丹参酮I作为特异性靶向NLRP3炎症小体抑制剂的应用的制作方法

丹参酮i作为特异性靶向nlrp3炎症小体抑制剂的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及丹参酮ⅰ作为一种特异性靶向nlrp3炎症小体抑制剂的应用。


背景技术：

2.炎症小体是一种细胞内模式识别受体(pattern recognition receptor，prr)参与识别的大型多蛋白复合物，是人体固有免疫系统的重要组成部分。炎症小体的组装活化是通过prr识别病原微生物及宿主的内源性危险信号，即病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,pamp)和危险相关分子模式(damage associated molecular pattern，damp)，引发感受器激活、寡聚化、接头蛋白的募集和活化caspase-1的前体，形成具有催化活性的caspase-1，进一步剪切pro-il-1β和pro-il-18，从而分泌成熟il-1β和il-18等促炎因子，介导多种疾病的发生。其中，感受器包括多种核苷酸结合寡聚化结构域(nod)样受体家族分子(nlr)，如nlrp3、nlrc4等；以及aim2样受体家族分子，如aim2等。接头蛋白为具有caspase激活及招募结构域的凋亡相关点状蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,asc)。nlrp3炎症小体是目前研究最为广泛的炎症小体类型，并在人类多种复杂疾病的发生发展中起重要作用，包括肝纤维化、脓毒血症、2型糖尿病(t2d)和动脉粥样硬化等疾病。因此，靶向nlrp3炎症小体可能是防治这些疾病的有效策略。近年来，中药小分子通过抑制nlrp3炎症小体而治疗相关疾病取得了显著进展，如姜黄素、蓝萼甲素、刺甘草查尔酮等。开发nlrp3炎症小体抑制剂，抑制nlrp3炎症小体异常活化，将有利于上述疾病的预防和治疗并为其提供新的治疗途径。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供丹参酮i的新用途。
4.丹参酮ⅰ(tanshinone i，tanshinone a)，其结构式如下式i所示，cas号为：568-73-0。分子式为c
18h12
o3，分子量为276.3，橘黄色粉末，溶于甲醇，dmso。
[0005][0006]
第一方面，本发明提供丹参酮i的应用，为如下a1)或a2)：
[0007]
a1)在体外非治疗目的的特异性抑制nlrp3炎症小体中的应用；
[0008]
a2)在制备特异性靶向nlrp3炎症小体抑制剂中的应用。
[0009]
上述的应用中，所述特异性抑制nlrp3炎症小体为特异性抑制nlrp3炎症小体的活化或异常活化；
[0010]
所述特异性靶向nlrp3炎症小体抑制剂为特异性抑制nlrp3炎症小体的活化或异常活化的抑制剂。
[0011]
第二方面，本发明提供丹参酮i在制备预防和/或治疗nlrp3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
[0012]
上述的应用中，所述nlrp3炎症小体异常活化相关疾病具体可为感染性休克或非酒精性脂肪肝肝炎。
[0013]
所述感染性休克具体可为革兰氏阴性菌感染性休克。
[0014]
第三方面，本发明提供丹参酮i的应用，为如下b1)或b2)：
[0015]
b1)在体外非治疗目的的抑制白细胞介素-1β(il-1β)分泌和/或表达中的应用；
[0016]
b2)在制备抑制白细胞介素-1β(il-1β)分泌和/或表达的产品中的应用。
[0017]
上述的应用中，所述产品具体可为药物。
[0018]
第四方面，本发明提供丹参酮i的应用，为如下c1)或c2)：
[0019]
c1)在体外非治疗目的的抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白特异蛋白酶-1p20(caspase-1p20)的活性和/或表达中的应用；
[0020]
