核小体蛋白类似蛋白1作为心肌缺血再灌注损伤的治疗靶点

1.本发明涉及核小体蛋白类似蛋白1作为心肌缺血再灌注损伤的治疗靶点，属 于生物医药技术领域。


背景技术：

2.根据《中国卫生健康统计年鉴2019》，2018年冠心病死亡率继续2012年以 来的上升趋势，2018年中国城市居民冠心病死亡率为120.18/10万，农村居民冠 心病死亡率为128.24/10万。及时重建堵塞血管血运，有效的恢复梗死心肌的血 流灌注是挽救濒死心肌，拯救生命的关键，然而伴随而来是，心肌损伤的进一步 加重，即心肌缺血再灌注损伤。这一现象已成为严重限制再灌注治疗效果的瓶颈。 目前对于缺血再灌注损伤的治疗主要集中在抗氧化应激，抗炎，调节线粒体功能 等基础研究层面，尚无明显治疗效果。且多项研究已证实缺血再灌注损伤多发生 于再灌注早期，中期和晚期已无明显再灌注损伤，现有的药物无法及时治疗再灌 注损伤早期的心肌，此外，一些研究表明心肌缺血预适应或者是肥厚预适应均能 减少心肌缺血再灌注损伤，但是无明显临床转化价值。因此，心肌缺血再灌注损 伤的防治仍是亟需解决的问题。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是：目前临床上尚无能有效治疗心肌缺血再灌注 损伤的药物。
4.为了解决上述技术问题，本发明提供了抑制核小体蛋白类似蛋白1表达和/ 或活性的试剂在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。
5.优选地，所述试剂包括重组蛋白wnt2。
6.本发明还提供了一种治疗心肌缺血再灌注损伤的药物，包括医学上可接受的 载体和有效量的活性成分；所述活性成分为抑制核小体蛋白类似蛋白1表达和/ 或活性的试剂。
7.优选地，所述活性成分为重组蛋白wnt2。
8.本发明还提供了检测核小体蛋白类似蛋白1表达水平的试剂在制备检测心 肌缺血再灌注损伤的试剂或试剂盒中的应用。
9.优选地，所述检测核小体蛋白类似蛋白1表达水平的试剂为核小体蛋白类似 蛋白1的多克隆抗体。
10.本发明还提供了核小体蛋白类似蛋白1在筛选治疗心肌缺血再灌注损伤的 药物中的应用。
11.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
12.本发明通过动物模型实验表明核小体蛋白类似蛋白1能够作为心肌缺血再 灌注损伤的治疗靶点，在小鼠缺血再灌注损伤模型中，损伤区心肌组织核小体蛋 白类似蛋白1升高，通过注入重组蛋白wnt2下调核小体蛋白类似蛋白1，从心 脏收缩功能评估发现模型
小鼠心脏收缩力较核小体蛋白类似蛋白1未下调组明 显改善，且ef％和fs％较对照组明显升高；本发明为临床上研发能够有效治疗 心肌缺血再灌注损伤的药物提供了新的治疗靶点。
附图说明
13.图1为缺血再灌注损伤模型小鼠损伤区组织核小体蛋白类似蛋白1 (nap1l1)的表达水平及统计学分析结果；其中，sham代表假手术小鼠对照组； i/r代表缺血再灌注损伤模型小鼠组；1d、3d、1w分别代表缺血再灌注损伤模 型小鼠术后第1天、第3天和第1周(第8天)。
14.图2为缺血再灌注损伤模型小鼠注射重组蛋白wnt2后，核小体蛋白类似蛋 白1(nap1l1)的表达水平及统计学分析结果；其中，sham代表假手术小鼠对 照组(vehicle:空白对照组；rbwnt2:注入重组蛋白wnt2对照组)；i/r代表缺血 再灌注损伤模型小鼠组(vehicle:空白对照组；rbwnt2:注入重组蛋白wnt2组)；
15.图3为缺血再灌注损伤模型小鼠外源性泵入重组蛋白wnt2后，心脏超声检 测结果；其中，a为心脏超声检测各组小鼠缺血再灌注后心脏收缩功能，b为各 组小鼠心脏收缩功能ef指标和fs指标的统计分析结果；sham代表假手术小鼠 对照组(vehicle:空白对照组；rbwnt2:注入重组蛋白wnt2对照组)；i/r代表缺 血再灌注损伤模型小鼠组(vehicle:空白对照组；rbwnt2:注入重组蛋白wnt2组)。
具体实施方式
16.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
17.实施例
18.本实施例提供了核小体蛋白类似蛋白1作为心肌缺血再灌注损伤的治疗靶 点，实验过程及结果如下：
19.1.构建小鼠缺血再灌注损伤模型：
