一种可负载多种分子并用于感染伤口愈合的水凝胶的制备方法

1.本发明属于医用抗菌敷料领域，具体涉及可负载多种分子并用于感染伤口愈合的水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.药物缓释系统一般指的是药物分子和药物传递系统通过不同的方法(物理或者化学法)结合在一起，然后通过扩散或渗透等作用将药物分子以合适的浓度持续稳定的释放出来，使药物达到治疗的目的。目前将药物负载到载体上可以通过物理分散、氢键作用、静电吸附和化学键合等方式。但困难在于，由于物理分散吸附分子的稳定性较差，而共价结合往往导致分子生物活性潜力的降低。而通过氢键作用和静电吸附负载药物分子会具有较好的稳定性，同时也不会降低药物本身的生物活性。因此，开发一种既能有效、准确地将抗菌药物递送至创面部位，又能控制创面主动愈合的释放行为的抗菌药物递送系统是非常有必要的。
3.因此，许多类型的现代伤口敷料，包括具有持续药物释放特性的半透膜、半透泡沫、亲水胶体和水凝胶，已经被开发出来。不仅试图避免缺损伤口的感染，而且还试图促进伤口修复过程。在这些敷料中，由于水凝胶的亲水特性，可以通过吸收伤口渗出物和保持潮湿的环境来降低伤口感染的风险，这些特点给受损部位的修复提供了良好的组织微环境。药物传递系统常用的材料水凝胶可以源自天然聚合物、合成聚合物或两者的组合。基于丙烯酸和丙烯酰胺的高吸水性水凝胶是合成聚合物，已应用于生物医学和组织工程的各种方面中。但是这种通过单体聚合形成的水凝胶，往往会由于前期反应工艺条件问题，导致聚合反应不是特别充分，从而使得单体的残余量较多，导致细胞毒性问题。而材料的毒性问题往往是生物医学材料首要解决的问题，也正是本发明要解决的问题之一。
4.此外，虽然已经发现纳米金属具有高效抗菌性，但抗生素依旧是最常见和有效的抗菌药物，也是临床治疗感染的主要策略。但是抗生素的释放很难控制，如果能够通过氢键和电荷吸附释放抗生素就能达到很好的缓释效果，这是本发明需要解决的另一个问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提出一种可负载多种分子并用于感染伤口愈合的水凝胶的制备方法。其改变传统药物载体对药物负载的方式，提供一种通过氢键作用和静电作用吸附和释放多种药物。该制备方法优化了聚合条件，使未反应单体残留量最小。通过对不同类型分子的负载和缓释，展示了其在生物医学领域的广泛应用前景。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：
7.制备聚(丙烯酰胺-co-丙烯酸)水凝胶(pam-aa)，包含以下步骤：以丙烯酰胺(am)和丙烯酸(aa)为原料，以过硫酸铵/四甲基乙二胺(aps/temed)为引发体系，以n，n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺(mba)为交联剂，以60℃下反应5小时为反应条件，制备pam-aa水凝胶；此条件下
制备的am单体残余量为0.25％、aa单体残余量为0.12％。
8.本发明在制备好水凝胶基体材料后，将其冻干保存。在需负载分子时，将水凝胶浸泡于pbs溶液中达到溶胀平衡，将溶胀平衡后的水凝胶浸泡于一定浓度的待负载分子溶液中进行物理吸附负载。接着再浸泡于pbs溶液中，即可进行释放。
9.一种可负载多种分子并用于感染伤口愈合的水凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
10.步骤1：依次加入实验所需的am、aa、mba、aps以及temed于一定量的水中，并磁力搅拌使其溶解完全，再通过一定的温度梯度和时间梯度得到水凝胶产品，并将制备好的水凝胶进行冻干处理；
11.步骤2：将冻干的水凝胶研磨成粉末，再将其浸泡于水中5小时，取其中的液体进行hplc测试单体残余量。
12.步骤3：配制一定浓度的待负载分子(如强力霉素(dox)、亚甲基蓝(mb)、罗丹明b(rb)、考马斯亮蓝(cbb)和甲苯胺蓝(tb))溶液，并将溶胀平衡后的水凝胶浸泡在上述溶液中，进行负载和释放实验。
13.进一步地，步骤1中所述am和aa总的单体固含量为25wt％，而am和aa的质量比为13：2，mba/单体为0.1wt％，aps/单体为0.9wt％，temed/单体为0.6wt％。
14.进一步地，步骤2中所述hplc测试前，将水凝胶冷冻干燥，并研磨成细碎状，将0.1g水凝胶干块加入到10ml的水中浸泡5小时，提取残余单体。
