球菌37℃恒温培养24h后稀释十倍后在600nm波长处的吸光度(吸光度大小代表细胞浓度)，由于，水热化处理条件并不能除去所有残存硫(具体见图15)，如果不进行水热化处理，残留硫浓度较高，将会导致sd大鼠骨髓间充质干细胞死亡，抗菌作用是指在进行水热化处理后残存的低浓度硫依旧具有抗菌能力磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料皆有一定的抗菌作用，因此，磺化聚醚醚酮的抗菌作用来源于残存硫的作用，磺化聚醚醚酮骨修复复合材料的抗菌作用来源于残存硫及nsm纳米蛋白的作用；
67.图12为实施例1所得的聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上接种1
×
105金黄色葡萄球菌，37℃恒温培养18h，稀释十倍后于琼脂固体培养基37℃培养18h后相机实拍图，磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料皆有一定的抗菌作用，与图11趋势符合良好；
68.图13为实施例1所得的聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料植入大鼠体内8周后组织切片染色图，可见磺化聚醚醚酮骨修复复合材料在大鼠体内植入后新骨生成较聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮优异；
69.图14为实施例1所得的聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮、磺化聚醚醚酮骨修复复合材料上水接触角示意图，由此可见，磺化使得聚醚醚酮水接触角降低，nsm蛋白的负载使得其水接
触角进一步降低，表示亲水性增加，从而细胞粘附性也会增加；
70.图15为实施例1所得的磺化聚醚醚酮表面eds能谱，图中具体表示为硫(s)谱。
71.总结：负载nsm蛋白的磺化聚醚醚酮(nsm
‑
50)较对照组相比，培养7天后，成骨细胞生长状态正常，成骨细胞生长数量明显增多，成骨细胞抗氧化应激明显；分别培养7、14天，成骨细胞分化能力显著增强；与对照组相比，金黄色葡萄球菌接种24h后，细菌数量明显下降，抗菌能力良好。
72.实施例2
73.同实施例1，区别在于，省略步骤(1)磺化聚醚醚酮的制备过程。
74.结果显示材料表面无3d网状结构，表面结构尽管经砂纸打磨，其表面依旧较为粗糙，表面有较多划痕。一般认为，3d网状结构由于其表面粗糙度增加，亲水性加强，因而有利于细胞的黏附，未经磺化处理的聚醚醚酮细胞数量明显少于磺化聚醚醚酮及负载nsm纳米蛋白的磺化聚醚醚酮材料。
75.实施例3
76.同实施例1，区别在于，省略步骤(1)磺化聚醚醚酮的制备过程中水热化处理步骤。
77.结果显示，sd大鼠骨髓间充质干细胞绝大部分死亡，无贴附、增殖、分化能力。
78.水热化处理步骤目的有两个，第一：去除残留的浓硫酸(因为残留浓硫酸的存在不利于细胞贴附、增殖、分化)；第二：水热化处理可稳定磺化聚醚醚酮表面的3d网络结构，以减少在后期实验中，3d网络结构的不稳定造成对细胞贴附、增殖、分化不利的影响。
79.若无水热化处理步骤，磺化聚醚醚酮材料残留硫酸会将绝大部分接种sd大鼠骨髓间充质干细胞杀灭，从而无法达到实验的目的，其次，磺化聚醚醚酮表面的3d网络结构也会由于不稳定而造成塌陷等一系列不良后果。
80.实施例4
81.同实施例1，区别在于，更换溶解液a为1mol/l的醋酸。
82.结果显示结果：溶解液ph较低无法满足提取本实验中nsm纳米蛋白充分提取的条件，其原因在于醋酸等酸性溶液会与含浦珠母贝中的含钙物质如碳酸钙等物质发生反应，不利于nsm纳米蛋白的提取以及后期的透析和浓缩。若采取酸性溶解液，其大部分会与碳酸钙等物质发生反应，因而会导致nsm纳米蛋白的产率大大降低，无法满足实验中浓度要求。
83.实施例5
84.同实施例1，区别在于，省略步骤(5)冻干过程，直接冷冻干燥得到产品。
85.结果显示制备的nsm纳米蛋白无法进行水份的去除，nsm纳米蛋白中不可溶性基质及可溶性基质将会无法负载至磺化聚醚醚酮表面，从而无法对其进行实验的处理和后期的表征。
86.实施例6
87.同实施例1，区别在于，合浦珠母贝贝壳层粉料更换为南美胎牛血清蛋白(fbs)。
88.结果显示：尽管南美胎牛血清蛋白(fbs)制备的材料其生物学相容性良好，但是其无促进成骨作用，所以体内外成骨性能并不好，且南美胎牛血清蛋白(fbs)价格较为昂贵，不利于大批量使用。本实验中nsm纳米蛋白提取自含浦珠母贝贝壳层，原料易得，价格低廉，提取简单、可大批量生产、生物相容性及生物成骨作用良好。
89.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。