一种基于环糊精接枝壳聚糖的疫苗、制备方法及应用

1.本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种基于环糊精接枝壳聚糖的疫苗、制备方法及应用。


背景技术：

2.壳聚糖(cs)是一种阳离子多糖，由β(1-4)连接的氨基葡萄糖和n-乙酰氨基葡萄糖组成，由自然界中含量最丰富的聚合物之一的甲壳素衍生而来，通过化学脱乙酰化作用得到。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，已广泛应用于医药、食品、化工、化妆品等领域。壳聚糖也被认为是一种潜在的疫苗佐剂，能够增强体液和细胞免疫。根据脱乙酰度的不同，壳聚糖具有不同数量的-nh2暴露，从而产生丰富的正电荷。这种阳离子多糖具有易于通过静电作用附着在带负电荷的细胞表面的优势，这可能在抗原摄取和递呈过程中发挥重要作用。壳聚糖的正电荷还可以提高壳聚糖与抗原混合时的佐剂性，包括抗原保护和抗原储库形成。此外，d-氨基葡萄糖重复单元c-2位置的-nh2基团质子化也提高了壳聚糖的溶解度，这对佐剂至关重要。壳聚糖作为一种运载工具除了具有这些优点外，还具有特殊的免疫刺激活性。已经证明，壳聚糖通过cgas-sting途径和nlrp3炎症小体诱导i型干扰素(ifn)分泌，导致树突状细胞(dc)激活和th1细胞免疫。壳聚糖包被溶酶体后，氨基的质子化引起质子海绵效应，可诱导内体逃逸并促进抗原的交叉呈递，这对于在与主要组织相容性复合体(mhc)i类分子相互作用后激发cd8+杀伤性t细胞尤为重要。
3.然而，壳聚糖只能在酸性条件下溶解，但在中性ph或生理条件下溶解性差，这是阻碍其生物医学应用的主要缺点。由于肿瘤细胞的粘蛋白1(mucin 1，muc1)的可变数量串联重复区(vntr)具有较差的免疫原性和t细胞非依赖性，因此，如何构建有效的疫苗结构提高muc1的免疫原性，是开发muc1疫苗的巨大挑战。


技术实现要素：

4.为了克服相关技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种环糊精接枝壳聚糖的疫苗佐剂及其在制备疫苗中的应用，对壳聚糖进行环糊精的修饰，能够增强壳聚糖的溶解能力，且能够用于“主客体”自组装，适用于更广泛的生物医药开发；进而增强疫苗的免疫原性，提高疫苗制剂的稳定性和溶解性。
5.具体技术方案：
6.作为本发明的一个方面，提供一种基于环糊精接枝壳聚糖的疫苗，使用环糊精接枝壳聚糖作为疫苗佐剂或疫苗载体，所述的环糊精接枝壳聚糖是通过环糊精以共价键合方式与壳聚糖连接。
7.在本发明可选的实施案例中，当所述使用环糊精接枝壳聚糖作为疫苗佐剂或疫苗载体时，抗原分子、免疫刺激剂或药物与所述环糊精接枝壳聚糖的疏水中心空腔通过自组装方式形成超分子结构。
8.在本发明可选的实施案例中，所述的环糊精接枝壳聚糖，其结构通式为：
[0009][0010]
其中，n为≥1的自然数。
[0011]
作为本发明的第二个方面，提供一种基于环糊精接枝壳聚糖的疫苗的制备方法，包含环糊精接枝壳聚糖的合成步骤、muc1多肽化合物的固相合成步骤以及将所述的环糊精接枝壳聚糖与muc1多肽化合物组装成纳米颗粒的步骤。
[0012]
在本发明可选的实施案例中，所述的环糊精接枝壳聚糖的合成步骤，包括：
[0013]
将β-环糊精溶解于双蒸馏水中以获得悬浮液；然后缓慢添加对甲苯磺酰氯，并在室温下搅拌混合物；再将20％w/v的naoh溶液添加入悬浮液，6小时后，通过过滤去除残余物；用稀盐酸将滤液的ph调节至7，并将溶液在4℃条件下保存以获得沉淀物；过滤沉淀物并进行再结晶，冷冻干燥，得到产物a，命名为β-cd-ots；
[0014]
将壳聚糖cs溶解于1％(v/v)乙酸中，得到壳聚糖溶液；将b-cd-ots的n，n-二甲基甲酰胺溶液添加到壳聚糖溶液中，根据壳聚糖cs和β-cd-ots的用量不同，获得不同接枝度的环糊精接枝壳聚糖；
[0015]
