一种用于糖尿病心肌病的核酸药物及其应用

1.本发明属于基因工程及心脑血管疾病治疗技术领域，具体涉及一种用于糖尿病心肌病的核酸药物及其应用。


背景技术：

2.糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，dcm)是一种特殊类型的心脏疾病，是指发生于糖尿病患者，不能用于高血压性心脏病，冠状动脉粥样硬化性心脏病，心脏瓣膜病及其他心脏病变来解释的特异性心肌病。即糖尿病患者即使没有高血压和缺血性心脏病等疾病，心脏结构和功能仍可能发生变化。糖尿病心肌病通常以左心室肥厚和舒张功能减退为早期表现，最后可诱发心力衰竭、心率失常及心源性休克，重症患者甚至猝死。dcm的发病过程涉及肾素血管紧张素-醛固酮系统激活，氧化应激，内质网应激，线粒体功能障碍，炎症反应，自噬，细胞凋亡，微血管功能障碍等病理生理过程。高血糖、胰岛素抵抗和代谢紊乱等可以通过各种机制可最终导致心脏功能受损。根据美国心脏病学会基金会(accf)和美国心脏协会(aha)联合制订的最新版心力衰竭治疗指南中指出，糖尿病心肌病患者的预后较差且目前尚无较好的治疗药物。由于对糖尿病心肌病特有的发病机制研究滞后，制约了针对有效靶点进行的新药研发。从糖尿病心肌病的信号调控网络中寻找关键的分子靶点，有望为防治该疾病的新药筛选/设计或基因治疗提供新的途径和思路。
3.糖基化终末产物(advanced glycationend products，ages)是以蛋白质、脂质及还原糖为原料，发生非酶催化反应，生成的稳定共价化合物。研究发现ages可在心肌细胞代谢过程中产生大量内源性抗氧化物质，引起心肌细胞能量代谢损伤，另外ages还可激活细胞程序性死亡通路，心肌细胞丢失导致心功能衰竭。
4.环状rna(circular rna，circrna)是人类和小鼠的基因转录产物中从mrna前体经由特殊的选择性剪切产生且在真核细胞中广泛表达的环形内源性rna分子。circrna没有polya尾，能抵抗rnaase的降解作用并稳定存在。circrna的形成有以下两种模式：1)套索驱动的环化模型——由1个外显子3'端的剪接供体和另1个外显子的5'端剪接受体共价结合后再切除内含子而形成；2)内含子配对驱动的环化模型——内含子可通过自身环化而形成circrna。近年来，对circrna的探究使人们重新认识了rna所发挥的功能。研究发现，circrna主要是发挥microrna分子“海绵”的作用，并通过调控基因的表达参与了多种细胞生理过程。目前，研究最著名的circrna当属cdr1as，该circrna的序列中具有63个mir-7结合位点，能通过强效募集mir-7、抑制其基因调控功能发挥抗肿瘤、神经细胞调控等效应。此外，来源于hipk3基因的外显子2的circhipk3具备吸附9个mirna的18个结合位点，直接结合mir-124并抑制mir-124的活性，调控细胞增殖。最新研究发现，心脏相关环状rna(heart-related circrna，hrcr)能通过吸附mir-223抑制心肌重构和延缓心衰病程。然而，目前尚无文献报道心脏circrna的表达在糖尿病心肌病发病和发展中的作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供了一种用于糖尿病心肌病的核酸药物及其应用，本发明首先通过构建四氧嘧啶所致糖尿病小鼠模型，研究发现糖尿病诱导循环相关环状rna(diabetes induced circulation related circrna-junction sequence,dicar)过表达后对于糖尿病心肌病具有显著的改善作用，提示dicar对于糖尿病心肌病具有重要作用；进一步利用糖尿病心肌细胞模型，发现经人源性has-circ-0131202和鼠源性mm9-circ-008009的junction domain，即hdicar-jd和mdicar-jd给药后，能够明显地抑制ages诱导的心肌细胞焦亡，对临床上新药研发方面具有重要参考指导意义，为临床上使用circrna治疗糖尿病心肌病提供了重要依据。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供了一种用于糖尿病心肌病的核酸药物，所述核酸药物包括：hdicar-jd和/或mdicar-jd；其中，
8.所述hdicar-jd的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；
9.所述mdicar-jd的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示。
10.进一步地，所述hdicar-jd为人源性环状rna has-circ-0131202的junction domain。
11.进一步地，所述mdicar-jd为鼠源性环状rna mm9-circ-008009的junction domain。
