一种中草药微生物发酵制剂及其制备、应用方法与流程

1.本发明涉及中药发酵技术领域，具体涉及一种中草药微生物发酵制剂及其制备、应用方法。


背景技术：

2.中药发酵技术，又称中药生物转化技术，是在继承传统中药发酵炮制方法的基础上，结合现代微生态学、生物工程学、发酵工程技术，对提取的中药有效成分进行生物学转化，将中药的大分子物质，经过微生物转化成为能够被人体肠道直接吸收的小分子成分，加快中药吸收、定量治疗疾病。现代中药发酵工艺起步于上世纪80年代，最早多为单味中药发酵，且主要集中在真菌自身发酵方面，如灵芝菌、冬虫夏草菌丝体发酵。目前，对中药发酵的研究已从单味药发展到了复方药，发酵菌种除了真菌类外，也扩大到有益细菌类，比如光合细菌类、乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母菌类等；现代中药发酵工艺以优选的有益菌群中的一种或几种，加入中草药制成了含有中药活性成分、菌体及其代谢产物的中草药微生物发酵制剂。
3.微生物在生长过程中会产生各种各样的生物活性物质，有些微生物在生长过程中可以分泌几十种胞外酶到培养基中去,微生物进行生命活动所产生的胞内酶更是有成百上千,这些丰富而强大的酶系是中药发生化学反应的物质基础,可以将药物的成分分解转化形成新的有效成分,这些新成分成为新的活性药物筛选的物质基础，或将毒性成分分解以降低药物的毒副作用；另一方面,由于微生物也会形成丰富多样的次生代谢产物,其有些本身就是功效良好的药物；或以中药中的有效成分为前体,经微生物的代谢可以形成新的化合物，或微生物的次生代谢产物和中药中的成分发生反应形成新的化合物，微生物次生代谢产物还可以和中药的有效成分发生复方协同作用。
4.当前中草药微生物发酵制剂的制备多以中药提取液为基质加入菌种培养发酵制得，一方面，液体发酵虽可以缩短发酵时间、提高生产效率，但提取效率较低，中药利用度不高，另一方面，中药提取液中含有大量的有效成分，其大多具有良好的抑菌性能，容易造成发酵菌生长抑制，而且，制剂中的活菌极易受外界环境条件影响而灭活，难以长期有效保持活性。