混合物在100℃下回流反应24小时，再用去离子水透析3天；最后，将溶液冷冻干燥，得到环糊精接枝壳聚糖的棉状粉末。
[0016]
在本发明可选的实施案例中，所述的muc1多肽化合物的固相合成步骤，包括：在固相树脂载体上将氨基酸从c端至n端依次连接，最后从固相载体上切割后得到muc1多肽化合物。
[0017]
在本发明可选的实施案例中，所述的muc1多肽化合物包括muc1、ada-acp-muc1或ada-acp-muc1(tn)。
[0018]
在本发明可选的实施案例中，所述的环糊精接枝壳聚糖与muc1多肽化合物组装成纳米颗粒的步骤，包括：将环糊精接枝壳聚糖完全溶解在乙酸溶液中，然后用naoh溶液调节其ph至4.5～6，分别加入muc1、ada-acp-muc1或ada-acp-muc1(tn)，室温搅拌，加入三聚磷酸钠溶液，室温搅拌后，用透析袋透析3d，分别得到cs-g-cd/muc1纳米颗粒、cs-g-cd/ada-acp-muc1纳米颗粒或cs-g-cd/ada-acp-muc1(tn)纳米颗粒。
[0019]
在本发明可选的实施案例中，所述环糊精为alpha、beta、gamma环糊精及其衍生物，优选为beta-环糊精及其衍生物。
[0020]
在本发明可选的实施案例中，其中抗原分子选自肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
[0021]
本发明提供的基于环糊精接枝壳聚糖的疫苗可用于制备预防或治疗癌症的药物。
[0022]
有益效果：
[0023]
(1)与传统的壳聚糖佐剂或壳聚糖载体相比，本发明提供的环糊精接枝壳聚糖，具有更好的溶解性能。
[0024]
(2)其上修饰的环糊精提供了“主客体”结合位点，更容易用于与抗原分子的相互作用，形成高稳定性的自组装超分子疫苗制剂，利于更好的体内投递和抗原储存，从而利于提高免疫刺激能力。
[0025]
(3)这种通过“主客体”自组装方式制备的疫苗制剂可以作为疫苗开发的一个平台，适用于更广泛的疫苗开发。
附图说明
[0026]
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0027]
图1为壳聚糖接枝环糊精的合成路线。
[0028]
图2(a)、(b)、(c)、(d)依次分别为壳聚糖、环糊精接枝壳聚糖产物1，环糊精接枝壳聚糖产物2，环糊精接枝壳聚糖产物3的核磁共振h谱，400mhz，cd3cood/d2o。
[0029]
图3为壳聚糖、β-环糊精、邻对甲苯磺酰-β-环糊精、壳聚糖接枝环糊精(ds＝16.69％)的ftir光谱。
[0030]
图4为muc1与环糊精接枝壳聚糖的疫苗设计。
[0031]
图5为透射电镜tem图：(a)壳聚糖纳米颗粒；(b)cs-g-cd/ada-acp-muc1(tn)纳米颗粒。
[0032]
图6为小鼠免疫结果：(a)不同天数小鼠血清中的抗体滴度；(b)第35天第1-3组小鼠血清的elisa检测od值与稀释度的曲线；(c)血清中不同抗体亚型的水平；(d)几种不同muc1多肽的竞争性elisa实验，多肽对血清中抗体的抑制率。
[0033]
图7为免疫小鼠血清中细胞因子ifn-γ和il-6的表达水平：(a)几组小鼠血清中ifn-γ的表达水平；(b)几组小鼠血清中il-6的表达水平。
[0034]
图8为elisa检测免疫小鼠血清中stn特异性抗体滴度：(a)od值与稀释度的曲线；(b)第1～4组小鼠血清中stn特异性抗体滴度值。
具体实施方式
[0035]
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0036]
需要说明的是，在肿瘤细胞上大量表达的肿瘤相关抗原是开发抗癌疫苗和免疫治疗的重要靶点。在taa中，muc1是一种高度糖基化的蛋白质，被认为是开发治疗性疫苗的排名第二的最有希望的靶点。muc1的细胞外部分具有20个氨基酸核心序列的可变数量串联重复区(vntr)(hgvtsapdtrpapgstapa，氨基酸序列)。通常在muc1上表达有肿瘤相关糖类抗原t、tn、stn等。
