喙尾琵甲提取物在化妆品中的应用

1.本发明涉及中药化妆品技术领域，特别涉及喙尾琵甲提取物在化妆品中的应用。


背景技术：

2.喙尾琵甲，也称喙尾琵琶甲、云南琵琶甲、日本琵琶甲、日本琵琶甲云南亚种等，是云南彝族地区长期使用的一种药用昆虫，民间用于治疗肿瘤、心血管及类风湿等疑难病症的处方中，大多数都含有该昆虫成分。经前人不断验证，其含有多种有益成分，并且其营养物质丰富，含有9种人体必需微量元素、16种游离氨基酸和16种蛋白氨基酸，现代药理学研究表明其具有广泛的药理作用。
3.与化学合成成分相比，天然中药成分的优势表现为来源绿色、环保、可生物降解，安全性相对较高并具有一定的护肤效果。虽不及植物应用那么广泛，但昆虫作为中药应用在我国也有着几千年的历史，临床经验也证实昆虫作为中药应用，其具有护肤功效和使用安全性，我国古代长期积累的中药养颜、美容经验也为化妆品开发提供了线索和研发方向。
4.中国专利cn02134188.5公开了一种以云南琵琶甲提取物为作为主要成分的抗菌消炎制剂，该制剂中的琵甲提取物是以乙醇或其他醇作为溶剂进行提取的，且提取得到的琵甲提取物具有清热解毒、抗菌消炎的作用，可用于治疗急慢性支管炎、咽炎、牙周炎、牙龄炎及无名肿毒等症。目前，本领域中还没有将喙尾琵甲提取物应用于化妆品方面的报道。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种喙尾琵甲提取物在化妆品中的应用。本发明将喙尾琵甲提取物应用于化妆品中，喙尾琵甲提取物能够清除自由基、抑制黑色素产生、提高皮肤美白效果，醇提物甚至具有抑制炎症因子释放的功能，在化妆品领域具有广阔的应用前景。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.喙尾琵甲提取物在化妆品中的应用，所述喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲醇提物或喙尾琵甲水提物；
8.所述喙尾琵甲提取物的制备方法包括：
9.使用提取剂对喙尾琵甲粉末进行浸提，得到提取液；所述提取剂为水或乙醇；
10.将所述提取液依次进行浓缩和冷冻干燥，得到喙尾琵甲提取物；当所述提取剂为乙醇时，所得喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲醇提物，当所述提取剂为水时，所得喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲水提物。
11.优选的，当所述提取剂为水时，所述浸提的温度为室温，次数为3～4次，每次浸提的时间为48～96h；所述浸提时喙尾琵甲粉末和水的体积比为1：3～5。
12.优选的，当所述提取剂为乙醇时，所述浸提的温度为室温，次数为2～4次，每次浸提的时间为48～96h；所述浸提时喙尾琵甲粉末和乙醇的体积比为1：7～9。
13.优选的，所述乙醇的体积分数为70～95％。
14.优选的，所述喙尾琵甲粉末由喙尾琵甲干虫粉碎过筛后得到。
15.优选的，所述过筛用筛网的目数为50目。
16.优选的，所述化妆品包括美白化妆品、抗氧化化妆品、抗菌化妆品或抗炎化妆品。
17.优选的，所述喙尾琵甲提取物和补水保湿成分配合使用。
18.本发明提供了喙尾琵甲提取物在化妆品中的应用，所述喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲醇提物或喙尾琵甲水提物；所述喙尾琵甲提取物的制备方法包括：使用提取剂对喙尾琵甲粉末进行浸提，得到提取液；所述提取剂为水或乙醇；将所述提取液依次进行浓缩和冷冻干燥，得到喙尾琵甲提取物。本发明采用水和乙醇对喙尾琵甲粉末提取，并对提取液进行浓缩和冻干，很大程度上消除了水和醇的影响，然后将所得提取物应用于化妆品中，开拓了喙尾琵甲在化妆品应用方面的价值，为功效性中药化妆品的研发和推广提供思路以及理论基础。实施例结果表明，喙尾琵甲提取物安全性好，能够清除自由基、抑制黑色素产生、提高皮肤美白效果，具有抑菌活性，喙尾琵甲醇提物还具有抑制炎症因子释放的功能，并且和补水保湿成分配合使用能够更好的发挥喙尾琵甲醇提物的功效，在制备美白化妆品、抗氧化化妆品、抗菌化妆品或抗炎化妆品方面具有广阔的应用前景。
附图说明
19.图1为实施例3中喙尾琵甲水提物细胞毒性检测结果；
20.图2为实施例3中喙尾琵甲醇提物细胞毒性检测结果；
21.图3为实施例4中喙尾琵甲水提物abts自由基清除活性检测结果；
22.图4为实施例4中喙尾琵甲醇提物abts自由基清除活性检测结果；
23.图5为实施例5中喙尾琵甲醇提物抑制il-10炎症因子的检测结果；
24.图6为实施例5中喙尾琵甲醇提物抑制tnf-γ炎症因子的检测结果；
25.图7为实施例7中喙尾琵甲水提物酪氨酸酶抑制活性检测结果；
26.图8为实施例7中喙尾琵甲醇提物酪氨酸酶抑制活性检测结果。
具体实施方式