c2)在制备抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白特异蛋白酶-1p20(caspase-1p20)的活性和/或表达的产品中的应用。
[0021]
上述的应用中，所述产品具体可为药物。
[0022]
第五方面，本发明提供丹参酮i的应用，为如下d1)或d2)：
[0023]
d1)在体外非治疗目的的抑制凋亡相关斑点样蛋白(asc)寡聚化中的应用；
[0024]
d2)在制备抑制凋亡相关斑点样蛋白(asc)寡聚化的产品中的应用。
[0025]
上述的应用中，所述产品具体可为药物。
[0026]
本发明具有如下有益效果：
[0027]
本发明研究发现丹参酮i特异性的抑制nlrp3炎症小体的活化，可为nlrp3炎症小体活化异常导致的相关疾病的治疗提供一个有开发价值的天然活性化合物，能有效抑制nlrp3炎症小体活化，可用于制备治疗相关疾病的药物。
[0028]
在体外实验中，丹参酮i能够抑制atp、nigericin、sio2、poly(i:c)、pam3csk4+lps等刺激引起的nlrp3炎症小体的活化，但是对其他炎症小体活化没有影响。进一步发现，在体内实验中，丹参酮i明显降低lps感染休克症状和感染引起的死亡；显著改善非酒精性脂肪性肝炎症状。由此可见，丹参酮i可作为预防或治疗nlrp3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。
附图说明
[0029]
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本技术的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
[0030]
图1、图2和图3显示的是本发明实施例1中tan i对nlrp3炎症小体激活具有潜在的抑制作用；其中，图1显示的是本发明实施例1中tan i剂量依赖性的抑制lps+nigericin诱导的nlrp3炎症小体成熟il-1β分泌的作用；图2显示的是本发明实施例1中tan i剂量依赖性的抑制lps+nigericin诱导的nlrp3炎症小体caspase-1活性的作用；图3显示的是本发明实施例1中tan i剂量依赖性的抑制lps+nigericin诱导的nlrp3炎症小体caspase-1p20和
il-1β蛋白的表达；
[0031]
图4和图5显示的是本发明实施例2中tan i对lps+沙门氏菌诱导的nlrc4炎症小体、lps+dsdna类似物(poly(da:dt))诱导的aim2炎症小体的caspase-1的活性无影响，而特异性的抑制lps+nigericin诱导的nlrp3炎症小体和pam3csk4+lps诱导的非经典的nlrp3炎症小体的caspase-1的活性；
[0032]
图6和图7显示的是本发明实施例2中丹参酮i特异性的抑制nlrp3炎症小体激动剂诱导的nlrp3炎症小体il-1β的分泌作用和pam3csk4+lps诱导的非经典的nlrp3炎症小体的il-1β分泌，而对lps+沙门氏菌诱导的nlrc4炎症小体、lps+dsdna类似物(poly(da:dt))诱导的aim2炎症小体的il-1β分泌没影响；
[0033]
图8和图9显示的是本发明实施例2中不同炎症小体激动剂刺激下丹参酮i对il-1β前体及caspase-1前体剪切的影响结果；
[0034]
图10显示的是本发明实施例3中丹参酮i特异性抑制asc寡聚化(斑点)的免疫印迹结果；
[0035]
图11显示的是本发明实施例4中丹参酮i可以显著降低革兰氏阴性菌感染引起的死亡；
[0036]
图12和图13显示的是本发明实施例4中丹参酮i能够抑制lps诱导的小鼠感染休克血清及腹腔灌洗液中il-1β的分泌；
[0037]
图14和图15显示的是本发明实施例5中丹参酮i显著降低非酒精性脂肪性肝炎模型中alt、ast水平；
[0038]
图16显示的是本发明实施例5中丹参酮i明显改善非酒精性脂肪性肝炎模型中肝脏组织损伤和肝纤维化程度。
具体实施方式
[0039]
为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0040]