[0037]
环糊精接枝度定义为：接枝了环糊精的糖单体数占所有糖单体数的百分比。
[0038]
本发明实施例中所采用的试剂来源除了另有特殊规定的以外，均可以通过市售方
式购买得到。
[0039]
实施例1：合成环糊精接枝壳聚糖(cs-g-cd)
[0040]
合成路线，参见图1。将β-环糊精(50.0g)溶解于200ml双蒸馏水中以获得悬浮液；然后缓慢添加对甲苯磺酰氯(15.0g)，并在室温下搅拌混合物。20％w/v naoh溶液(50ml)添加入悬浮液6小时后，通过过滤去除残余物。用稀盐酸将滤液的ph调节至7，并将溶液置于4℃过夜以获得沉淀物。过滤沉淀物并进行再结晶以获得沉淀物，将沉淀物冷冻干燥以得到即为β-cd-ots。
[0041]
壳聚糖cs(1.00g)溶解于1％(v/v)乙酸(80ml)中。将β-cd-ots(1.00-5.00g)的n，n-二甲基甲酰胺(dmf，40ml)溶液添加到壳聚糖溶液中，根据不同的比例，获得不同接枝度的环糊精接枝壳聚糖。反应混合物在100℃下回流24小时，用去离子水透析3天。最后，将溶液冷冻干燥，得到环糊精接枝壳聚糖(cs-g-cd)的棉状粉末(图1)。
[0042]
对环糊精接枝壳聚糖(cs-g-cd)进行结构表征，核磁共振h谱(图2)显示，环糊精成功接枝到壳聚糖上，根据反应底物的比例不同，获得了3种不同接枝度的环糊精接枝壳聚糖(产物1，产物2，产物3)。
[0043]
产物1～3的接枝度分别为3.01％，10.7％，16.69％。
[0044]
进一步，通过傅里叶变换红外光谱进行检测，其结果如图3。从红外谱可知，对于β-cd-ots，1594.39cm-1
是芳基苯环上的c＝c延伸，1156.06cm-1
是磺酰基的s＝o延伸，表明成功合成了取代的对甲苯磺酰基环糊精。至于cs-g-cd，分别为1651.79cm-1和1359.57cm-1
对应于cs上乙酰氨基葡萄糖基的c＝o和c-o伸缩振动；1148.24cm-1和1075.18cm-1对应于cs上的c-o-c。949.95cm-1处的新峰是β-cd的α-吡喃基振动的特征峰，证明环糊精成功接枝到壳聚糖上。
[0045]
实施例2：muc1多肽化合物的合成
[0046]
muc1多肽化合物的合成通过r.bruce merrifield所提出的固相合成策略，其过程是通过在固相树脂载体上将氨基酸从c端至n端依次连接，最后从固相载体上切割后得到多肽。
[0047]
muc1、金刚烷修饰的muc1(ada-acp-muc1)、和金刚烷修饰的muc1(tn)(ada-acp-muc1(tn))多肽化合物(多肽结构如图4所示)。其中，acp为6-氨基己酸连接臂，tn为糖基化修饰，合成的具体方法如下：
[0048]
1、树脂溶胀，称取一定负载量fmoc-ala-oh wang树脂(0.05mmol)置于10ml多肽固相合成管中，加入6ml n，n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液，溶胀3h，抽干溶剂，用dmf和dcm各洗涤3遍；
[0049]
2、脱除fmoc保护基，由于所使用的wang树脂预先负载了第一个fmoc保护n端的氨基酸，因此需要脱除fmoc保护基，裸露出氨基。20％哌啶(pip，溶剂为dmf)溶液作为脱除试剂，加入6ml至合成管中，震荡15min，抽去溶液，dmf洗涤一次，再加入6ml溶液震荡10min，抽去溶液后用dmf洗涤树脂6次，最后抽干洗涤溶液；
[0050]
3、氨基酸偶联，偶联操作使用fmoc保护的氨基酸作为原料，o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)作为缩合剂，1-羟基苯并三唑(hobt)作为防消旋剂，n，n-二异丙基乙胺(dipea)作为缚酸剂，在dmf溶液中进行反应。具体方法为3.0eq.氨基酸，3.0eq.hbtu，3.0eq.hobt，6.0eq.dipea(以树脂上裸露氨基为1eq.)溶于6ml dmf后加入合成管，震荡2h，
