一种三肽化合物及其铜离子螯合物的应用新指征的制作方法

1.本发明涉及急性及慢性支气管哮喘的治疗领域，尤其涉及一种基于三肽化合物及其铜离子螯合物在支气管哮喘治疗中的应用，特别涉及通过抗炎，免疫调节，抗氧化及逆转上皮细胞间充质化现象，进而在急性及慢性支气管哮喘中起保护性作用。


背景技术：

2.哮喘是以气道高反应性、炎症和气道重塑为特征的慢性气道疾病，显著的病理特征包括气道周围嗜酸性或嗜中性粒细胞炎症、上皮下纤维化、气道平滑肌增厚、粘液高分泌和杯状细胞增生和化生等。
3.过去认为气道重塑是长期气道慢性炎症的结果，如今这一观念有所改变，气道重塑被认为与气道慢性炎症在疾病发展过程中是相平行的。气道重塑造成了哮喘患者持续性的肺功能降低。在气道重塑的病理过程中，上皮-间质转化(emt)被认为是粘膜成纤维细胞和成肌纤维细胞增加、胶原过度生成和纤维化的机制之一，此外基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，mmps)/金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，timps)失衡介导的细胞外基质(ecm)降解减少也参与纤维化的形成。tgf-β1(transforming growth factor-β1)信号通路在气道重塑过程中占据重要地位。tgf-β1与受体结合后通过smad依赖性或非smad依赖性途径传递信号，其中tgf-β1/smad 2/3通路被认为是诱导emt发生的“主开关”。有研究显示，tgf-β1介导的emt修复过程失调参与促进哮喘患者的异常上皮细胞纤维化，从而最终造成气道重塑和肺功能损害。
4.气道活性氧化剂(ros)增多促进加重了过敏性哮喘的炎性应答和气道高反应性。过敏原进入气道后，树突细胞向cd4
+
t细胞呈递抗原，cd4
+
t细胞激活并产生il-4，il-5和il-13。il-5促进嗜酸性粒细胞的活化从而介导ros的产生增多，而il-4诱导b细胞合成并释放ige，ige与其位于肥大细胞上的受体fcεri结合从而调节ros。因此，即使没有外源性的ros(如香烟烟雾或空气污染物)摄入，哮喘患者的气道炎性细胞也会产生内源性ros。过多的ros可以破坏dna，蛋白质和脂质等，最终导致在过敏性哮喘中炎性应答增加，改变气道微环境，加重其过敏原激发的反应。研究证明ros诱导增加导致气道平滑肌细胞收缩，从而加重气道高反应性。有研究显示，ros加重过敏性哮喘的炎性应答和气道高反应性这一过程可能是依赖于由ros介导的akt和丝裂原活化蛋白激酶(mapk)磷酸化水平升高。
5.il-2、il-4和il-5可以将产生这些细胞因子的t细胞分成th1或th2细胞。il-4和il-5促进b细胞类型转换和嗜酸性粒细胞募集，使得这些t细胞和变应性疾病之间产生了密切关系。事实上，许多研究已经提示哮喘中产生2型细胞因子(il-4，-5和-13)的t细胞比例增加，尤其是在支气管肺泡灌洗液(bal)和特应性哮喘患者的肺组织。选择性阻断一种或多种相关细胞因子，有可能会使疾病完全治愈。
6.甘氨酰-组氨酸-赖氨酸(gly-his-lys，ghk)是具有氨基酸序列甘氨酰-组氨酸-赖氨酸的活性三肽，是人血浆、唾液和尿液的正常成分，是一种与人白蛋白结合的结合肽，最早用于伤口愈合和抗衰老皮肤护理。ghk可能是皮肤修复的早期信号蛋白，存在于i型胶原
的α2(i)链中，当损伤激活蛋白水解酶时，ghk被释放到损伤部位，并发挥局部愈合作用。近年来随着研究的不断深入，ghk改善伤口愈合、促进组织再生以及抗炎抗氧化的能力逐渐在骨、肝脏和胃肠壁等组织中得到证实，能够增加胶原蛋白、弹力蛋白生成，促进血管、神经生长，增强干细胞功能和促进间充质干细胞分泌营养因子。ghk是天然存在的，无毒的，并且容易与铜形成络合物，从而提高了ghk的生物利用度，尤其是具有抗氧化和消炎功能。ghk-cu复合物通过多种机制发挥抗氧化功能。ghk，作为三肽单独使用，可以猝灭与变性神经病和疾病有关的有毒脂肪酸脂质过氧化产物。铜成分作为金属离子激活铜和锌依赖性超氧化物歧化酶，后者可作为内源性抗氧化剂。该复合物还可以通过抑制受损组织中铁蛋白铁的释放来减少氧化损伤，从而防止炎症。在伤口愈合组织和皮肤修复中，ghk-cu会降低促炎细胞因子的表达，例如肿瘤坏死因子(tnf)-α和转化生长因子(tgf)-β，其由于某些刺激后的异常修复和再生而在肺纤维化肺组织中过表达。因此，ghk-cu的抗氧化和抗炎特性使其成为治疗支气管哮喘的潜在药物。但是，迄今为止，除本专利申请者外尚无研究检查ghk-cu对支气管哮喘的作用。


技术实现要素：

7.针对上述问题，本发明目的在于揭示该短肽及其铜离子螯合物的新应用，该短肽在体内具有活性成分，通过抗炎，免疫调节，抗氧化及逆转上皮细胞间充质化现象，进而在急性及慢性支气管哮喘中起保护性作用，为治疗哮喘的研发奠定理论基础。
8.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
9.本发明提供了一种三肽化合物及其铜离子螯合物的应用，其特征在于，所述三肽化合物的氨基酸序列为gly-his-lys。
10.进一步地，所述应用通过三肽化合物及其铜离子螯合物降低th2细胞调控的il5及il-13等炎症因子，进而降低肺泡灌洗液中嗜酸细胞水平来实现。
