白蜡树酮在制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用

1.本发明涉及生物医药领域，更具体涉及一种白蜡树酮或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用。


背景技术：

2.疱疹病毒科(herpesviridae)是一类有包膜的，基因组为双链dna的病毒科。该科的成员能广泛地感染动物和人，并诱导相应疾病的产生。目前发现的能感染人的疱疹病毒有八种，主要包括：单纯疱疹病毒i型(herpes simplex virus-1，hsv-1)，单纯疱疹病毒ii型(herpes simplex virus-2，hsv-2)，水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus，vzv)，eb病毒(epstein-barr virus，ebv)，巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)，人类疱疹病毒vi型(hhv-6)，人类疱疹病毒vii型(hhv-7)和卡波氏疱疹病毒(kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，kshv)。根据基因组序列和结构及理化性质的不同，疱疹病毒科又可以分为三个亚科：α-疱疹病毒亚科，β-疱疹病毒亚科和γ-疱疹病毒亚科。疱疹病毒生活周期分为典型的裂解期复制和潜伏期复制：在裂解期感染过程中，病毒基因组复制，产生大量成熟的病毒粒子，诱导多种疾病的发生；在潜伏期感染过程中，基因组处于静息状态，只有少量的病毒基因表达，但基因组随细胞基因组复制而复制，病毒的潜伏状态同样可以造成机体疾病的发生。
3.单纯疱疹病毒的感染能够诱导多种疾病的产生，如造成人口、唇或生殖器的皮肤或粘液膜上出现水泡、角膜炎、胎儿畸形、智力障碍和感觉神经性耳聋、幼儿急疹等等，甚至能够引起多种肿瘤疾病的发生(如非霍金奇和霍金奇淋巴瘤、鼻咽癌、淋巴组织增生、卡波氏肉瘤等)。疱疹病毒感染严重影响人们的生命健康。然而，治疗或者预防疱疹病毒感染的药物仍有待进一步开发。
4.白蜡树酮，英文名：fraxinellone，cas：28808-62-0，其结构式如下式(i)所示。
[0005][0006]
白蜡树酮是从芸苔科植物dictamnus dasycarpus的根皮中分离出来的，是pd-l1抑制剂，可抑制hif-1α蛋白质合成，而不会影响hif-1α蛋白质降解。白蜡树酮通过靶向pd-l1，有用于癌症免疫的潜能，但目前尚无白蜡树酮用于制备预防或治疗疱疹病毒的药物的报道。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是在于提供了一种白蜡树酮在制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用，为临床上疱疹病毒的治疗提供一种安全高效毒副作用小的药物。白蜡树酮在无毒性范围内能显著地抑制感染性疱疹病毒粒子的产生、抑制疱疹病毒的复制，可进一步开发为治疗疱疹病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。
[0008]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009]
白蜡树酮在抑制疱疹病毒复制中的应用，该应用为非疾病治疗的目的。
[0010]
白蜡树酮药学上可接受的盐在抑制疱疹病毒复制中的应用，该应用为非疾病治疗的目的。
[0011]
白蜡树酮在制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用。
[0012]
白蜡树酮药学上可接受的盐在制备治疗或预防疱疹病毒感染的药物中的应用。
[0013]
一种治疗或预防疱疹病毒感染的药物，包含白蜡树酮或其药学上可接受的盐。所述的药物的剂型包括但不限于目前药学上可接受任何剂型，包括片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。
[0014]
一种治疗或预防疱疹病毒感染的药物组合物，以白蜡树酮或其药学上可接受的盐为活性成分，其还可以包含药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。
[0015]
所述的疱疹病毒包括：单纯疱疹病毒i型(hsv-1)，单纯疱疹病毒ii型(hsv-2)。
[0016]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0017]
(1)白蜡树酮或其药学上可接受的盐在实验中表现抗多种疱疹病毒的活性，说明白蜡树酮或其药学上可接受的盐具有广谱的抗疱疹病毒的活性。
[0018]
(2)白蜡树酮或其药学上可接受的盐在无毒性浓度下能有效抑制hsv-1、hsv-2对细胞造成的细胞病变效应。
[0019]
(3)白蜡树酮展现了抑制hsv-1、hsv-2复制的活性，其抑制hsv-1、hsv-2的ic
50
均在纳摩尔水平，分别为及0.088微摩尔/升(88纳摩尔/升)、0.035微摩尔/升(35纳摩尔/升)。si(选择指数)分别为151及215。而且白蜡树酮作为一种临床用药，安全性良好。这说明白蜡树酮是低毒高效的抗疱疹病毒的药物。
附图说明
[0020]
图1是白蜡树酮对vero细胞的细胞毒性检测结果图。
[0021]
图2是白蜡树酮抗hsv-1活性的检测结果图。
[0022]
图3是白蜡树酮抗hsv-2活性的检测结果图。
具体实施方式
[0023]
下面将结合具体实施例详细描述本发明的实施例，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明实施例以白蜡树酮为例对其抗疱疹病毒活性进行说明，白蜡树酮药学上可接受的盐也能产生相同的抗疱疹病毒的效果。
[0024]
实施例1:白蜡树酮抗hsv-1活性的检测
[0025]
1.实验材料：
[0026]
1.1细胞、病毒：
[0027]
vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(atcc)。hsv-1为f株(ejercito,p.m.,e.d.kieff,and b.roizman.1968.characterization of herpes simplex virus strains differing in their effects on social behaviour of infected cells.j.gen.virol.2:357-364)，为中国病毒资源与信息中心保存(china virus resource and bio-information center)。白蜡树酮购自翰香生物科技公司(biochempartner)。
[0028]
1.2试剂：
[0029]
dmem培养基和fbs购自gibco公司；alamarblue活性检测试剂盒购自thermofisher公司。
[0030]
1.3实验仪器：
[0031]
多标记微孔板读取仪购自perkinelmer公司；细胞培养箱为thermofisher公司产品。
[0032]
2.实验方法与结果：
[0033]
2.1白蜡树酮对vero细胞的细胞毒性检测
[0034]
(1)将vero细胞按照8
×
103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％血清(fbs)的dmem培养基，培养基中添加1％的青霉素和链霉素，在37℃、5％co2的加湿培养箱中培养。
[0035]
(2)vero细胞贴壁后添加梯度药物(白蜡树酮)处理。白蜡树酮浓度分别为：6.4微摩尔/升、3.2微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升。利用培养基稀释后的白蜡树酮直接添加到贴壁的vero细胞中，每组三个重复，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
[0036]