15.进一步地，步骤3中，将100μl的溶液所成的水凝胶进行溶胀平衡后分别放进10ml的100μg/ml的dox溶液、10ml的100μg/ml的mb溶液、10ml的100μg/ml的rb、10ml的100μg/ml的cbb溶液和10ml的100μg/ml的tb溶液中进行负载实验。达到负载平衡后再转移至pbs溶液中，进行释放实验。强力霉素是一种天然广谱抗菌剂，属于半合成的四环素类抗生素，其抗菌机理是通过阻止trna进入核糖体来阻断细菌内蛋白质的合成，进而裂解细菌的染色体，起到抗菌消炎的作用。采用所述水凝胶负载强力霉素可达到较好的缓释效果，使水凝胶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的体外和体内抗菌活性。
16.本发明以pam-aa水凝胶作为基体材料，通过摸索确定60℃反应5小时为聚合反应条件，尽可能降低单体残余量，从而确保水凝胶基体材料基本无细胞毒性。再通过氢键作用和电荷作用吸附负载多种分子，可以实现使用前药物和水凝胶基体材料分离保存的效果。特别地，采用负载强力霉素的水凝胶应用于感染皮肤伤口的愈合，在体内外都有较好的抗菌效果，促进感染皮肤伤口的愈合过程。
17.相对于现有技术，本发明具有如下优点：
18.1、优化了反应条件，降低水凝胶的单体残余量，使得水凝胶基体材料基本无细胞毒性，免去了通过浸泡去除水凝胶单体残余量的问题。
19.2、通过氢键作用和静电作用进行药物的负载和释放，可以实现药物和基体材料分离保存，实现水凝胶干态保存的目的。干态水凝胶更易保存，同时能避免湿态水凝胶容易长霉菌的问题。
20.3、本发明的可负载多种分子的水凝胶能够通过氢键和静电作用吸附和释放药物分子，能达到很好的缓释效果，具有潜在应用于皮肤伤口敷料的优势。
附图说明
21.图1在反应温度为60℃下，am和aa的单体残余量随着反应时间的变化图；
22.图2在反应时间为5小时下，am和aa的单体残余量随着反应温度的变化图；
23.图3dox、mb、rb、cbb、tb分别在相应的pbs溶液中负载量随孵育时间变化图。
24.图4dox、mb、rb、cbb和tb在pbs溶液中释放率随孵育时间变化图。
24.图5用pam-aa25和pam-aa25@dox水凝胶对l929细胞共培养24小时进行体外活力评价。
25.图6体外抗菌实验，左3个样品为与pam-aa25和pam-aa25@dox水凝胶接触或不接触24小时后耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa)和大肠杆菌(e.coli)的cfu照片，最右边为水凝胶对mrsa和e.coli的抑制圈。红色和蓝色的圈表示水凝胶和抑制圈的范围。
26.图7模型组(model)、百多邦组(bactroban)、pam-aa25组、pam-aa25@dox组分别于0、3、6、9、12天拍摄创面照片。
27.图8体内抗菌实验，3、6天时模型、bactroban、pam-aa25、pam-aa25@dox的mrsa的cfu照片。
具体实施方式
28.以下将结合附图对本发明的具体实施方案进行详细描述。
29.实施例1：
30.空白水凝胶pam-aa的制备以反应条件探索，包含以下步骤：
31.1、以am和aa为原料，以aps/temed为引发体系，以mba为交联剂，合成水凝胶。首先，将am和aa在磁搅拌下溶于一定量的水中，分别得到15％、20％和25wt％的溶液。aa与am的质量比保持在2:13。然后依次加入mba、aps和temed，在磁搅拌下得到均匀溶液。mba、aps和temed与单体的质量比分别为0.1％、0.9％和0.6wt％。最后，在60℃下聚合5小时，得到水凝胶。固体含量为15％、20％和25wt％的水凝胶分别命名为pam-aa15、pam-aa20和pam-aa25。三种水凝胶配方的参数如表1所示。表1 pam-aa水凝胶配方参数
32.2、采用pam-aa15水凝胶对聚合条件进行了优化，以获得低毒性且具有良好生物相容性的未反应单体最少的水凝胶。采用hplc作为一种高灵敏度的测量方法，对固定温度下的反应时间和固定时间下的反应温度这两个主要参数进行了研究。将制备的pam-aa15水凝胶冷冻干燥，然后研磨成细粉。将0.1g干燥的pam-aa15水凝胶粉浸泡在10ml水中5小时，提取残余单体。最后用hplc检测上清液，得到相应的峰面积值。计算出的单体浓度，计算出单
体残余率。图1为在反应温度为60℃下，am和aa的单体残余量随着反应时间的变化图；图2为在反应时间为5小时下，am和aa的单体残余量随着反应温度的变化图。
33.体外的负载和释放实验