20.使用脱毛膏脱去小鼠胸前区毛发，吸入异氟烷麻醉后仰卧于鼠板固定。酒精 消毒皮肤，连接心电图，切开左心前区，逐层分离皮下组织，用精细止血钳撑开 3、4肋间，挤出心脏，以左心耳为标志，在左心耳下2mm出进针，迅速结扎左 前降支，复位心脏。观察心电图出现st段抬高，结扎40分钟后，送开结扎线， st段下移，即建立心脏缺血/再灌注模型。假手术组只穿线，不结扎。术后常规 镇痛抗感染。
21.2.缺血再灌注损伤模型小鼠损伤区组织nap1l1表达情况：
22.通过蛋白质免疫印迹法检测缺血再灌注损伤模型小鼠损伤区组织核小体蛋 白类似蛋白1(nap1l1)的表达水平，具体操作如下：称取适量的缺血45分钟 不同再灌注时间点小鼠心肌组织损伤区标本，加入裂解液(ripa)裂解，提取 组织蛋白，sham组和每个时间点组随机抽取4个样本，用微量移液器加入到配 置好的sds聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，130伏恒压电泳，直至溴酚蓝到达凝胶底 部。将凝胶转移至湿转液中浸泡10分钟，裁剪适当大小的pvdf膜，于甲醇中 激活10秒后，在ddh2o中漂洗5分钟，再转移至湿转液中浸泡。将转膜滤纸， 海绵垫浸泡在湿转液中，依次将海绵垫a，滤纸a，凝胶，pvdf膜，滤纸b，海 绵垫b置于湿转夹之中，注意排除气泡。将湿转夹放入电转槽内，凝胶靠近负极， pvdf膜靠近正极，
250ma，1小时，冰浴下恒流转膜。转膜结束后将含有蛋白 质pvdf膜置于5％的脱脂牛奶中，室温下，摇床封闭60分钟。选取美国 proteintech公司生产的nap1l1 polyclonal antibody(货号：14898-1-ap)。按照抗 体说明书，用一抗稀释液1:1000稀释，4℃摇床孵育过夜。一抗孵育结束后，tbst 漂洗三次，每次10分钟，孵育一小时二抗(上海威奥生物公司生产辣根过氧化 物酶标记抗兔igg(h+l)，货号：wb0177，tbst 1:5000稀释)结束后tbst漂 洗三次，每次5分钟，吸去pvdf表面的水分，加入适量的显影液，放在成像 系统中显影。结果如图1所示，由图1中的左图可知，小鼠缺血再灌注损伤模型 中，小鼠损伤区组织nap1l1表达水平明显升高，由图1中的右图可知，经过统 计学分析，各组别间小鼠损伤区组织nap1l1的表达水平具有显著性差异。
23.3.重组蛋白wnt2对缺血再灌注损伤的治疗作用：
24.选用spf级雄性c57bl/6 7周龄小鼠，体重25g左右，分为四组， sham+vehicle组，sham+rbwnt2组，i/r+vehicle组，i/r+rbwnt2组，rbwnt2 为美国signalway antibody(sab)生产recombinant human protein wnt-2(货号： ap70917)。sham+rbwnt2组和i/r+rbwnt2组皮下埋入美国alzet生产的植入 式胶囊渗透压泵，型号：1002，每小时泵出0.25微升，维持wnt2血药浓度为 800pg/ml。vehicle组泵入等量的生理盐水作为对照。1周后构建小鼠心脏缺血 再灌注损伤模型，在缺血45分钟，再灌注5天时检测损伤区组织核小体蛋白类 似蛋白1(nap1l1)的表达水平，结果如图2所示，由图2可知，小鼠模型注 射重组蛋白wnt2后，损伤区组织nap1l1表达水平显著降低。同时监测通过心 脏超声检测各组小鼠心脏收缩功能，步骤如下：脱毛膏脱去小鼠胸前区毛发，将 小鼠放入麻醉罐中，用异氟烷进行气体麻醉，待小鼠出现肌力下降等浅麻状态后， 将小鼠转移至恒温鼠板，并固定好，改为面罩麻醉。调整气麻药浓度，控制维持 心率450-500次/分钟。在心前区涂抹适量的超声胶，待小鼠心率在450-500次/ 分钟的时，使用visualsonics vevo 2100超声仪rmv 707 30mhz的探头在小鼠 胸壁上采集胸骨旁短轴和长轴切面，在探测长轴切面时，探测到乳头肌水平或二 尖瓣腱索水平。测量心率并记录b型和m型(在乳头肌水平或二尖瓣腱索水平) 超声图像。测量指标包括左心室射血分数(ef％)和缩短分数(fs％)，连续监 测10个心动周期后取平均值。发现缺血再灌注损伤模型小鼠注射重组蛋白wnt2 后ef％和fs％较vehicle组明显升高，如图3a、3b所示，提示心功能明显改善。
25.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的 限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下， 还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。