一种快速分离生长激素的丝蛋白缓释微针的制备方法

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种快速分离生长激素的丝蛋白缓释微针的制备方法。


背景技术：

2.生长激素(growth hormone)是一种由垂体前叶合成与分泌的肽类激素，在人体的多个年龄阶段发挥重要作用。生长激素缺乏症(growth hormone deficiency)则是由于生长激素分泌不足，或是分泌的生长激素结构异常，亦或是生长激素受体下调等原因而引起的内分泌紊乱性疾病。如果是婴幼儿时期生长激素缺乏将导致身体发育迟缓，身材矮小；成年人生长激素缺乏则会出现脂质分布异常和骨密度下降而导致骨质疏松等问题。流行病学调查表明，生长激素缺乏症在婴幼儿中的发病率为1/3500-10,000，成人的发病率为1-2/10万，并且发病率呈逐年上升趋势。
3.目前，生长激素缺乏症的临床治疗方法主要为替代疗法，即每日皮下注射人重组生长激素。虽然该方法经临床证明是安全有效的，但患者需要每日接受皮下注射，治疗周期长达数年，因此患者顺应性差、经济负担重。因此，有必要延长生长激素的作用效力。现有的生长激素长效制剂机理主要分为两类：(1)利用缓释技术将未修饰的生长激素制备形成前药、药物晶体或药物储库；(2)利用白蛋白或白蛋白修饰生长激素，延长其半衰期。这两种方法虽然可以延长药物的半衰期，但也存在许多不足之处。例如，采用微球或微粒技术封装未修饰的生长激素并不能产生理想的临床疗效；且仍需皮下注射微粒制剂，易产生严重的不良反应。而利用白蛋白或白蛋白修饰生长激素时，虽然人血清白蛋白与生长激素都是人体本身的固有成分，但融合后的蛋白仍可能具有潜在的免疫原性，使受试患者不同程度上产生中和抗体。
4.微针作为一种新型的经皮药物递送系统，具有无痛、可自主给药等特点，是皮下注射的理想替代品。它是由数百根微米级针头集成于1cm2的贴片上，能有效穿透皮肤的角质层而不触及真皮层的神经纤维，从而实现无痛式递送药物。微针温和的制备条件也使得掺入的药物能够得到有效的保护，避免药物降解而影响疗效。丝素蛋白是一种从家蚕中提取的蛋白质，具有良好的生物相容性和生物降解性。同时，生物活性物质能够在干燥的蚕丝膜中长时间稳定保存。此外，通过调节丝蛋白中β片段的含量进而实现药物的控释。因此，设计一款快速分离丝蛋白缓释生长激素的微针有望解决现有生长激素长效制剂所面临的问题。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种快速分离生长激素的丝蛋白缓释微针的制备方法，制备得到的缓释生长激素微针可以显著降低患者的给药频率，并且可以通过无痛自主给药，大大提高患者的顺应性，从而有效的解决目前缓释生长激素存在的需要注射给药和冷链运输的问题。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.本发明提供了一种快速分离生长激素的丝蛋白缓释微针的制备方法，该方法包括以下步骤：
8.s1、将重组人生长激素(rhgh)和丝蛋白的混合溶液加入微针模具中，经离心后吸出多余的液体，然后于37℃下孵育4h以上；
9.s2、将分离材料制成的溶液加入步骤s1的微针模具中，离心后刮除多余的液体，再次离心后加入分离材料/辅助分离材料的混悬液，离心后刮除多余的液体，再次离心后取出；所述分离材料包括聚丙烯酸、聚维酮、柠檬酸、透明质酸、右旋糖酐和蔗糖中的至少一种，所述辅助分离材料为碳酸氢钠；
10.s3、将基底层溶液加入步骤s2的微针模具中，离心后取出，最后经干燥、脱模制得微针。
11.优选地，步骤s2中，所述分离材料为聚丙烯酸或聚维酮，所述分离材料/辅助分离材料的混悬液为碳酸氢钠与聚丙烯酸的混悬液或者碳酸氢钠与柠檬酸的混悬液。具体地，所述分离材料为聚丙烯酸，所述分离材料/辅助分离材料的混悬液为碳酸氢钠与聚丙烯酸的混悬液。