11.进一步地，所述应用通过三肽化合物及其铜离子螯合物拮抗氧化应激反应及tgf-β1调控的上皮细胞间充质化进而抑制小气道周围胶原沉积及纤维化，基底膜增厚来实现。
12.进一步地，所述应用包括在制备用于预防和/或治疗支气管哮喘的药物中。
13.跟进一步地，所述药物包含药学上可以接受的载体和/或赋型剂，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或外用剂型。
14.与现有技术相比本发明的有益效果。
15.1)本发明中第一次将该短肽及其铜离子螯合物应用于哮喘，在应用用途上具有创新性。
16.2)本发明中短肽经实验验证，在急性哮喘模型中，ghk可以通过降低th2细胞调控的il5及il-13等炎症因子，进而降低肺泡灌洗液中嗜酸细胞水平，从而改善急性气道炎症；在慢性哮喘模型中，可以通过拮抗氧化应激反应及tgf-β1调控的上皮细胞间充质化进而抑制小气道周围胶原沉积及纤维化，基底膜增厚，进而改善气道重塑，改善小鼠肺功能。
附图说明
17.图1.支气管哮喘患者血清ghk水平与患者肺功能fvc以及fev1正相关。
18.图2.ghk-cu可减轻ova诱导的小鼠哮喘模型的气道高反应。
19.图3.ghk-cu可降低ova诱导的小鼠哮喘模型的支气管肺泡灌洗液中细胞总数。
20.图4.ghk-cu可降低ova诱导的小鼠哮喘模型的支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数。
21.图5.ghk-cu可降低ova诱导的小鼠哮喘模型的气道周围炎症。
22.图6.ghk-cu可减少ova诱导的小鼠哮喘模型的气道周围胶原沉积。
23.图7.ghk-cu可减少ova诱导的小鼠哮喘模型的气道上皮及间充质指标的表达及分布。
24.图8.ghk-cu可减少ova诱导的小鼠哮喘模型的支气管肺泡灌洗液中tgf-β1的表达。
25.图9.ghk-cu可减少ova诱导的小鼠哮喘模型的支气管肺泡灌洗液中il-5及il-13的表达水平
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
27.实施例一 分析血浆ghk水平与哮喘患者气道重塑和疾病严重程度的相关性。
28.收集年龄性别配对的哮喘患者和健康志愿者的病史、支气管舒张试验和feno结果、血液嗜酸细胞计数和ige水平以及肺hrct，收集其血浆并采用稳定性指示反相高效液相色谱(rp-hplc)法定量分析ghk水平水平，分析血浆ghk水平与哮喘患者气道重塑和疾病严重程度的相关性。如图1所示。
29.支气管哮喘患者血清ghk水平和肺功能fvc以及fev1中等正相关(r＝0.5+)且p值有统计学意义。
30.实施例二 小鼠哮喘模型的建立，ghk-cu治疗效果评估。
31.1.小鼠饲养及哮喘模型建立：balb/c野生型雌性小鼠(6-8周龄)在具有受控温度和湿度的环境下饲养，12h昼夜循环。随机分为6组(n＝6)，即空白组，ova组，ova+低剂量ghk-cu(0.2mg/kg)组，ova+中剂量ghk-cu(2mg/kg)组，ova+高剂量ghk-cu(20mg/kg)组，ova+糖皮质激素(dexa)(2mg/kg)组。除空白组外，其他组在第0天和第14天给予ova腹腔注射致敏后，从第24天起连续18天给予ova经气道雾化吸入激发30min/天，在雾化吸入ova前1h，ghk-cu组给予相应剂量的ghk-cu腹腔注射给药，dexa组给予糖皮质激素，空白组在在相应时间点应用pbs代替给予刺激和给药。
32.2.小鼠肺功能测量和标本收取：在激发期(第21天至第41天)每3天定期收集小鼠血液，应用rp-hplc法定量分析小鼠血浆ghk水平。在第42天应用无创小动物肺功能仪测量各组小鼠的气道阻力后处死小鼠。处死小鼠后，通过气管导管每次用1ml pbs对左肺进行三次灌洗收集支气管肺泡灌洗液(balf)。balf 500g离心10min后将balf的上清液保存在-80℃以进行后续检测。随后收集右肺组织并保存在-80℃以进行蛋白免疫印迹分析。
33.如图2所示，在乙酰甲胆碱浓度为50mg/ml时，与对照组比，ova组小鼠在不同浓度的乙酰甲胆碱刺激后气道penh明显升高(p＜0.001)；给予0.2μg/g、2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后，小鼠的气道penh相比ova组均有明显降低(p《0.01，p《0.001，p《0.001)，其中0.2μg/g ghk-cu干预组的小鼠气道penh高于对照组(p《0.001)，而2μg/g及20μg/g ghk-cu干预组
的小鼠气道penh与对照组无明显差异(p》0.05)。数据以均数
±
标准误表示(n＝6)###，与对照组相比，p＜0.001；**与ova组相比，p《0.01；***，与ova组相比，p＜0.001。
34.3.细胞计数：balf离心后将细胞沉淀物悬浮于1ml pbs中，wright-giemsa染色后，手动计数各组间balf细胞总数，观察嗜酸细胞百分比及淋巴细胞百分比的变化(如图3&4所示)。
