金诺芬和PEITC联合在制备治疗皮肤和软组织感染药物中的应用

金诺芬和peitc联合在制备治疗皮肤和软组织感染药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及治疗皮肤和软组织感染的新型联合剂技术领域，尤其涉及一种金诺芬和peitc联合在制备治疗皮肤和软组织感染的药物中的应用。


背景技术：

2.皮肤是我们最大和最外层的器官，由表皮、真皮和皮下组织组成。尽管皮肤的物理环境恶劣，其特点是干燥、营养贫乏和酸性环境，但这个器官却是数百万微生物的复杂而动态的生态系统。皮肤被许多细菌定植，包括葡萄球菌属、棒状杆菌属、链球菌属和角质杆菌属。
3.皮肤和软组织感染（skin and soft tissue infections，以下简称ssti）涉及微生物侵犯皮肤和底层软组织的各层，包括蜂窝织炎、脓肿、糖尿病足及手术部位的感染，是临床常见的感染性疾病之一。金黄色葡萄球菌是ssti的主要原因，而耐甲氧西林的金色葡萄球菌（以下简称mrsa）给临床治疗带来了极大的挑战。因此，我们更有必要寻找有潜力的策略以应对mrsa的感染。为了更好地提高在人体组织中的治疗效果，确定在感染背景下更有效地起到杀菌的作用非常重要。首先，在现阶段处于新型抗菌药物发明的瓶颈期，并且新型药物的研发，需要大量的科研力量以及较长时间的临床试验，与此同时，mrsa的临床治疗中，使用其他有效抗生素时，易产生耐药性，影响治疗效果。
4.抗菌药物耐药性的出现被认为是对全球卫生保健中心的严重威胁。由于革兰阳性菌感染与显著的发病率和死亡率有关，及时给予有效的广谱抗菌药物是势在必行的。mrsa引起的感染不仅限制了许多治疗选择，而且比敏感的革兰阳性菌引起的感染带来更多的经济负担。由于新型化合物的开发变得更加困难，尤其是对危重病人来说，多重耐药革兰阳性菌引起的感染正变得越来越成问题。
5.金诺芬（auranofin，以下简称aur）是一种含有金的口服药物，最初由美国食品和药物管理局(fda)批准用于治疗类风湿性关节炎，并引起了越来越多的关注。近年来，所谓的“药物再定位”策略逐渐出现在人们的视野中。在这种背景下，由于其特殊的药用特性，aur开始显示其作为一种抗菌、抗病毒、抗真菌和抗寄生虫的潜在作用。最近的研究表明，aur通过与trxb蛋白活性中心结合抑制其功能，活性氧(以下简称 ros)的积累是细菌死亡的主要原因。
6.异硫氰酸酯(itcs; r
–
n5c5s)是由植物硫代葡萄糖苷与芥子酶反应产生的，芥子酶是植物组织破坏时释放的一种酶。主要包括异硫氰酸烯丙酯(aitc)、异硫氰酸苄酯(bitc)、芥菜素(eru)、异硫氰酸苯己酯(phi)、萝卜硫烷(sfn)和异硫氰酸苯乙酯（以下简称peitc）。其中，peitc是芸薹属植物中常见的硫代葡萄糖苷，由于其对土壤微生物、植物致病菌和临床分离菌的抗菌活性，使其成为很有前景的抗菌药物候选者。研究表明，与革兰阴性菌(嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、松氏志贺氏菌、副溶血性弧菌)相比，peitc对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢
杆菌、单核增生李斯特菌)更有效。然而，已经确定了itcs的潜在靶点，包括atp合酶(complex i)、细胞色素氧化酶(complex iv)和硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶。然而，itcs在调节细胞内ros和机体氧化还原反应中的作用尚不清楚。
7.因此，在本发明中，我们使用小鼠建立了mrsa皮肤感染模型，并检查了aur和peitc对其治疗效果的有效性，基于此，本发明提出一种金诺芬和异硫氰酸苯乙酯联合在制备治疗皮肤和软组织感染的药物中的新应用。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的金诺芬和异硫氰酸苯乙酯（即aur-peitc）联合在制备治疗皮肤和软组织感染的药物中的应用，能治疗革兰阳性菌的可能性，便于指导临床用药，可以提高耐药的金黄色葡萄球菌导致皮肤和软组织感染的治愈率，并潜在性地降低金黄色葡萄球菌耐药性的出现。
9.mrsa的感染正在成为一个受到全球关注的公共卫生问题。然而，近几十年来，新型抗生素的开发受到限制。此外，单药治疗可将普通的细菌感染转化为多耐药菌株的感染，导致更多的医疗负担和更高的死亡率。因此，迫切需要新的治疗策略。本发明以aur-peitc组合进行治疗，在体外体内均表现出对mrsa强大且持续的杀菌能力。aur-peitc联合作为一种新型疗法，主要通过产生活性氧（ros）来增加对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的抗菌活性，并减少临床耐药菌株的出现。
10.本产品通过简单涂抹的方式，快速、有效的作用于皮肤表面以及深部的细菌，起到抑菌杀菌的作用。
11.本发明的有益效果：1、本发明显著提高耐药性金黄色葡萄球菌的治愈率；2、避免了传统单一抗生素使用的缺点，防止诱导产生耐药的金黄色葡萄球菌的出现；3、本发明有效地治疗皮肤和软组织的感染，通过涂抹的方式使治疗更加方便安全，大大提高患者的生活质量。
附图说明
12.图1是本发明的金诺芬和peitc单独及联合治疗mrsa usa300的时间杀菌曲线图；图2是本发明中金诺芬联合peitc在培养基中对四种金黄色葡萄球菌的生长测定图；图3是本发明中四种金黄色葡萄球菌在金诺芬和peitc联合使用时分级抑菌浓度（fic）指数图；图4是mrsa usa300菌株在aur和peitc处理后ros的产生情况图。