12.首先，本发明制备的快速分离丝蛋白缓释生长激素的微针能够实现患者自主无痛式给药，避免了临床疗法每日注射的皮肉之苦。其次，通过丝蛋白负载未修饰的生长激素，增强了生长激素的稳定性与疗效，减少潜在过敏反应的发生。最后，利用微针背衬层中的起泡剂碳酸氢钠产生气体，促使针尖与贴片快速分离，从而解决微针需要长时间粘贴皮肤的不适。而滞留在皮肤中的针尖层能够长达数十天的释放生长激素，实现长效治疗。
13.优选地，步骤s1中，37℃下孵育4h以上的孵育方法可替换为甲醇环境下孵育0.5h以上。
14.优选地，步骤s1的混合溶液中，所述丝蛋白的浓度为5％-15％，所述重组人生长激素的浓度为1％-5％。具体地，所述丝蛋白的浓度为10％，所述重组人生长激素的浓度为4％。
15.优选地，在分离材料的溶液中，分离材料的浓度为10％-40％；在分离材料/辅助分离材料的混悬液中，分离材料的浓度为10％-30％，辅助分离材料的浓度为20％-50％。具体地，在分离材料的溶液中，分离材料的浓度为15％；在分离材料/辅助分离材料的混悬液中，分离材料的浓度为15％，辅助分离材料的浓度为20％。
16.优选地，步骤s3的基底层所选用的材料包括聚丙烯酸、聚维酮、聚乳酸羟基乙烯中的至少一种。具体地，基底层所选用的材料为聚维酮。
17.优选地，步骤s3所述基底层溶液的浓度为15％-50％。
18.优选地，步骤s1中的离心、步骤s2中的两次首次离心以及步骤s3中的离心均为4℃下以4500rpm离心15min；步骤s2中的两次再次离心为25℃下以4500rpm离心30min。
19.本发明还提供了采用上述的一种快速分离生长激素的丝蛋白缓释微针的制备方法制备得到的快速分离生长激素的丝蛋白缓释微针。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.本发明制备了一种快速分离生长激素的丝蛋白缓释微针，利用快速分离层中含有的发泡物质，在微针与皮肤间质液接触时，快速产生气泡，从而实现基底层和针体的分离，并将载药针尖层留在皮肤内，缓释生长激素。这种缓释生长激素可以实现自主无痛给药，大
大降低了患者的给药频率，提高顺应性，从而有效的解决目前缓释生长激素存在的需要频繁注射给药的问题。
22.本发明的快速分离缓释生长激素的微针与不含发泡物质的分离微针相比，显著的降低了微针针体与基底层的分离时间，减少了微针与皮肤的接触时间，并大大的提高了药物的载药量和递送效率。同时，本发明采用丝蛋白为载体，可以增加生长激素的稳定性，在室温下一个月保持活性。此外，本发明制备的快速分离缓释生长激素的丝蛋白缓释微针，采用离心法一体化制备，制备方法简单，有利于扩大生产。
附图说明
23.图1为微针的扫描电镜图片(a、b分别为实施例1和对比例3的微针扫描电镜图)；
24.图2为微针分离试验的显微镜图片(a、b分别为实施例1和对比例3的微针分离图片)；
25.图3为微针的皮肤刺入、分离及药物递送情况图(a、b、c分别为实施例1微针刺入离体皮肤的显微镜图，对比例3刺入离体皮肤后的显微镜图，实施例1和对比例3微针的皮肤刺入效率、分离效率和药物递送效率)；
26.图4为微针的体外释放曲线；
27.图5为不同微针中rhgh的圆二色谱图。
具体实施方式
28.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
29.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
30.实施列1快速分离生长激素微针的制备
31.该微针的制备方法包括以下步骤：
32.(1)根据计算机辅助设计平面图和立体图进行数控编程编码，电脑运算后转化为指令，控制精密数控机床，对黄铜进行多步骤重复性精细加工，完成微针主模具的制备。所述微针主模具为圆形八贴片状，每个贴片分布着12