27.本发明提供了一种喙尾琵甲提取物在化妆品中的应用，所述喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲醇提物或喙尾琵甲水提物。
28.在本发明中，所述喙尾琵甲提取物的制备方法包括：
29.使用提取剂对喙尾琵甲粉末进行浸提，得到提取液；所述提取剂为水或乙醇；
30.将所述提取液依次进行浓缩和冷冻干燥，得到喙尾琵甲提取物；当所述提取剂为乙醇时，所得喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲醇提物，当所述提取剂为水时，所得喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲水提物。
31.本发明使用提取剂对喙尾琵甲粉末进行浸提，得到提取液；所述提取剂为水或乙醇。在本发明中，所述水优选为去离子水；当所述提取剂为水时，所述浸提的温度优选为室温，次数优选为3～4次，每次浸提的时间优选为48～96h，更优选为60～72h；所述浸提时喙尾琵甲粉末和水的体积比优选为1：3～5，更优选为1：4；本发明优选将每次浸提所得液体合并，得到提取液，当所述提取剂为水时，所得提取液为水提液。
32.在本发明中，当所述提取剂为乙醇时，所述乙醇的体积分数优选为70～95％，更优选为85～95％；所述浸提的温度优选为室温，次数优选为2～4次，更优选为3～4次，每次浸
提的时间优选为48～96h，更优选为60～72h；所述浸提时喙尾琵甲粉末和乙醇的体积比优选为1：7～9，更优选为1：8；本发明优选将每次浸提所得液体合并，得到提取液，当所述提取剂为醇时，所得提取液为醇提液。
33.在本发明中，所述喙尾琵甲粉末由喙尾琵甲干虫粉碎过筛后得到，所述过筛用筛网的目数为50目，过筛后，取筛下物，即为所述喙尾琵甲粉末。本发明对所述喙尾琵甲干虫没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的喙尾琵甲干虫即可。
34.得到提取液后，本发明将所述提取液依次进行浓缩和冷冻干燥，得到喙尾琵甲醇提物。在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩，所述浓缩的温度优选为40～45℃，压力优选为0.06～0.1mpa，本发明通过浓缩去除提取液中的溶剂，消除溶剂对提取物功效的影响；在本发明中，浓缩所得浸膏的相对密度(以水为参考物质)优选为1.05～1.3；在本发明中，所述冷冻干燥优选在冻干机中进行；本发明对所述冷冻干燥的具体条件没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的条件即可。冷冻干燥后，所得冻干粉即为本发明的喙尾琵甲提取物；当所述提取剂为乙醇时，所得喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲醇提物，当所述提取剂为水时，所得喙尾琵甲提取物为喙尾琵甲水提物。
35.在本发明中，所述化妆品优选包括美白化妆品、抗氧化化妆品、抗菌化妆品或抗炎化妆品；所述喙尾琵甲提取物优选和补水保湿成分配合使用。本发明对所述喙尾琵甲提取物在化妆品中的具体应用方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法，将喙尾琵甲提取物添加到化妆品配方中，制备呈不同种类的化妆品即可，具体如乳液、膏霜等。
36.下面结合实施例对本发明提供的方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.实施例1
38.将1kg喙尾琵甲干虫用粉碎机粉碎成粉末，过50目筛，并用90％的无水乙醇浸泡，喙尾琵甲粉末体积和无水乙醇的体积比为1:9，共浸提3次，每次浸泡72h，过滤后合并过滤液，在40～45℃，0.06～0.1mpa条件下减压浓缩至膏状，得到相对密度为1.05～1.30的喙尾琵甲醇提物浸膏，最后用冷冻冻干机冻干，即得喙尾琵甲醇提物冻干粉，将所得冻干粉应用于下列实施例中，进行功效测试。
39.对所得醇提物的成分进行鉴定，得出醇提物中包括的主要化学成分，具体如表1所示：
40.表1喙尾琵甲醇提物主要成分
54-甲氧基肉桂醛c
10h10
o267-乙酰基-3,6-二羟基-8-甲基四氢萘酮c
13h14
o47苯甲酸丁酯c
11h14
o28腺嘌呤c5h5n591-(4-甲基苯基)吡咯烷-2,5-二酮c
11h11
no210d-(+)-麦芽糖c
12h22o11
11双(甲基亚苄基)山梨糖醇c
22h26
o612甘油磷酸甘油c6h
1508
13癸烯酸c
10h18
o314山梨酸c6h8o248.根据表2可以看出，喙尾琵甲水提物的主要成分均为对人体没有影响的有机物，且没有化妆品中不允许添加的物质，说明喙尾琵甲水提物应用于化妆品中，安全性较好。
49.实施例3：喙尾琵甲提取物安全性实验
50.喙尾琵甲水提物、醇提物对raw264.7细胞毒性实验：