12.本发明还提供了所述核酸药物在制备用于治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。
13.进一步地，所述核酸药物的浓度为10～50nm。
14.进一步地，所述核酸药物的最佳浓度为20nm。
15.进一步地，所述核酸药物可改善由于糖尿病导致的心腔增大、心肌细胞肥大以及心肌纤维化。
16.进一步地，所述核酸药物通过抑制心肌细胞焦亡，达到治疗糖尿病心肌病的作用。
17.进一步地，所述核酸药物hdicar-jd具有抑制人心肌细胞中gsdmd、asc、caspase1表达的作用。
18.进一步地，所述核酸药物mdicar-jd具有抑制小鼠心肌细胞中gsdmd、asc、caspase1、nlrp3表达的作用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.(1)本发明提供了一种用于糖尿病心肌病的核酸药物及其应用，本发明首先通过构建糖尿病小鼠模型，研究发现dicar过表达对于糖尿病心肌病具有显著的改善作用，提示dicar对于糖尿病心肌病具有重要作用；进一步对人源性和鼠源性dicar：has-circ-0131202和mm9-circ-008009进行结构分析，并利用糖尿病心肌细胞模型，发现经has-circ-0131202和mm9-circ-008009的junction domain，即hdicar-jd和mdicar-jd给药后，能够明显抑制ages诱导的心肌细胞焦亡。证明所述核酸药物hdicar-jd和mdicar-jd具有治疗糖尿病心肌病的作用，这为糖尿病心肌病的治疗和核酸药物的开发应用提供了帮助，为临床上使用circrna治疗糖尿病心肌病提供了重要依据。
21.(2)本发明所述的核酸药物作为新型药物分子，具有高亲和力、高特异性、易合成修饰、设计灵活等优点，为核酸药物广泛应用于医药领域提供了帮助。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中小鼠心脏组织wga染色结果图；
23.图2为本发明实施例1中小鼠心脏组织masson染色结果图；
24.图3为本发明实施例2中对人源性和鼠源性dicar的结构分析图；
25.图4为本发明实施例2中dicar-vcp结合模型分析图；
26.图5为本发明实施例2中dicar和vcp之间的动力学速率常数分析结果；
27.图6为本发明实施例3中人心肌细胞(hcm)在不同剂量的核酸药物hdicar-jd处理后，细胞焦亡相关蛋白的表达情况；
28.图7为本发明实施例3中鼠心肌细胞(mcm)在不同剂量的核酸药物mdicar-jd处理后，细胞焦亡相关蛋白的表达情况。
具体实施方式
29.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1 dicar过表达对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的影响
31.为验证dicar对于糖尿病心肌病的作用，采用四氧嘧啶构建糖尿病小鼠模型，并使dicar过表达，观察过表达前后小鼠心脏功能组织变化，具体如下：
32.1、造模与分组
33.采用crispr/cas9基因编辑技术使dicar在小鼠中过表达，得到dicar-tg小鼠(采用crispr/cas9基因编辑技术，建立mm9-circ-008009基因过表达系统，建立mm9-circ-008009过表达的db/db小鼠)，以探索dicar对dcm的保护作用，具体方法为：
34.取野生型和dicar-tg的c57bl/6小鼠各20只，spf级，雌雄各半，体重(20
±
2)g，采用高脂饮食1月，造模前禁食12h，野生型和dicar-tg组均分别随机抽取10只作为空白对照组(wt)和dicar过表达组(dicar-tg)，其余20只小鼠分别腹腔注射四氧嘧啶60mg/kg，并持续用高脂饮食。血糖大于7.8mmol/l、ogtt2小时血糖≧11.1mmol/l为模型建立成功。
35.即分组为：空白对照组wt，糖尿病模型组wt+t2dm，dicar过表达组dicar-tg，以及dicar过表达后进行糖尿病造模组dicar-tg+t2dm。
36.2、评价方法
37.通过对小鼠进行多普勒超声心动图检测评价心功能；对小鼠心脏组织进行麦胚凝集素(wheat germ agglutnin，wga)染色评价心肌重构；采用masson(masson-trichrome staining)染色法，并计算心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，cvf)来评价心肌胶原沉积。
38.3、结果与分析
39.(1)dicar对小鼠心功能的影响
40.表1小鼠患2型糖尿病6个月后的心脏功能参数
[0041][0042][0043]
*
p《0.05,
**
p《0.01,
***
p《0.001vs.wt；n＝5.