下述实施例中所使用的相关材料如下所示：
[0041]
1、药物
[0042]
丹参酮i(tanshinone i，tan i,hy-n0134)购自mce公司，mcc950(hy-12815a)购自mce公司。
[0043]
2、试剂、材料
[0044]
dmem培养基、胎牛血清(bioind)；opti-mem无血清培养基(美国gibco公司)；胰蛋白酶、双抗(青霉素-链霉素溶液)(迈晨科技北京有限公司)；脂多糖(lps)、尼日利亚菌素(nigericin)、三磷酸腺苷(atp)、二甲基亚砜(dmso)(美国sigmaaldrich公司)；pro-il-1β、caspase-1、nlrp3、asc、gapdh抗体(cst公司)；cck-8试剂盒(targetmol)；caspase-1活性测定试剂盒(美国promega公司)；il-1βelisa检测试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)；5
×
sds蛋白电泳上样缓冲液、三色预染蛋白marker、电泳液、转印液、10
×
tbst缓冲液、考马斯亮蓝(北京康润生物技术有限公司)；甲醇、三氯乙酸(东方事博)；ripa裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；a、b显影液(柯达)、pvdf膜(美国millipore公司)。
[0045]
3、仪器
[0046]
二氧化碳培养箱(美国thermo scientific公司)；酶标仪(美国promega公司)；低温高速离心机(美国sigma公司)；电泳槽、转印槽、凝胶电泳分析系统(美国bio-rad公司)。
[0047]
实施例1、本实施例用于说明丹参酮i能明显抑制nigericin诱导的nlrp3炎症小体活化后il-1β的成熟及释放。
[0048]
1.1小鼠原代骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，bmdms)的培养分化
[0049]
取8-10周龄的c57bl/6雌性小鼠，处死后在超净工作台分离小鼠肱骨和股骨，抽取骨髓细胞，用含10％胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)和1％双抗的dmem培养基重悬细胞，按终浓度为50ng/ml加入小鼠集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，m-csf，hy-p7085,mce)，培养5天后获得bmdms。
[0050]
1.2利用小鼠原代骨髓巨噬细胞构建nlrp3炎症小体活化模型
[0051]
胰酶与edta(2：1)消化bmdms细胞并按1.2
×
106个/ml接种24过夜贴壁后，用含有lps(50ng/ml)的dmem培养基换掉原培养基，lps预处理4h后，用不同浓度的丹参酮i(2.5μm，5μm,10μm,20μm)处理1h后，再以补液方式加入nlrp3炎症小体激活剂nigericin刺激45min后收细胞上清液，用il-1βelisa检测试剂盒检测，结果如图1。
[0052]
1.3样品处理
[0053]
重复上述步骤1.2，收集上清液及细胞裂解液，细胞上清液3800rpm离心5min收上清，加入总体积的1/4三氯乙酸(tca)，-20℃过夜后，4℃，13800rpm离心15min；弃上清，加冰丙酮(500μl/孔)上下颠倒混匀后，4℃，13800rpm离心15min；弃上清，105℃金属浴挥干丙酮后加1
×
ripa loading 40μl。振荡混匀，水浴煮沸，短暂离心涡旋后作为上清样品。贴壁细胞直接加入sds蛋白电泳上样缓冲液裂解(120μl/孔)，使loading覆盖所有细胞，迅速晃匀，5min再振荡一次，反复3次使细胞充分裂解，将裂解液吸入ep管中。水浴煮沸15min，冷却后作为细胞裂解样品。
[0054]
1.4 caspase-1活性测定
[0055]