若缩合需要使用糖基氨基酸则改为2.0eq糖基氨基酸，2.0eq.2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)，2.0eq.n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)，4.0eq.dipea震荡4h。之后抽干溶液，dmf洗涤树脂3次，最后抽干洗涤溶液；
[0051]
4、步骤2，3依次循环直至金刚烷修饰的多肽合成完成。其中，ada-acp-muc1和ada-acp-muc1(tn)多肽的合成中，多肽序列的合成结束后，继续偶联6-氨基己酸(即acp连接臂)，随后，n端金刚烷(adamatan，ada)的修饰使用金刚烷甲酸，使用通用的氨基酸偶联策略进行修饰。在每一步脱除fmoc和氨基酸偶联的步骤后，都可以采用茚三酮检测，取少量抽干的树脂加入1.5ml离心管，将茚三酮工作液以a液∶b液∶c液＝2∶3∶1的体积加入离心管，沸水中加热2min，若有裸露氨基则树脂呈蓝色，若没有裸露氨基树脂呈无色或黄色；
[0052]
5、多肽切割，合成完成的树脂使用dmf，dcm各洗涤3遍，抽干后，按照每100mg树脂使用1ml切割试剂进行切割，切割试剂配比为三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶水＝95∶2.5∶2.5(tfa∶tls∶h2o＝95∶2.5∶2.5)，将树脂置于切割试剂中搅拌2h，过滤弃掉树脂，残留液体中加入10倍体积量的冰乙醚进行沉淀，在离心机中以10000r
·
min-1的速度离心5min除去上清，得到粗品肽。若粗品肽中含有糖基氨基酸，粗肽溶于5％水合肼并反应3h脱除羟基上的乙酰保护基；
[0053]
6、粗品肽的纯化，粗品肽使用水∶乙腈＝50∶50的混合溶剂进行溶解，通过0.22μm滤膜过滤后，通过半制备型hplc进行分离，收集到的组分冷冻干燥后得到纯品多肽。hplc使用的流动相a为水+0.1％tfa，流动相b为乙腈加0.1％tfa。其中多肽1多肽2半制备液相方法为：流速4ml
·
min-1
，在20min内乙腈含量由22％升高至35％；多肽3半制备液相方法为：流速4ml
·
min-1
，20min内乙腈含量由27％升高至40％。随后使用分析型hplc检测目标多肽纯度，分析型液相方法为：流速1ml
·
min-1
，20min内乙腈含量由10％升至90％。通过质谱手段鉴定目标产物。
[0054]
合成了一系列的muc1多肽。合成的ada-acp-muc1、ada-acp-muc1(tn)多肽化合物的ada部分能够与β-环糊精接枝壳聚糖(cs-g-cd)的疏水中心空腔形成“主客体”自组装的稳定结构。
[0055]
实施例3环糊精接枝壳聚糖与muc1多肽化合物(即muc1抗原)组装成纳米颗粒
[0056]
本实施例构建了muc1与环糊精接枝壳聚糖的疫苗制剂，如图4所示。本实施例采用的环糊精接枝壳聚糖为接枝度较高的产物3，接枝度为16.69％。
[0057]
将cs-g-cd和几种不同的muc1抗原进一步组装成纳米颗粒，即：将环糊精接枝壳聚糖(产物3，cs-g-cd)用乙酸配置成1mg/ml的溶液中，然后用0.1m naoh溶液调节其ph至4.5，搅拌1h；随后，分别加入上述多肽化合物muc1、ada-acp-muc1、ada-acp-muc1(tn)，室温搅拌，加入三聚磷酸钠溶液(1mg/ml，0.29ml)，室温搅拌1h后，用7000da透析袋透析3d，得到纳米颗粒。具体如下：
[0058]
1.cs-g-cd/muc1：将cs-g-cd用1％的醋酸溶液配置成1mg/ml的溶液，取2.9ml上述溶液，用0.1m naoh调节ph＝4.5。随后，加入3.8mg muc1，将去离子水配置的三聚磷酸钠溶液(1mg/ml，0.29ml)加入反应体系中，室温搅拌1h后，用7000da的透析袋对去离子水透析3d，得到纳米颗粒。