51.样品制备：将喙尾琵甲水提物用含10％胎牛血清、2％的青链霉素混合液的rpmi1640培养基配制成2mg/ml的初始溶液，将初始溶液进行2倍稀释，共得到浓度为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03175mg/ml、0.015875mg/ml的8个水提物样品；
52.将喙尾琵甲醇提物进行相同的配制和稀释，得到上述浓度的8个醇提物样品；
53.将上述8个浓度、共16个样品进行实验，具体步骤如下：
54.(1)铺板：将对数生长期的raw264.7细胞用胰酶消化，加含10％胎牛血清、2％的青链霉素混合液的rpmi1640配制成细胞悬液，在96孔板中接种100μl的细胞悬液，每孔1
×
105个细胞，将96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱培养；
55.(2)处理细胞：细胞贴壁后，将96孔板中的培养基吸出，加入100μl不同浓度的受试液，对照组不加入提取物溶液，加入相同剂量的pbs；将96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱培养。
56.(3)24h后，向每孔加入10μl cck-8溶液，注意不要打出气泡，以免影响读数。将96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱培养1h左右，使用酶标仪测定其在450nm处的吸光度值，按照下式计算细胞的存活率。
57.细胞存活率＝[(as-ab)/(ac-ab)]
×
100％
[0058]
其中：as:实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液和药物溶液)；
[0059]
ac:对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液，不含药物)；
[0060]
ab:空白孔吸光度(含培养基、cck-8溶液，不含细胞、药物)。
[0061]
所得结果如图1～2所示，图1为喙尾琵甲水提物细胞毒性检测结果，图2为喙尾琵甲醇提物细胞毒性检测结果。根据图1～2可以看出，同对照组(pbs)相比，水提物和醇提物在0.015875mg/ml～0.5mg/ml范围内，细胞存活率均明显增高，说明在此浓度范围内，喙尾琵甲提取物在中药化妆品领域的应用是安全可靠的。
[0062]
实施例4
[0063]
喙尾琵甲水提物和喙尾琵甲醇提物对abts的清除作用
[0064]
被测物质加入abts自由基溶液后，所含抗氧化成分能与abts自由基发生反应而使反应体系褪色，405nm的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。采用abts自由基清除能力试剂盒通过测定吸光度下降的程度来反映喙尾琵甲提取物清除abts自由基的能力，步骤如下：
[0065]
根据试剂盒操作步骤逐步操作，控制喙尾琵甲提取物的浓度分别为0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml，充分混匀后室温避光静置6min，测定405nm处的吸光度；采用不加喙尾琵甲提取物的实验组为空白对照，采用不加abts的工作液作为对照组，采用维生素c作为阳性对照。空白管、对照管、标准管和测定管的吸光值分别记为a空白、a对照、a阳性对照和a测定。样本的自由基清除率计算公式如下：
[0066]
abts自由基清除率d％＝[a空白-(a测定-a对照)]
÷
a空白
×
100％
[0067]
所得结果如图3～4所示，图3为喙尾琵甲水提物abts自由基清除活性检测结果，图4为喙尾琵甲醇提物abts自由基清除活性检测结果。根据图3可以看出，随着喙尾琵甲水提物浓度的增加，其对abts自由基清除率的活性增强，当喙尾琵甲水提物的浓度从0.625mg/ml增加到10mg/ml时，其清除率从39.83％增加到了91.3％。根据图4可以看出，当喙尾琵甲醇提物的浓度从0.625mg/ml增加到10mg/ml时，其清除率也从44.12％增加到了90.43％。以上结果表明，喙尾琵甲提取物具有较强的抗氧化性。
[0068]
实施例5
[0069]
喙尾琵甲水提物和醇提物对经lps刺激的raw264.7巨噬细胞分泌tnf-γ、il-10的影响，测试步骤如下：
[0070]
(1)铺板：将对数生长期的raw264.7细胞用胰酶消化，加含10％胎牛血清、2％的青链霉素混合液的rpmi1640配制成细胞悬液，在96孔板中接种100μl的细胞悬液，每孔1
×
106个细胞，将96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱培养；
[0071]