[0044]
采用心脏多普勒超声心动图分别评估wt+t2dm、dicar-tg、dicar-tg+t2dm组小鼠与同龄wt组小鼠心功能及结构变化。结果显示，与wt组相比，wt+t2dm组小鼠心腔变大，lvid.d(左心室舒张末期内径)增大至4.14
±
0.24mm，lvid.s(左心室收缩末期内径)增大至3.14
±
0.20；wt+t2dm组小鼠lvedv(左心室舒张末期容积)增大至73.40
±
11.19，lvesv(左心室收缩末期容积)增大至33.38
±
10.72，而lvef(左心室射血分数)减弱至48.42
±
7.30，fs(左心室短轴缩短率)减弱至24.27
±
4.52。多普勒超声心动图检测结果提示，相较于空白对照组wt，糖尿病模型组wt+t2dm小鼠心脏结构出现异常，心脏收缩功能发生障碍。然而，相比于wt+t2dm组，dicar-tg+t2dm组小鼠中，以上情况均发生了明显地改善，即dicra过表达后使得小鼠的心腔有所缩小，lvef和fs有所增强。以上结果提示，dicar对糖尿病小鼠心脏功能的重要意义。
[0045]
(2)小鼠心脏组织wga染色
[0046]
采用wga染色用于评估心肌重构，心肌细胞肥大程度，结果如图1所示，结果显示，wt+t2dm组与wt组相比，其心肌细胞明显肥大，而dicar-tg+t2dm组相较于wt+t2dm组有明显改善，提示了dicar对于糖尿病小鼠心脏组织变化具有重要意义。
[0047]
(3)小鼠心脏组织masson染色
[0048]
采用masson染色评估心肌胶原沉积，并计算心肌胶原容积分数，结果如图2所示。结果显示，相较于空白对照组wt，wt+t2dm组中小鼠心肌切片上心肌纤维化严重，而dicar-tg+t2dm组对此现象有明显改善，同时胶原容积分数统计结果显示：wt+t2dm组小鼠胞外胶原容积分数为8.18
±
0.99％，是同周龄wt组的4倍左右，纤维化程度增加；而dicar-tg+t2dm组小鼠胞外胶原容积分数为3.8
±
0.46％，纤维化程度较wt+t2dm组小鼠大大改善。
[0049]
以上结果都显示出dicar对糖尿病心肌病的重要作用，提示其具有治疗糖尿病心肌病的作用。
[0050]
实施例2核酸药物的发现
[0051]
根据实施例1的结果，dicar对于糖尿病心肌病具有重要作用，而人源性dicar：has-circ-0131202和鼠源性dicar：mm9-circ-008009是重要的dicar，在此基础上对其结构进行分析，用于制备更易于合成的小分子核酸药物。
[0052]
1、当软件识别出dicar的第二个结构时，连接域显示了特定的手指形状(如图3所示)。因此，我们推测dicar是否可以直接调节蛋白质活化。dicar结构域和蛋白质之间可能存在相互作用。为了探索dicar在心功能障碍中的机制，采用chirp质谱(chirp-ms)来鉴定与dicar相互作用的结合蛋白。生物素标记的dicar连接位点探针被纯化，并通过与原代小
鼠心肌细胞(mcm)裂解物孵育进行circrna下拉分析，然后进行质谱检测。检测到50种显着的蛋白质，其中含有valosin的蛋白质(vcp)是根据独特肽段和序列覆盖度得分最高的蛋白质。
[0053]
为了进一步探索dicar-vcp结合模型，采用一个完整的基于结构的计算框架rosetta-vienna rnp-δδg，用于预测dicar-vcp相对结合亲和力，将基于二级结构的未结合rna自由能能量计算结合在一起以及结合dicar-vcp复合物的统一能量函数。如图4所示，在对接区，dicar的rna二级结构(19bp)通过氢键、盐桥、氨基酸残基侧链网络和静电模型与vcp蛋白的氨基酸残基结合。此外，为了验证dicar和vcp的结合亲和力，我们合成了dicar连接文件(dicar-jd)的19bp片段。使用spr分析测量了不同浓度的dicar-jd和vcp之间的动力学速率常数，如图5所示。结果显示，dicar-jd的结合常数(kd)为5.4x10-9
。上述结果表明dicar能够通过连接片段结合vcp，而dicar-jd是dicar结合vcp对dcm发挥作用的关键片段。
[0054]
2、方法
[0055]
通过rna纯化-质谱法分离染色质(chirp-ms)，具体如下：
[0056]