细胞培养上清液采用caspase-1 inflammasome assay检测试剂盒测定caspase-1 p20酶活性，检测按照试剂盒说明书进行操作。先室温平衡caspase-1缓冲液、z-wehd荧光素底物及mg-132抑制剂，然后在10ml z-wehd-氨基荧光素底物中加入60μl mg-132(120μm)抑制剂涡旋至充分混合，再加入caspase-1缓冲液，充分涡旋形成终浓度为60μm的荧光检测混合物，待用。96孔板中每孔加入50μl的细胞上清样本，再每孔加入30μl配制待用的荧光检测混合物，细胞培养板振荡器振荡1min，室温避光平衡使样品与荧光底物充分结合，1h后用promega glomax 20/20发光检测仪检测分析caspase-1荧光值。
[0056]
1.5酶联免疫检测il-1β
[0057]
测定细胞上清液中il-1β的含量，操作步骤按说明书进行。在450nm波长读取od值，根据标准曲线计算样品浓度。
[0058]
1.6免疫印迹检测nlrp3炎症小体相关蛋白的表达
[0059]
western blot测定：检测上清中il-1βp17、caspase-1p20蛋白表达水平，检测细胞裂解液中nlrp3、asc、pro-caspase-1，pro-il-1β蛋白水平。
[0060]
细胞上清蛋白样品采用12％浓度的sds-page凝胶电泳，细胞裂解液样品采用10％
浓度的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接通电源，设定恒定电压85v，1h后电压改为135v，溴酚蓝临近分离胶底部时，结束电泳，安装转印装置。细胞上清液结束电泳后，沿marker 60kd位置裁胶，60kd以上采用考马斯亮蓝染色30min，脱色液(水：甲醇：乙酸＝5：4：1)，至背景蓝色脱透明；剩余部分转印到pvdf膜上，结束后在5％脱脂奶中室温封闭1h，caspase-1(p20)，il-1β，caspase-1(p45)，pro-il-1β，asc，nlrp3，gapdh抗体(1:1000)4℃摇床孵育过夜后，回收抗体，pvdf膜用1％tbst溶液洗膜3次，每次5min，再与相应标记的鼠或兔来源的二抗(1：5000，按照说明书)溶液进行孵育1h，弃二抗，用1％tbst溶液间隔5min洗膜3次，将显影液a和b两种试剂等体积混合后，立即加到膜上，暗室采用x光胶片压片曝光方式显影。
[0061]
1.7统计学方法
[0062]
数据采用graphpad prism 6.0(graphpad，san diego，ca)统计软件进行处理，组间差异分析选用one-way anova方法进行。当p《0.05时认为存在统计学差异。
[0063]
结果如图1-3所示。从图1-3中可以看出，在lps预处理的基础上给予丹参酮i，然后给予刺激因子nigericin诱导炎症小体活化，收集细胞上清和细胞裂解液。通过caspase-1 inflammasome assay和elisa分别检测细胞上清中caspase-1活性和成熟il-1β的含量，结果显示丹参酮i可以呈剂量依赖性抑制caspase-1活性(图2)和成熟il-1β(图1)分泌。进一步利用免疫印迹法对细胞上清中caspase-1p20和成熟il-1β及细胞裂解液中的nlrp3、asc等炎症小体相关蛋白进行检测，结果显示丹参酮i呈剂量依赖性的抑制细胞上清中的caspase-1p20和il-1β的表达，但对细胞裂解液中的nlrp3、asc等炎症小体相关蛋白的表达没有影响(图3)。表明了丹参酮i能有效抑制nlrp3炎症小体的激活。
[0064]
实施例2、本实施例用于说明丹参酮i能特异抑制nlrp3炎症小体活化，而不影响nlrc4、aim2炎症小体。
[0065]
2.1bmdms构建其他炎症小体活化模型
[0066]
按上述1.1分离培养bmdms，消化细胞并按1.2
×
106/ml接种细胞(24孔板，0.5ml/孔)，培养12h后，将培养基替换成含lps(50ng/ml)的dmem培养基，预处理细胞4h，换成不同浓度的丹参酮i(2.5μm，5μm，10μm，20μm)处理细胞1h后，再以补液方式10μm atp刺激45min，sio2(250μg/ml)刺激6h，poly(i:c)(2μg/ml)刺激6h后收样。