34.在37℃条件下，将一定质量的达溶胀平衡后的pam-aa25水凝胶浸泡在10ml的pbs(ph＝7.4)溶液(分别含100μg/ml的dox、mb、rb、cbb和tb)中。在预定的时间间隔内，取100μl缓冲液，用分光光度法酶标仪测定吸光度，以分析药物浓度，并在试管中加入100μl新鲜缓冲液，保持体积恒定。根据吸光度值，得到相应的药物浓度。用同样的方法对药物的释放进行了类似的研究。负载dox水凝胶用于伤口愈合的体内实验，命名为pam-aa25@dox。图3为dox、mb、rb、cbb、tb分别在相应的pbs溶液中负载量随孵育时间变化图。图4为dox、mb、rb、cbb和tb在pbs溶液中释放率随孵育时间变化图。
35.采用cck-8检测试剂盒评价不同水凝胶样品提取物中细胞活力。简而言之，将20mg/ml水凝胶浸泡于细胞培养基中浸泡24小时得到提取物。96孔板每孔加入100μl含5
×
103细胞的细胞悬液。将细胞置于正常培养基中培养24小时，使细胞粘附。然后培养基换成预先准备好的提取物。以正常培养基作为对照培养24小时后，用pbs轻洗3次，然后加入150μl含10vol％cck-8的新鲜培养基。再孵育1-2小时，然后用酶标仪在450nm处测定每孔100μl培养基的光密度(od)。
36.图5为用pam-aa25和pam-aa25@dox水凝胶对l929细胞共培养24小时进行体外活力评价。
37.本实验以e.coli和mrsa分别作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的模型菌。mrsa是皮肤感染最常见的原因。使用前，将两种细菌在lb培养基中，在220r/min、37℃恒定振荡下培养。
38.采用平板菌落计数法检测不同样品对e.coli和mrsa的抑菌活性。首先取出一定体积的冷冻菌液，加入lb液体培养基离心管中，在37℃、220r/min的摇床中孵育过夜。将孵育后的溶液稀释至96孔板，用600nm微孔板分光光度法测定每孔100μl溶液的光密度(od)。当e.coli和mrsa的od值分别为0.35和0.58时，细菌浓度为109cfu/ml。细菌溶液的浓度稀释为107cfu/ml，每种水凝胶样品与500ml细菌溶液在37℃细菌孵化箱中孵育24小时。然后将与水凝胶共孵育的菌液稀释10-4
倍，取其中1ml涂于琼脂平板上，在37℃的细菌培养箱中孵育24小时。拍摄琼脂平板，计数菌落形成单位(cfu)。
39.图6为体外抗菌实验，左3个样品为与pam-aa25和pam-aa25@dox水凝胶接触或不接触24小时后mrsa和e.coli的cfu照片。
40.抑菌环试验评价其抑菌效果。简而言之，将1ml的105cfu/ml的e.coli和mrsa分别均匀地涂布在琼脂平板上。随后将pam-aa25和pam-aa25@dox水凝胶置于菌液包被的琼脂平板上，分别在37℃下孵育24小时。观察并测定了水凝胶在琼脂上的抑制圈。
41.图6最右边为水凝胶对mrsa和e.coli的抑制圈。红色和蓝色的圈表示水凝胶和抑制圈的范围。
42.在体内用感染的全层皮肤缺损模型评估伤口愈合过程
43.选用雄性sd大鼠(200g，6～8周)建立全层皮肤缺损感染模型，进行体内创面愈合实验。分为model、bactroban、pam-aa25、pam-aa25@dox组。所有大鼠术前适应1周。所有手术均在无菌条件下进行。然后用异氟烷气体麻醉大鼠，并在尾部和颈部之间的背部剃毛和脱
毛。每只大鼠背部制作4个直径10毫米的全层圆形皮肤创面。这些伤口对称地分布在老鼠的背部。然后在每个皮肤创面加入107cfu的masa，让细菌溶液渗入创面。model组未加敷料。bactroban组在创面上添加40μl市售bactroban敷料。水凝胶组采用pam-aa25水凝胶和pam-aa25@dox水凝胶覆盖创面。在第0、3、6、9、12天，对所有创面进行拍照，使用image j软件绘制创面边界，计算创面面积。
44.图7为model组、bactroban组、pam-aa25组、pam-aa25@dox组分别于0、3、6、9、12天拍摄创面照片。
45.将愈合第3天和第6天的组织标本浸泡在pbs中，研磨成均匀的组织液，评估各组对mrsa的抗菌活性。将组织液稀释10-5
倍后，取1ml涂于琼脂平板上，37℃细菌培养箱孵育24小时。拍摄琼脂平板，计数菌落形成单位(cfu)。
46.图8为体内抗菌实验，3、6天时模型、bactroban、pam-aa25、pam-aa25@dox的mrsa的cfu照片。
47.效果评估