[0059]
2.cs-g-cd/ada-acp-muc1：将cs-g-cd用1％的醋酸溶液配置成1mg/ml的溶液，取2.9ml上述溶液，用0.1m naoh调节ph＝4.5。随后，加入4.0mg ada-acp-muc1，室温搅拌过
夜，将去离子水配置的三聚磷酸钠溶液(1mg/ml，0.29ml)加入反应体系中，室温搅拌1h，用7000da的透析袋对去离子水透析3d，得到纳米颗粒。
[0060]
3.cs-g-cd/ada-acp-muc1(tn)：将cs-g-cd用1％的醋酸溶液配置成1mg/ml的溶液，取2.9ml上述溶液，用0.1mnaoh调节ph＝4.5。随后，加入4.2mg ada-acp-muc1(tn)，室温搅拌过夜，将去离子水配置的三聚磷酸钠溶液(1mg/ml，0.29ml)加入反应体系中，室温搅拌1h，用7000da的透析袋对去离子水透析3d，得到纳米颗粒。
[0061]
纳米颗粒是通过cs-g-cd带正电的氨基和带负电的三聚磷酸钠(tpp)作为交联剂之间的离子凝胶自发产生的。
[0062]
实施例4：纳米颗粒的表征
[0063]
通过透射电镜(tem)和动态光散射(dls)对纳米颗粒进行了表征，参加图5，表1。根据dls结果，第1组、第2组和第3组的纳米颗粒尺寸分别为91.28nm、97.79nm和129.0nm。与不含muc1的cs-g-cd纳米粒子的尺寸(80.71nm)相比，这些尺寸明显增大。cs-g-cd纳米颗粒的zeta电位为23.7mv，这主要是由cs的氨基质子化引起的，而第1-3组的zeta电位均为正值，这一结果表明，纳米颗粒可以稳定地分布在溶液中。tem表征进一步证实了纳米粒子的形貌，表明纳米粒子的粒径约为100nm，形貌为不规则球形。粒径范围在20到200纳米之间的纳米颗粒很容易树突状细胞吞食，并且可以直接靶向淋巴结。
[0064]
表1.纳米颗粒疫苗的尺寸和电位
[0065][0066]
实施例5 muc1与环糊精接枝壳聚糖的疫苗制剂免疫活性研究
[0067]
为了评价疫苗的体内免疫原性，三组c57bl/6j小鼠被用于体液免疫和细胞免疫的研究。将上述制备的含有muc1抗原的cs-g-cd纳米粒与弗氏完全佐剂进一步乳化，作为小鼠免疫的疫苗制剂。在第1天、第7天、第14天、第21天和第28天，通过皮下注射(s.c.)给每只小鼠接种15nmol muc1抗原的100μl乳剂。从第0、7、14、21、28和35天通过大腿静脉采集的小鼠血液制备抗血清，用于分析抗体和细胞因子。使用相应的muc1-hsa结合物作为捕获试剂，通过酶联免疫吸附试验(elisa)测定muc1特异性抗体滴度。通常，抗原包被的elisa平板用封闭缓冲液处理，然后在pbs中与1∶300至1∶218700的半对数连续稀释的小鼠抗血清孵育。洗涤后，将hrp连接的山羊抗小鼠(h+l)、igg1、igg2b、igg2c、igg3和igm第二抗体分别添加到平板上。最后，将平板与tmb溶液反应，然后在450nm波长下通过酶标仪进行检测。根据光强度(od)与血清稀释数的曲线计算抗体滴度，当od值达到0.2时的稀释度定义为抗体滴度。
[0068]
图6(a)显示了在不同天数从1-3组小鼠收集的抗血清的抗体滴度，随着免疫次数的增加，抗原特异性抗体滴度增加，并在第五次增强针后达到最高水平。从图6(b)可以看出，第3组在第35天的抗体滴度达到18550，远远高于其他两组，这表明第3组疫苗具有最好的免疫原性。参见图6(c)分析了第1-3组产生的抗体亚类，各组均能诱导igg2b、igg2c和