[0067]
2.2bmdms构建nlrc4炎症小体活化模型
[0068]
按上述1.1分离培养bmdms，消化细胞并按1.2
×
106/ml接种细胞(24孔板，0.5ml/孔)，培养12h后，将培养基替换成含lps(50ng/ml)的dmem培养基，预处理细胞4h，换成不同浓度的丹参酮i(2.5μm，5μm，10μm，20μm)处理细胞1h后，再以补液方式用沙门氏杆菌(编号ji21487mol，1:10)刺激6h后收样。
[0069]
2.3bmdms构建aim2炎症小体活化模型
[0070]
按上述1.1分离培养bmdms，消化细胞并按1.2
×
106/ml接种细胞(24孔板，0.5ml/孔)，培养12h后，将培养基替换成含lps(50ng/ml)的dmem培养基，预处理细胞4h，换成不同浓度的丹参酮i(2.5μm，5μm，10μm，20μm)处理细胞1h后，再以补液方式加入poly(da:dt)刺激6h后收细胞上清液，用il-1βelisa试剂盒检测。
[0071]
2.4 caspase-1活性测定
[0072]
按照上述1.4步骤测定各种炎症小体活化后相关蛋白表达。结果如图4和5。
[0073]
2.5酶联免疫反应测定il-1β
[0074]
测定细胞上清液中il-1β的含量，操作步骤按说明书进行。在450nm波长读取od值，根据标准曲线计算样品浓度。结果如图6和7。
[0075]
2.6免疫印迹测定各种炎症小体相关蛋白的表达
[0076]
按照上述1.4步骤测定各种炎症小体活化后相关蛋白表达。结果如图8和9。
[0077]
2.6统计学方法
[0078]
数据采用graphpad prism 6.0(graphpad，san diego，ca)统计软件进行处理，组间差异分析选用one-way anova方法进行。当p《0.05时认为存在统计学差异。
[0079]
从图4-9中可以看出，在lps预处理的基础上给予丹参酮i，然后给予atp、nigericin、sio2、poly(i:c)、poly(da:dt)、沙门氏杆菌等不同的刺激因素诱导炎症小体活化，收集细胞上清和细胞裂解液。利用caspase-1 inflammasome assay和elisa方法分别检测细胞上清中caspase-1活性和成熟il-1β的含量，结果显示丹参酮i显著抑制caspase-1的活性(图4-5)和成熟il-1β(图6-7)分泌。进一步通过免疫印迹对细胞上清中caspase-1p20和成熟il-1β及细胞裂解液中的nlrp3、asc等炎症小体相关蛋白进行检测，结果显示丹参酮i特异的抑制nlrp3炎症小体活化细胞上清中的caspase-1 p20和成熟il-1β的表达，但不影响nlrc4、aim2炎症小体活化下细胞上清中的caspase-1 p20和成熟il-1β的表达(图8-9)。表明丹参酮i能特异性的抑制nlrp3炎症小体活化，但是不影响nlrc4、aim2炎症小体。
[0080]
实施例3、本实施例用于说明丹参酮i抑制asc寡聚化。
[0081]
将bmdms细胞接种12孔板中(密度为1
×
106孔)贴壁过夜后，用50ng/ml lps诱导4h，加入丹参酮i 20μm作用1h，再加入不同的nlrp3炎症小体刺激因子作用相应时间。弃上清液，每孔加入500μl预冷的triton裂解液[50mm tris-hcl(ph 7.5)，150mm nacl，0.5％triton x-100,and edta-free protease inhibitor cocktail(roche)]，静置15min后，6000g离心15min，弃上清，加入预冷pbs洗两次，用200μl的pbs重悬，加入辛二酸双(n-羟基琥珀酰亚胺酯)，使其终浓度为2mmol/l，37℃下反应30min。随后6000g离心15min，去上清，加入30μl的2
×
电泳上样缓冲液，煮沸15min，免疫印迹检测结果如图10，结果表明丹参酮i抑制nlrp3炎症小体活化引起asc寡聚化(图10)。
[0082]
实施例4、丹参酮i可以治疗lps诱导的感染性休克，并显著降低革兰氏阴性菌感染引起的死亡