×
12的针尖阵列，针尖针体为高度800um,宽度为300um的圆锥体。
33.(2)取适量聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)和固化剂(即道康宁sylgard184硅橡胶)，以10:1(w/w)的比例混合搅拌均匀，倒入至加工好的微针主模具中，将主模具放至真空干燥器中抽真空脱气，待气泡完全消失后放至80℃恒温箱中固化1h。冷却后将阴模和主模具分离，即可得pdms微针阴模。
34.(3)精密称取重组人生长激素(rhgh)40mg溶于1ml超纯水中，备用。然后称取100mg丝蛋白加入上述药物溶液中，待完全溶解后备用。
35.(4)为制备缓释针尖载药层，用移液枪取200μl上述混合溶液于步骤(2)制备的微针pdms阴模中，4℃下以4500rpm离心15min后取出，吸出多余的液体，放入37℃水浴锅中孵育4h。
36.(5)称取聚丙烯酸300mg溶于2ml无水乙醇中，待完全溶解后，加入400mg碳酸氢钠，超声20分钟，使碳酸氢钠混悬均匀，制得聚丙烯酸/碳酸氢钠乙醇混悬液备用。另称取聚丙烯酸300mg，溶于2ml超纯水中，制得聚丙烯酸超水溶液备用。
37.(6)取聚丙烯酸超水溶液300μl，加入步骤(4)的微针模具(即微针pdms阴模)中，4℃下以4500rpm离心15min后取出，刮除多余的液体，此步骤是为了填平缓释针尖载药层干燥后的凹面，并且隔绝缓释针尖载药层和快速分离层。再次将微针模具放入离心机，25℃下以4500rpm离心干燥30min后取出。为制备快速分离层，往微针模具中加入聚丙烯酸/碳酸氢钠乙醇混悬液300μl，4℃下以4500rpm离心15min后取出，刮除多余的液体，再次放入离心机，25℃下以4500rpm离心干燥30min后取出。
38.(7)为了制备基底层，将15％的聚维酮乙醇溶液作为基底溶液加入步骤(6)的微针模具中，4℃下以4500rpm离心15min后取出，放入干燥器干燥两天，脱模制得微针。
39.对本实施例制备的微针进行电镜扫描。如图1中的a图所示，结果表明本实施例所制备的微针结构完整，排列整齐。
40.将本实施例所制备的微针剪切成单排微针阵列的长条，用胶带固定在载玻片上，载玻片放入10cm培养皿中，往培养皿里面加入pbs溶液，观察并记录微针分离的时间，结果如图2中的a图所示，微针阵列在加入pbs溶液后产生气泡，并在12s内与基底实现快速分离。
41.将四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸(tritc)配成1mg/ml的dmso溶液，与丝蛋白溶液(100mg丝蛋白溶于1ml超纯水中)在4℃条件下，避光搅拌12小时；混合溶液透析48小时后冷冻干燥后制备得到tritc标记的丝蛋白，再按上述步骤【步骤(3)至(7)】依次制备微针。将微针插入离体鼠皮3min后移除基底层，利用荧光显微镜观察微针刺入皮肤的情况(结果如图3中的a图所示)并计算微针在离体皮肤中的分离效率，刺入效率以及药物递送效率。
42.结果如图3中的c图所示，结果显示本实施例制备的微针的可以很好的刺入皮肤，并且在3min内实现针体和基底层的分离，药物递送效率高达90％以上。
43.将本实施例所制备的微针放入pbs溶液中，于设定的时间点(4,8,12,16天)取样检测生长激素的浓度，绘制释放曲线，如图4所示。结果显示，本实施例制备的微针可以实现两周以上的缓释，符合预期。
44.实施列2快速分离生长激素微针的制备
45.与实施例1相比，该微针的制备方法的区别在于：(4)用移液枪取200μl上述混合溶液于微针模具中，4℃下以4500rpm离心15min后取出，吸出多余的液体，放入5l的真空干燥器中，同时放入100ml甲醇，使真空干燥器充满甲醇蒸汽，室温孵育0.5h后取出。其他步骤同实施例1。