35.如图3所示，与对照组比，ova组小鼠的支气管肺泡灌洗液(balf)中的细胞总数明显升高(p＜0.001)；给予0.2μg/g、2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后，小鼠balf中的细胞总数相比ova组均有明显降低(p《0.001)。数据以均数
±
标准误表示(n＝6)###，与对照组相比，p＜0.001；***，与ova组相比，p＜0.001。
36.4.组织学检测：将收集到的肺组织标本制成石蜡切片后进行h&e染色，比较各组间气道周围炎症细胞浸润、气道壁面积和气道平滑肌厚度的区别；进行pas染色，比较各组间杯状细胞化生与增生；进行masson染色，比较各组间上皮细胞下胶原沉积的区别；进行免疫组织化学染色，比较各组间α-sma水平的不同；应用dhe染色评价ros水平；应用硫代巴比妥酸反应物质(tbars)测定mda水平。
37.4.1 he染色。
38.苏木素(hematoxylin)和伊红(eosin)染色(简称he染色)是细胞核组织学最广泛的染色方法。其基本原理为：细胞核内的染色质主要是dna，dna的双螺旋结构中，两边链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木素在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与ph值密切相关。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗粒等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。
39.(1)4μm的石蜡切片被应用，将切片置于60℃烘烤箱内，烤片2小时。
40.(2)二甲苯ⅰ、ⅱ、ⅲ脱蜡各15分钟，然后放入无水乙醇ⅰ、ⅱ、95％、90％、80％、70％、50％各级乙醇溶液中各5分钟，再放入蒸馏水中5分钟。
41.(3)苏木素染色：约3分钟。冲洗切片1-10s。
42.(4)盐酸酒精分化：约10s。流水冲洗洗5-10分钟。
43.(5)伊红染色：0.5％伊红染色3分钟，冲洗5-10分钟。
44.(6)脱水：将切片依次置于50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、100％乙醇ⅰ、ⅱ各30s。
45.(7)透明：切片放入二甲苯ⅰ、ⅱ中各5分钟。
46.(8)封片：中性树胶封存，通风橱中晾干。
47.如图5所示，与对照组比，ova组小鼠的气道周围及血管周围可见大量炎性细胞浸润，炎性细胞浸润评分显著高于ova组(p＜0.001)；给予0.2μg/g、2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后，小鼠道周围炎性细胞浸润明显减少，炎症评分相比ova组均有明显降低(p《0.01，p《0.001，p《0.001)，但与对照组相比，各剂量的ghk-cu干预后，炎症评分相比对照组仍均有明显升高。数据以均数
±
标准误表示(n＝3)，#，与对照组相比，p＜0.05；##，与对照组相比，p＜0.01；###，与对照组相比，p＜0.001；**与ova组相比，p《0.01；***，与ova组相比，p＜
0.001。
48.4.2马松染色实验检测小鼠气道周围胶原沉积。
49.马松染色是胶原纤维染色的主要方法之一，可染细胞核和选择性的显示胶原纤维和肌纤维。马松染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关：分子的大小由分子量体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织，而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。然而，苯胺蓝的分子量很大，因此马松染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。
50.(1)4μm切片脱蜡处理至水。
51.(2)滴加1滴(100μl)masson复合染色液(试剂a)染色5分钟，蒸馏水冲掉染液。
52.(3)滴加1滴(100μl)磷钼酸(试剂c)染色5分钟，甩干。
53.(4)直接滴加1滴(100μl)苯胺蓝(试剂d)染色5分钟蒸馏水稍冲。
54.(5)滴加1滴(100μl)分化液(试剂b)分化30-60秒(2次)。
55.(6)95％酒精、无水酒精脱水，透明，封固。
56.如图6所示。应用马松染色(
×
100；x500)评价气道周围的胶原沉积，与对照组相比，ova组组肺组织气管血管周围胶原沉积面积显著增加；给予0.2μg/g、2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后，小鼠气道周围的胶原沉积明相比ova组均有明显降低。
57.4.3免疫组化的方法检测ghk-cu对小鼠哮喘模型气道emt现象的影响。