[0083]
4.1小鼠生存率曲线：
[0084]
选取c57bl/6小鼠，7-8周，雌性24只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，在实验室适应性饲养一周后，随机分为4组，分别为模型组、丹参酮i治疗组(10mg/kg，20mg/kg)、阳性药mcc950(20mg/kg)。模型组腹腔注射等量的5％dmso，5％吐温80的pbs溶液，其余组分别腹腔注射溶解于5％dmso，5％吐温80的pbs溶液的丹参酮i；1h后，各组别注射20mg/kg lps的pbs溶液，接下来的72h内，每6h观察记录小鼠存活情况，并绘制小鼠生存曲线分析存活率；如图11所示，可以看出丹参酮i显著降低革兰氏阴性菌感染引起的死亡。跟阳性药对比，其治疗效果相当。
[0085]
4.2丹参酮i可以改善lps诱导的感染性休克
[0086]
选取7-8周c57bl/6雌性小鼠，40只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，随机分为4组，分别为空白对照组、lps模型组、丹参酮i治疗组(20mg/kg)、mcc950治疗组(20mg/kg)；
空白对照组、模型组腹腔注射等量的5％dmso，5％吐温80的pbs溶液，其余组别分别腹腔注射溶解于5％dmso，5％吐温80的pbs溶液的丹参酮i和阳性药mcc950；1h后，除空白对照组腹腔注射0.2ml的pbs溶液外，其余各组分别注射0.2ml，20mg/kg的lps，2h后眼球取血，取腹腔巨噬细胞，取血后4℃离心取血清，elisa检测血清炎症因子il-1β因子指标，腹腔巨噬细胞流式细胞术检测腹腔巨噬细胞和中性粒细胞数，结果表明丹参酮i可以治疗lps诱导的感染性休克。结果从图12-13中可以看出，在lps诱导的小鼠感染休克模型中，丹参酮i对腹腔灌洗液和血清中il-1β的分泌有显著的抑制作用(p《0.05)。
[0087]
实施例5、丹参酮i基于nlrp3炎症小体通路治疗蛋氨-胆碱缺乏(methionine-choline deficient diet,mcd)饲料诱导的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，nash)。
[0088]
选取c57bl/6雄性小鼠，8周龄，30只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，在实验室适应性饲养一周后，随机分为5组(n＝6)，分为mcd组(缺乏蛋氨酸和胆碱饲料饮食)和mcs组(不缺乏蛋氨酸和胆碱饲料饮食)。mcd组分为对照组、丹参酮i(20mg/kg)组和mcc950(20mg/kg)组(阳性对照)。mcs组分别分为对照组、丹参酮i(20mg/kg)组。喂食饲料一周，每日按上述剂量给药一次，一周后，每天继续喂食饲料，隔天给药，5周后小鼠摘眼球取血，检测血清中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)肝功能指标；解剖小鼠，取肝脏组织进行he、天狼星红(sirius red)和masson染色，检测肝细胞损伤和组织纤维化程度。
[0089]
结果如图14-16所示。从图中可以看出，在非酒精性脂肪性肝炎模型中，腹腔注射给药丹参酮i，可显著降低alt、ast(图14、15)水平，明显改善肝脏组织损伤和肝纤维化程度(图16)，说明丹参酮i可在体内显著抑制炎症小体的激活，对非酒精性脂肪性肝炎有明显治疗效应。
[0090]
通过以上实施例1-5的结果可以看出，在体外实验中，丹参酮i能够抑制atp、nigericin、sio2、poly(i:c)、pam3csk4+lps等刺激引起的nlrp3炎症小体的活化，但是对其他炎症小体活化没有影响。进一步发现，在体内实验中，丹参酮i明显降低lps感染休克症状和感染引起的死亡；显著改善非酒精性脂肪性肝炎症状。由此可见，丹参酮i可作为预防或治疗nlrp3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。