(3)培养48小时后，利用alamarblue活性检测试剂盒检测白蜡树酮的细胞毒性，此试剂盒的主要成分刃天青(resazurin)是一种氧化还原指示剂，其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用perkinelmer多标记微孔板读取仪(envison 2102multilabel reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。
[0037]
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药
物-药物组)/未加药物
×
100。结果通过graphpad prism 8软件计算出平均值和标准差。
[0038]
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制白蜡树酮对vero细胞的细胞毒性检测结果图，如图1所示。
[0039]
图1结果显示：白蜡树酮对vero细胞的cc
50
为13.35微摩尔/升。
[0040]
2.2白蜡树酮抑制hsv-1导致的细胞病变效应的检测
[0041]
hsv-1感染vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。hsv-1感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。
[0042]
(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％fbs的培养基，并接种病毒。
[0043]
(2)hsv-1病毒按0.1pfu每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
[0044]
(3)更换添加含有梯度药物(白蜡树酮)的培养基，药物浓度分别为：0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.025微摩尔/升、0.0125微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到vero细胞中，每组三个重复，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
[0045]
(4)48小时后，去除上清，用pbs洗细胞3次。
[0046]
(5)利用alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂盒的主要成分刃天青(resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用perkinelmer多标记微孔板读取仪(envison 2102multilabel reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)
×
100。绘制抗hsv-1曲线图，如图2。
[0047]
由图2结果显示，白蜡树酮抑制hsv-1复制的ic
50
为0.088微摩尔/升，计算出白蜡树酮抗hsv-1的si(选择指数)为151。
[0048]
实施例2:白蜡树酮抗hsv-2活性的检测
[0049]
1.实验材料
[0050]
1.1细胞、病毒
[0051]
vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(atcc)。hsv-2为g株(ejercito pm,kieff ed,roizman b.characterization of herpes simplex virus strains differing in their effect on so cial behavior of infected cells.j gen virol.1968；2:357
–
64.)，中国病毒资源与信息中心保存(china virus resource and bio-information center)。白蜡树酮购自翰香生物科技公司(biochempartner)。
[0052]
1.2试剂
[0053]
dmem培养基和fbs购自gibco公司；alamarblue活性检测试剂盒购自thermofisher公司。
[0054]
1.3实验仪器
[0055]
多标记微孔板读取仪购自perkinelmer公司；细胞培养箱为thermofisher公司产品。
[0056]
2.实验方法与结果
[0057]
2.1白蜡树酮对vero细胞的细胞毒性检测
[0058]
(1)将vero细胞按照8
×
103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。在37℃、5％co2的加湿培养箱中培养。
[0059]
(2)vero细胞贴壁后添加梯度药物(白蜡树酮)处理。药物浓度分别为：6.4微摩尔/升、3.2微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到贴壁的vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养。
[0060]
(3)48小时后，利用alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用perkinelmer多标记微孔板读取仪(envison 2102multilabel rea der)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。
[0061]
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物
×
100。结果通过graphpad prism 8软件计算出平均值和标准差。
[0062]
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制白蜡树酮对vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图1所示。
[0063]
图1结果显示：白蜡树酮对vero细胞的cc
50
为13.35微摩尔/升。
[0064]
2.2白蜡树酮抑制hsv-2导致的细胞病变效应的检测
[0065]
hsv-2感染vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。hsv-2感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。
[0066]
(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％fbs的培养基，并接种病毒。
[0067]
(2)hsv-2病毒按0.1pfu每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
[0068]
(3)更换添加含有梯度药物(白蜡树酮)的培养基，药物浓度分别为：0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.025微摩尔/升、0.0125微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养。
[0069]
(4)48小时后，去除上清，pbs洗细胞3次。
[0070]
(5)利用alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂的主要成分刃天青(resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用perkinelmer多标记微孔板读取仪(envison 2102multilabel reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)
×
100。绘制抗hsv-2曲线图，如图3。
[0071]
由图3结果显示，白蜡树酮抑制hsv-2复制的ic
50
为0.062微摩尔/升，计算出白蜡树酮抗hsv-2的si(选择指数)为215。
[0072]
综合以上实验结果可以看出，白蜡树酮具有抑制单纯疱疹病毒复制的效果。