58.免疫组化染色是用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究。免疫组化的原理为：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶(hrp)等的抗生素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在化学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
59.(1)石蜡切片(4μm)脱蜡、水化，自来水冲洗。
60.(2)根据一抗的要求对组织进行相应的抗原修复，pbs冲洗3次，每次3min。
61.(3)除去pbs，切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10min，pbs冲洗3次，每次3min。
62.(4)除去pbs，切片上滴加正常非免疫动物血清，室温上孵育10分钟。
63.(5)除去血清，切片上滴加第一抗体，室温下孵育60min或4℃过夜，pbs冲洗3次，每次3min。
64.(6)除去pbs，切片上滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10min，pbs冲洗3次，每次3min。
65.(7)除去pbs，切片上滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶试剂，室温下孵育10min，pbs冲洗3次，每次3min。
66.(8)除去pbs，切片上滴加新鲜配制的dab显色试剂显色。
67.(9)自来水冲洗终止显色，苏木素复染，1％盐酸酒精分化，流水返蓝，切片梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
68.免疫组化染色(
×
400)显示间充质指标α-sma的表达分布情况，应用平均光密度
(aod)，评价各组之间的α-sma的表达差异。##p《0.01，与对照组相比；**p《0.01，与模型组相比。实验结果如图7a所示。
69.免疫组化染色(
×
400)显示上皮指标e-cadherin在气道上皮的表达分布情况，应用平均光密度(aod)值评价各组之间的e-cadherin的表达差异。##p《0.01，与对照组相比；**p《0.01，与模型组相比。实验结果如图7b所示。
70.4.4elisa检测：将收集到的balf和肺组织匀浆按照说明书检测各组中tgf-β进而判断ghk-cu是否可通过抑制il-5,9l-14，tgf-β/smad信号通路和ros介导的mapk/akt信号通路从而产生对哮喘的治疗作用。
71.取出各试剂平衡至室温，试剂及样品配置时需充分混匀，并尽量避免出现气泡。
72.(1)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液10μl，余孔分别加不同比例稀释后的标准品或待测样品100μl，覆膜，37℃孵育2h。
73.(2)弃去液体，甩干，每孔加入生物素抗体(1x)100μl，覆膜，37℃孵育1h。
74.(3)弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
75.(4)每孔加入hrp-亲和素(1x)100μl，覆膜，37℃孵育1h。
76.(5)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
77.(6)每孔加入90μl底物溶液，覆膜，37℃避光孵育15-30min。
78.(7)每孔加入50μl终止液，终止反应。
79.(8)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值。
80.如图8所示，应用酶联免疫吸附(elisa)实验检测小鼠支气管肺泡灌洗液(balf)中tgf-β1的表达。与对照组相比，ova组小鼠的balf中的tgf-β1表达明显升高(p＜0.001)；给予0.02μg/g、2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后，小鼠balf中的tgf-β1浓度相比ova组均有明显降低(p《0.01，p＜0.001，p＜0.001)；给予2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后的小鼠balf中的tgf-β1浓度与对照组相比无明显差异(p》0.01)。数据以均数
±
标准误表示(n＝6)；##，与对照组相比，p＜0.01；###，与对照组相比，p＜0.001；**，与ova组相比，p＜0.01；***，与ova组相比，p＜0.001。
81.如图9所示，应用酶联免疫吸附(elisa)实验检测小鼠支气管肺泡灌洗液(balf)中il-5及il-13的表达。与对照组相比，ova组小鼠的balf中的il-5及il-13表达明显升高(p＜0.001)；给予0.02μg/g、2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后，小鼠balf中的il-5浓度相比ova组均有明显降低(p《0.01，p＜0.001，p＜0.001)；给予2μg/g及20μg/g ghk-cu干预后的小鼠balf中的il-13表达与ova组均有明显降低(p《0.05，p＜0.01)。数据以均数
±
标准误表示(n＝6)。