13.图5是mrsa usa300感染小鼠皮肤在不同条件处理后12天内伤口的变化。
14.图6是mrsa usa300感染小鼠在不同条件处理后对受感染皮肤的面积进行量化。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
16.1.通过对四株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，利用棋盘微量稀释法来观察aur和peitc联合，其两者抗菌活性是否产生协同作用。
17.将以活化的过夜菌在mhb(muller hinton broth)培养基中稀释100倍，在温度为37℃的条件下，置于转数为220rpm摇床培养箱中培养至od
600
在0.25-0.3之间，保持细菌处于生长对数期。在mhb培养基中将培养物稀释为约5
×
105cfu/ml的菌液。将菌液加入96孔微量培养板中，并将不同浓度的药物两两组合加入菌液，使终浓度梯度以mic浓度开始，沿着垂直或平行的方向，往下倍比稀释至少5个梯度，且保持在每个垂直和平行的孔内药物浓度保持一致。静置于37℃恒温培养箱中过夜孵育。以培养板中未变浑浊的最低浓度为金诺芬与peitc联合时的有效最低抑菌浓度。并通过公式（fic指数= mic
a药联合
/mic
a药单药
+ mic
b药联合
/ mic
b药单药
）计算出分级抑菌浓度（fic）指数。
18.fic指数被定义为协同作用：≤0.5；相加作用：0.5-1.0；无关作用：1.0-2.0；拮抗作用：》 2.0。
19.2.在体外通过时间-杀菌动力试验分别分析aur、peitc、aur和peitc联合的抗菌活性。
20.将过夜菌在以灭菌的mhb培养基中稀释100倍，在温度为37℃的条件下，转数为220 rpm摇床培养箱中培养至对数生长期，调节悬浮菌液至约1.5
×
108cfu/ml。将悬浮菌液按5ml分装至四根无菌试管中，分别为aur单药（4
×
mic）、peitc单药（0.5
×
mic），两者联合；未处理悬浮菌液（对照组）。aur单药（4
×
mic）、peitc单药（0.5
×
mic），两者联合；未处理悬浮菌液（对照组）。置于37℃恒温摇床中培养，分别于0、4、8、12、16、20、24小时，从每支试管中取50
µ
l菌液，加入已备好装有450
µ
l生理盐水的无菌1.5ml离心管中，接着从这个1.5ml离心管中取出50
ꢀµ
l加入第二个装有450
ꢀµ
l生理盐水的无菌1.5 ml离心管中，以此类推，连续稀释至少五个梯度，菌悬液菌液被稀释10（1）、102（2）、103（3）、
……
、10n（n）倍。分别三次从每个梯度的离心管中，取10
ꢀµ
l相应稀释浓度的悬浮菌液，点滴于已做好标记的肉汤琼脂平板的固定区域内，待液体吸收，将平板置于37℃恒温培养箱过夜。
21.对每个时间点合适浓度的细菌菌落计数，三个点取平均值。菌液浓度计算公式：菌悬液浓度=第n个梯度下的平均菌落个数
×
100
×
10ncfu/ml。
22.若联合治疗的菌落数比最佳杀菌效果的单药菌落数减少≥2 lgcfu/ml，即表示有药物联合在体外具有协同杀菌效应。
23.3.活性氧（ros）检测荧光探针carboxy-h2dcfda (thermo fisher, waltham, ma, usa)用于测定细胞内ros积累。采用流式细胞仪(beckman coulter cyan adp analyzer; brea, ca, usa)。指数生长期的mrsa usa300用4
×
mic的aur和0.5
×
mic的peitc处理1小时。将处理过或未处理过的样品与终浓度为10
ꢀµ
m的carboxy-h2dcfda孵育10分钟，以检测细胞内ros。样品(200
µ
l)用预冷的1
×
phosphate-buffered saline (pbs)洗涤两次，离心(4600
×
g，2分钟)后重悬，流式细胞术分析。
24.4.动物皮肤抗感染实验根据之前的研究，我们建立了皮肤感染模型来评估aur和peitc联合治疗对体内抗菌活性的影响，选择体重为16-19 g的6-8周龄雌性ballb/c小鼠建立皮下脓肿动物模型。在小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉之后，在建模前24 h将小鼠上背部毛发（约2
×
2 cm）剃除。
log
10 cfu/ml的细菌数；在24小时降低了4.7 log
10 cfu/ml。显示出联合治疗组的强大而稳定的杀菌能力，并且这种能力可以维持长达24小时（图2）。
27.四、aur-peitc联合使用增加ros产生我们在这里检测了aur-peitc联合治疗是否会诱导ros的产生。mrsa usa300的ros水平如图4所示。对于carboxy-h2dcfda, aur单药组与对照组相比荧光强度几乎没有变化，peitc单药组ros产生较低，而aur-peitc联合组ros积累明显。说明ros的积累是aur和peitc联合杀菌时的主要机制之一。
28.五、aur-peitc联合对皮肤mrsa感染的治疗成功感染的雌性blab/c小鼠被分成4组，并分别通过皮下注射进行治疗：(1)pbs（40
ꢀµ
l）；(2)1% peitc（40
ꢀµ
l）；(3)1% aur（40
ꢀµ
l）；(4)1% aur + 1% peitc（各40
ꢀµ
l）。
29.如图5,治疗后第12天，aur-peitc联合治疗组小鼠创面面积明显缩小，皮肤愈合良好，无明显瘢痕和溃疡残留。并将小鼠感染后0、4、8、12天对每组小鼠受感染皮肤面积随时间的变化进行量化分析（图6）。
30.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。