心脏组织带有预冷却的pbs缓冲液，在室温下与3％甲醛在端到端振荡器上交联30分钟。用125mm甘氨酸淬灭交联5分钟，以1000rcf旋转3分钟并丢弃上清液，用冷却的pbs清洗组织两次。以最高速度旋转，将上清液转移到2倍体积的杂交缓冲液中，充分混合并在37℃下孵育。将探针(4for tt,1for nc and pc,100pmol per 2
×
107cells)预结合到链霉亲和素珠上30分钟，洗掉未结合的探针，并与细胞裂解液混合，在37℃下杂交过夜端到端摇床。用1ml预热洗涤缓冲液洗涤珠子五次，每次洗涤5分钟。在最后一次洗涤时，转移1/20珠用于qpcr分析。加入100μl洗脱缓冲液、20u benzonase，37℃洗脱蛋白1小时。将上清液转移到新的低结合eppendorf管中。用100μl洗脱缓冲液清洗珠子一次，合并两份上清液。在95℃下反向交联样品，在4℃2h下用0.1％sdc和10％tca沉淀蛋白质。以最高速度旋转，用预冷的80％丙酮洗涤颗粒3次。蛋白质被消化后，对于每个样品，约1/2的肽被分离并用与q-exactive质谱仪(thermo finnigan)耦合的nano-uplc(easy-nlc1200)进行分析。使用反相柱(100μm，内径
×
15cm，reprosil-pur 120 c18-aq，1.9μm，dr.math)进行分离。流动相是含有0.1％fa、2％acn(a相)和80％acn、0.1％fa(b相)的h2o。以300nl/min的流速以120分钟的梯度进行样品分离。梯度b：8到30％持续92分钟，30到40％持续20分钟，40到100％持续2分钟，100％持续2分钟，100到2％持续2分钟，2％持续2分钟。使用orbitrap分析仪以轮廓和正模式进行数据相关采集，分辨率为70,000(@200m/z)，ms1的m/z范围为350-1600；对于ms2，分辨率设置为17,500，具有动态第一质量。ms1的自动增益控制(agc)目标设置为1.06，最大it100毫秒，ms2设置为5.04，最大it200毫秒。前10个最强的离子被hcd裂解，归一化碰撞能量(nce)为27％，隔离窗口为2m/z。动态排除时间窗口为20秒。
[0057]
实施例3核酸药物的制备及其对糖尿病心肌病的影响
[0058]
1、根据实施例2，设计出相应的核酸药物，分别为：
[0059]
hdicar-jd：
[0060]
caacctccggggccacaatagcgagatttgtaagactccagggcctcccag(如seq id no.1所示)
[0061]
mdicar-jd：
[0062]
caacctgcgaggccacaacagtgagagttgtaagagtccatccaggaccttc(如seq id no.2所
like protein containing a card)诱导caspase1依赖的细胞焦亡。细胞焦亡过程中，gsdmd、asc、caspase1、nlrp3表达均上升。
[0075]
利用image j软件进行统计分析，其中人心肌细胞(hcm)在不同剂量的核酸药物hdicar-jd处理后，细胞焦亡相关蛋白的表达情况如图6所示；鼠心肌细胞(mcm)在不同剂量的核酸药物mdicar-jd处理后，细胞焦亡相关蛋白的表达情况如图7所示。
[0076]
结果显示，经hdicar-jd处理后，逆转了ages处理所造成的人心肌细胞的焦亡，gsdmd、asc和caspase1的表达均降低，说明了hdicar-jd具有抑制心肌细胞焦亡的作用，其中20nm的hdicar-jd效果最好。
[0077]
同样的，经mdicar-jd处理后，逆转了ages处理所造成的鼠心肌细胞的焦亡，gsdmd、asc、caspase1和nlrp3表达均降低，说明了mdicar-jd具有抑制心肌细胞焦亡的作用，并且也是20nm的mdicar-jd效果最好。
[0078]
以上结果显示出本发明制备得到的核酸药物dicar-jd是dicar发挥作用的重要片段，可以明显地抑制心肌细胞的焦亡，对糖尿病心肌病具有重要作用。因此，该核酸药物具有治疗糖尿病心肌病的作用，将此核酸药物投入实践，可以帮助进一步的个体化治疗。
[0079]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。