48.虽然大多数水凝胶具有高度的生物相容性，但它们的前体单体却具有毒性。然而，这个重要的问题经常被忽视。由图1可知，以pam-aa15水凝胶为例，首先测定了残留的am和aa单体。在固定聚合温度为60℃时，随着聚合时间的延长，am和aa的残留量均呈下降趋势，在聚合5小时时，am和aa的残留量分别为1.33％和0.33％。进一步延长聚合时间并没有明显降低单体含量。由图2可知，将聚合时间固定在5小时，考察聚合温度的影响，结果表明，聚合温度最高时，残余单体含量最低。
49.为了证明pam-aa25水凝胶作为传递系统的负载和释放的多功能性，如图3和4所示，我们将5种不同类型的分子，即中性dox，带正电的mb、rb、tb和带负电的cbb，与溶胀平衡后的水凝胶孵育。这样，负载更可能是由分子和水凝胶之间的相互作用的热力学驱动。以dox为例，将溶胀平衡的pam-aa25水凝胶浸泡于100μg/ml的dox/pbs溶液中37℃孵育24小时，然后将负载dox的水凝胶浸泡在37℃的pbs中监测释放情况。这些药物的负载和释放在开始时相对较快，在负载10小时和释放2小时后趋于平稳。dox、mb、tb、rb和cbb的载药量分别为8.92、8.47、6.67、5.08和3.06μg/mg，释放率分别为12％、52％、100％、22％和2％。这些结果表明，无论水溶性分子的电荷性质如何，它们都能很好地实现负载，尽管中性和正电荷分子更容易负载。另一方面，分子间相互作用的强度和分子的大小都可能是影响释放的原因。一般来说，水凝胶和分子(例如dox和cbb)之间的氢键可能更好地维持有效负载，而静电相互作用可以被pbs中的盐屏蔽，从而导致更快和更大的正电荷分子(mb,tb,rb)的释放。
50.良好的细胞相容性是生物医学领域设计材料的先决条件。采用cck-8法评价水凝胶的细胞毒性。从图5可以看出，在pam-aa25、pam-aa25@dox和medium组中，l929的活力没有差异，说明两种水凝胶组都没有可检测到的细胞毒性。
51.四环素是一种广泛应用的广谱抗生素，其皮肤创面修复性能已在临床上得到很好的证实。负载dox水凝胶作为临床知名的“第二代”四环素，被认为具有良好的抗菌性能，这对预防伤口细菌感染至关重要。由图6左边三组所示，以pbs溶液培养的细菌为空白对照，采用平板法评价pam-aa25@dox水凝胶对e.coli(革兰氏阴性菌)和mrsa(革兰氏阳性菌)的抑菌活性。在琼脂平板上可以清楚地观察到许多e.coli和mrsa菌落。然而，暴露于pam-aa25@dox水凝胶的e.coli和mrsa的存活率显著降低，而单独暴露于pam-aa25水凝胶却没有降低。
pam-aa25@dox水凝胶对e.coli和mrsa的抑制率分别为81.0％和94.2％。
52.由图6最右边所示通过体外抑菌圈实验(水凝胶直径为17mm)进一步验证pam-aa25@dox的抗菌性能。而pam-aa25没有明显的抑菌能力，pam-aa25@dox组可以形成明显的抑菌圈。pam-aa25@dox组对mrsa和e.coli的抑制区直径分别为47和29mm。
53.由图7所示，在大鼠全层皮肤缺损感染模型中评价水凝胶敷料的创面愈合效果。随着时间的延长，model组、bactroban组(商品敷料软膏)、pam-aa25组和pam-aa25@dox治疗后，mrsa感染创面面积逐渐减少，但确切程度有显著差异。pam-aa25@dox组在整个治疗期间创面愈合速度最快，说明其对创面愈合有较高的促进作用。model组直到第9天均可观察到mrsa感染，其他组即使只使用pam-aa水凝胶也不明显。
54.在创面愈合过程中，创面敷料作为一种有效的抗菌剂，防止感染，减少创面的炎症反应，从而促进愈合过程。在此，如图8所示，每组在体内对第3天和第6天的mrsa的抗菌行为评估愈合过程。用平板法测定伤口部位提取的mrsa菌落数量。与第3天相比，bactroban和pam-aa25@dox组在第6天的菌落数量显著减少，揭示了随着时间的推移它们的抗菌效果。第3天，bactroban组和pam-aa25@dox组的抑制率分别为83％和95％，与model组相比，第6天分别扩大到85％和97％。与model组相比，pam-aa25也表现出一定的抗菌作用。pam-aa25@dox对dox的维持和缓释应该是其体内抗菌性能最好的主要原因。值得一提的是，由于体内液体量少，药物在体内的释放速度要比体外慢得多，因此可以在伤口上维持相当长的时间。
55.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，本领域的技术人员仍可根据本发明的内容和具体实施例的部分，对形式和一些细节上做出很多的改变或补充，这些改变和补充也应视为本发明的保护范围。