46.将本实施例制备的微针放入pbs溶液中，于设定的时间点(4,8,12,16天)取样检测生长激素的浓度，绘制释放曲线。如图4所示，结果显示甲醇孵育后的释放与4h水孵育后的释放没有明显差别，推测甲醇孵育0.5h后丝蛋白的β片段含量与水孵育4h后β片段含量没有明显差别。
47.对比例1快速分离生长激素微针的制备
48.与实施例1相比，该微针的制备方法的区别在于：(4)用移液枪取200μl上述混合溶液于微针模具中，4℃下以4500rpm离心15min后取出，吸出多余的液体，放入37℃水浴锅中孵育2h。其他步骤同实施例1。
49.将本对比例制备的微针放入pbs溶液中，于设定的时间点(4,8,12,16天)取样检测生长激素的浓度，绘制释放曲线。如图4所示，微针的突释现象明显增加，这是因为在37℃水浴中放入的时间缩短，载体丝蛋白的β片段含量比4h的低，β片段是丝蛋白中不溶于水的二级结构，用于控制药物的释放，因此造成本对比例的微针突释增加。
50.对比例2快速分离生长激素微针的制备
51.与实施例1相比，该微针的制备方法的区别在于：(4)用移液枪取200μl上述混合溶液于微针模具中，4℃下以4500rpm离心15min后取出，吸出多余的液体，室温干燥。其他步骤同实施例1。
52.将本对比例制备的微针放入pbs溶液中，于设定的时间点(4,8,12,16天)取样检测生长激素的浓度，绘制释放曲线。如图4所示，结果显示本对比例所制备的微针快速释放，不具备缓释特性。这是因为增加丝蛋白β片段含量需要在一定的温度和湿度条件下进行，室温条件下干燥的微针，β片段含量较低，不具备缓释性能。
53.对比例3生长激素微针的制备
54.与实施例1相比，该微针的制备方法的区别在于：(5)取聚丙烯酸300mg，溶于2ml超纯水中，制得聚丙烯酸超水溶液备用。(6)取聚丙烯酸超水溶液300μl，加入微针模具中，4℃下以4500rpm离心15min后取出。刮除多余的液体，再次将微针模具放入离心机，25℃下以4500rpm离心干燥30min后取出。加入聚丙烯酸超水溶液300μl，4℃下以4500rpm离心15min后取出，刮除多余的液体，再次放入离心机，25℃下以4500rpm离心干燥30min后取出。其他步骤同实施例1。
55.本对比例制备的微针扫描电镜图如图1的b图所示，与实施列1相比，本对比例所制备的微针外观与实施列1相似，微针结构完整，整齐排列。在pbs中的分离时间如图2的b图所示，本对比例中所制备的微针的分离时间显著延长，这是因为没有在分离层中加入辅助分离物质碳酸氢钠，没有产生气泡，因此分离时间显著延长。根据微针刺入离体鼠皮肤的情况(结果如图3的b图所示)以及微针在离体皮肤中的分离效率，刺入效率以及药物递送效率(结果如图3的c图所示)可见，本对比例所制备的微针在3min中内不能完成分离，分离效率和药物的递送效率显著低于实施列1。
56.实验例1微针中丝蛋白对rhgh的稳定性
57.将实施例1中制备的微针在普通干燥器中室温放置一个月。一个月后，取出微针，放入pbs溶液中释放出rhgh，收集释放液，备用。然后再按实施例1中的方法制备微针，同样的放入pbs溶液中释放出rhgh，收集释放液，备用。最后利用圆二色谱仪考察两种微针中rhgh的二级结构的稳定性。如图5所示，放置一个月后微针中rhgh的圆二色谱曲线和刚制备微针中rhgh的圆二色谱曲线以及未处理的rhgh溶液的圆二色谱曲线重合，表明微针在制备过程中维持了rhgh结构的稳定性，并且在干燥器中室温放置一个月rhgh的结构依然保持不变。
58.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。