igg3的高抗体滴度，这表明以cs-g-cd为载体的疫苗成功诱导t细胞介导的免疫。t细胞免疫可能是由cs-g-cd载体引起的，当抗原由apcs呈递时，cs-g-cd载体有可能诱发sting免疫活性并诱导充分的交叉呈递。此外，第2组的抗体滴度高于第1组，这表明抗原与cs-g-cd之间的主客体相互作用提高了疫苗的免疫原性。为了进一步确认抗体的特异性，使用相应的muc1肽作为针对涂于平板上的抗原的抑制剂进行竞争elisa。图6(d)的结果表明，muc1抗原可以成功识别和抑制疫苗诱发的第1-3组抗体。
[0069]
为了进一步研究t细胞介导的免疫应答，通过细胞因子elisa分析血清中ifn-γ和il-6的表达水平。通常，ifn-γ是一种具有重要免疫调节特性的th1型细胞因子，可增殖和分化淋巴细胞群，激活nk细胞并增强抗原呈递。而il-6是一种th2型细胞因子，可改善先天性和适应性免疫，介导b细胞和t细胞反应的各个方面，并促进抗体的产生。如图7所示，与第1组和第2组相比，第3组产生的ifn-γ水平最高，这表明第3组的疫苗结构具有最强的th1型免疫应答。这是由第3组中抗原与cs-g-cd之间的特异性“主客体”自组装结构所引起，进一步表明cs-g-cd的“主客体”包合作用对诱导强烈的th1免疫很重要。然而，第1组和第3组的il-6水平相似，但高于第2组。这可能受到多种因素的影响，包括cfa佐剂、抗原和cs-g-cd载体。
[0070]
对比例：stn-bsa-ada与环糊精接枝壳聚糖的疫苗的免疫活性研究
[0071]
根据已有技术路线[chem.commun.，2020，56，1395，doi：10.1039/d0cc05263a]，制备获得肿瘤相关糖抗原stn与载体蛋白牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)的偶联物，并在该偶联物上修饰金刚烷结构ada(即stn-bsa-ada)，根据质谱定量，每个bsa分子上平均偶联了4.3个stn抗原，平均偶联了5个ada化学结构。不同接枝度的cs-g-cd(接枝度分别为3.01％，10.7％，16.69％)充分溶解在乙酸溶液中，然后用0.1m naoh调节至ph 4.5，搅拌1h，制备为cs-g-cd浓度为1mg/ml的溶液；随后，分别加入制备的3.0mg stn-bsa-ada偶联物，室温200rpm搅拌，过夜形成纳米颗粒。所得纳米颗粒溶液与弗氏完全佐剂(体积比1∶1)混合后作为疫苗用于小鼠免疫。小鼠免疫剂量为每次每只小鼠注射stn糖抗原3μg。
[0072]
设置4组小鼠免疫实验：第一组为stn-bsa偶联物；第二组为stn-bsa-ada与cs-g-cd(3.01％接枝度)所制备的疫苗；第三组为stn-bsa-ada与cs-g-cd(10.7％接枝度)所制备的疫苗；第四组为stn-bsa-ada与cs-g-cd(16.69％接枝度)所制备的疫苗。
[0073]
在第1天、第7天、第14天和第21天，通过皮下注射(s.c.)给每只小鼠接种含有3μg stn抗原的100μl乳剂。从第0、7、14、21和28天通过大腿静脉采集的小鼠血液制备抗血清，用于分析抗体。使用stn-hsa偶联物作为捕获试剂，通过酶联免疫吸附试验(elisa)测定stn特异性抗体滴度。
[0074]
stn特异性抗体滴度结果如图8所示。从结果中可以看出，第二、三、四组小鼠血清中stn特异性抗体滴度均比第一组stn-bsa对照组的滴度高。该结果说明，cs-g-cd对stn-bsa-ada的免疫原性具有增强作用，提高了stn特异性抗体滴度。同时，可以看到，第二组的抗体滴度最高，随着接枝度的增加，抗体滴度有一定的下降。该结果说明，环糊精的接枝度越高，虽然提高了对抗原物质的“主客体”包合能力，但是会影响壳聚糖本身的免疫刺激能力，因而需要选择一个合适的环糊精接枝度。
[0075]
综上所述，cs-g-cd具有较强的免疫刺激能力，能够用于疫苗佐剂或疫苗载体，环糊精接枝壳聚糖所形成的主客体自组装结构能够增强疫苗的免疫原性，提高疫苗制剂的稳
定性和溶解性，对疫苗制剂的开发具有很高的应用价值。
[0076]
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。