(2)lps准备：将lps用含2％的青链霉素混合液的rpmi1640培养基溶解，并稀释成2μg/ml的终浓度，将原先的细胞悬液吸出，改加每孔100μl的lps，以不加lps作为空白对照，培养24h；
[0072]
(3)样品准备：取适量喙尾琵甲醇和水提物，加2％的青链霉素混合液的rpmi1640培养基溶解，将喙尾琵甲醇提物配制成2mg/ml的初始浓度，二倍稀释4个浓度的样品，并使用一次性注射器和0.22μm的过滤器对其进行过滤处理；
[0073]
(4)处理细胞：lps处理后，将96孔板中的培养基吸出，加入100μl不同浓度的受试液。将96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱培养24h，以不加样品处理的lps作为阴性对照，地塞米松作为阳性对照，培养24h。
[0074]
(5)开始收集不同浓度的样品以及各对照组，用elisa试剂盒检测不同样品对炎症因子的分泌量的效果。
[0075]
结果发现，喙尾琵甲水提物没有消除炎症因子的作用，只有喙尾琵甲醇提物发挥了抗炎效果。图5～6为喙尾琵甲醇提物il-10炎症因子和tnf-γ炎症因子的检测结果。根据图5～6可以看出，在lps的刺激下，小鼠巨噬细胞的il-10、tnf-γ这种促炎性因子的分泌量有所增加，经过不同浓度的喙尾琵甲醇提物处理后，与未经样品处理的lps模型组相比，il-10、tnf-γ的分泌量显著降低，说明喙尾琵甲醇提物对il-10、tnf-γ具有明显的抑制作用。
[0076]
实施例6
[0077]
喙尾琵甲提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的刺激作用
[0078]
lb平板培养基接种：将灭菌的棉棒蘸取菌液，于管壁上挤去多余菌液，在lb平板培养基上均匀涂布，并沿平皿边缘环扫一圈，盖好平皿，干燥2min。将经过灭菌的直径为0.5cm的小滤纸片粘贴于培养基表面，分别取10μl水提物和醇提物(浓度为2mg/ml，溶剂为pbs)滴加于滤纸片中央，待滤纸片完全吸收样品之后，37℃恒温培养箱中倒置培养18～20h，观察是否有抑菌圈生成并做3次重复，测抑菌圈直径，将3组抑菌圈直径取平均值；抑菌圈实验判定标准：抑菌圈实验大于20mm，极敏；15～20mm，高敏；10～15mm，中敏；7～10mm，低敏；小于7mm，不敏感。
[0079]
所得结果如表1所示：
[0080]
表1喙尾琵甲提取物抑菌活性测试结果
[0081][0082]
表1中的结果表明，喙尾琵甲醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定程度的抑制作用，而水提物仅对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。由于人体的皮肤暴露于空气中，其表面也会产生金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌类物质，在合适条件下，这些细菌会大量繁殖，对皮肤产生伤害，引发一些无法避免的炎症，因此，喙尾琵甲提取物既对这些菌有效，也不会引发炎症，具有成为中药化妆品天然原料的应用潜力。
[0083]
实施例7
[0084]
喙尾琵甲提取物酪氨酸酶活性抑制实验，步骤如下：
[0085]
将喙尾琵甲提取物(醇提物和水提物)溶解于pbs溶液中，配制成浓度为2mg/ml的初始溶液，然后将初始溶液进行二倍稀释，得到浓度为1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml的提取物溶液，作为待测样品。
[0086]
取a、b、c、d四只试管，分别加入0.25ml的1mg/ml的l-酪氨酸溶液(溶剂为pbs)，向a和c管中另加入0.25ml pbs溶液.向b和d管中分别加入0.25ml的待测样品。将4支试管中的溶液混匀，在37℃恒温水浴锅中加热10min后，于c和d管中加入0.25ml的0.07mg/ml的酪氨酸酶液，a和b管加入相同体积的pbs缓冲液补足测试样体积，在将四只试管置于37℃水浴锅继续保温反应20min。分别从4支试管中取上述试液加入石英比色皿中，用酶标仪检测475nm处的吸光值.按下式计算酪氨酸酶抑制率，以熊果苷作为阳性对照。
[0087]
酪氨酸酶抑制率：i＝[(c-a)-(d-b)]/(c-a)
×
100％
[0088]
所得结果如图7～8所示，图7为喙尾琵甲水提物酪氨酸酶抑制活性检测结果，图8为喙尾琵甲醇提物酪氨酸酶抑制活性检测结果。根据图7～8可以看出，不同浓度的喙尾琵甲水提物与喙尾琵甲醇提物对照组相比，具有显著差异性(p《0.01)，并且当浓度为1mg/ml时，喙尾琵甲水提物与喙尾琵甲醇提物的酪氨酸酶抑制率均能达到50％以上，以上结果表明，喙尾琵甲提取物具有抑制黑色素的效果，具有美白作用。
[0089]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。