技术实现要素：

5.针对上述问题中的至少一个，本发明提供一种中草药微生物发酵制剂及其制备、应用方法。
6.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
7.一种中草药微生物发酵制剂的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将中草药组合物破碎混合，加水调整湿度后接种第一复合发酵菌进行发酵培养，制得固态发酵产物；
9.(2)以所述固态发酵产物为原料，通过溶剂提取法制得中药提取液；
10.(3)以所述中药提取液为发酵基质，接入第二复合发酵菌进行发酵培养，制得所述中草药微生物发酵制剂。
11.优选的，第一复合发酵菌包括光合菌、固氮菌、芽孢杆菌和乳杆菌，所述第一复合发酵菌的制备方法为：以培养基质分别对光合菌、固氮菌、芽孢杆菌和乳杆菌进行活化并扩大培养，分别扩大培养10-16h，再按活菌数量比为5：(3-6)：(8-12)：(5-10)混合制得。
12.优选的，所述第二复合发酵菌包括放线菌、乳杆菌、酵母菌和红酵母，所述第二复合发酵菌的制备方法为：以培养基质分别对放线菌、乳杆菌、酵母菌和红酵母进行活化并扩大培养，分别扩大培养10-16h，再按活菌数量比为5：(5-7)：(2-4)：(1-2)混合制得。
13.优选的，所述中草药组合物包括枸杞子、黄芪、黄柏、三七、甘草、麦芽和茯苓。
14.优选的，所述第二复合发酵菌还包括有载体。
15.优选的，所述载体为改性蒙脱石。
16.优选的，所述改性蒙脱石的制备方法包括以下步骤：
17.(a)剥层处理
18.称取天然蒙脱石粉末并分散在去离子水中，加入1wt.％的聚乙二醇，在常温下搅拌反应6-10d，再在6000-8000rpm转速下离心处理10min，重复离心处理2-3次，去除沉淀后制得均匀分散的蒙脱石纳米片悬浮液；
19.其中，所述天然蒙脱石粉末在去离子水中的分散比为1-2g/100ml；
20.(b)表面改性
21.将所述蒙脱石纳米片悬浮液升温至40-50℃，加入30wt.％的过氧化氢溶液和氨丁三醇，充分搅拌混合后继续保温搅拌反应1-20min，反应完成后加入盐酸多巴胺，再在搅拌条件下逐滴滴加引发剂溶液，滴加完成后继续搅拌反应1-10min，封闭反应体系，转入160-180℃的恒温烘箱中保温反应10-14h，反应完成后冷却，分离出沉淀并依次以无水乙醇和去离子水洗涤，干燥制得表面改性的蒙脱石纳米片；
22.其中，所述蒙脱石纳米片悬浮液中的蒙脱石纳米片与所述过氧化氢溶液、所述氨丁三醇、盐酸多巴胺、所述引发剂的质量比例为1：(18-24)：(5-6)：(0.75-1)：(0.2-0.4)；
23.(c)多孔化组装
24.称取聚乙烯醇并分散溶解在二甲亚砜溶液中，升温搅拌至完全溶解，继续搅拌升温至80-90℃，然后依次加入甲醛基四苯乙烯与对甲苯磺酸，充分搅拌混合后得到黄色溶液，继续保温搅拌1-6h至溶液黄色褪去，加入过量的丙酮溶剂，至无白色絮状沉淀析出，分离白色絮状沉淀，以丙酮洗涤，蒸除丙酮后得到四苯乙烯羧酸衍生物；称取非离子型表面活性剂并溶解在去离子水中，制得溶液a，搅拌升温至80-90℃，加入所述四苯乙烯羧酸衍生物，充分搅拌混合后再加入所述表面改性的蒙脱石纳米片并分散，搅拌反应过夜后制得悬浮液a，将所述悬浮液a冻干，制得孔化组装的蒙脱石纳米片；
25.其中，所述聚乙烯醇在所述二甲亚砜溶液中的分散比为1-10g/100ml，所述聚乙烯醇与
26.所述甲醛基四苯乙烯、所述对甲苯磺酸的质量比例为1：(8-12)：(0.1-0.15)；所述溶液a的浓度在0.1-0.2g/100ml，所述溶液a与所述四苯乙烯羧酸衍生物、所述表面改性的蒙脱石纳米片的质量比例为100：(0.5-2)：(3-5)；
27.(d)固定化
28.将所述孔化组装的蒙脱石纳米片搅拌分散在四氢呋喃中，加入聚二甲基硅氧烷的碱溶液，充分混合后蒸除四氢呋喃，搅拌升温至80-90℃，边搅拌边少量多次地加入固化剂，加入完毕后继续保温搅拌反应12-16h，反应完成后滤出沉淀，沉淀依次以碱性溶液和去离子水洗涤，干燥后制得所述改性蒙脱石；
29.其中，所述孔化组装的蒙脱石纳米片与聚二甲基硅氧烷的质量比例为(2-3)：1。
30.本发明的有益效果为：
31.(1)传统中药发酵的发酵工艺是凭主观经验判断和控制，存在较大的主观性和随意性，其质量的稳定性难以保证，利用度也不高；本发明通过二次发酵，将固体发酵和液体发酵结合，优先以第一复合发酵菌对中药进行发酵处理，微生物在发酵期间对中草药细胞进行了破壁，使得有效物质较易溶出，进而提高了活性成分的浓度，同时将难以被人体直接吸收、利用的大分子有效活性物质进行初步降解，也降低了提取液对后期发酵的生长抑制；中草药经第一复合发酵菌酵解后进行浸提，以提取液作为二次发酵基质，由于第二复合发酵菌的生长代谢过程中产生纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等多种胞内和胞外酶类，有着非常强大的分解转化物质的能力，并能产生丰富的次生代谢产物或和中药中的成分发生反应形成新的化合物，可以和中药的有效成分发生复方协同作用，使得其中的中药有效成分、活性物质被最大限度的提取并高效地被人体吸收利用。
32.(2)中药提取液中含有的抑菌成分容易造成发酵菌生长抑制，同时制剂中的活菌极易受外界环境条件影响而灭活，难以长期有效保持其益生保健活性；本发明通过在第二复合发酵菌种加入细菌载体，为细菌的生长定殖提供保护，降低抑菌成分对发酵菌的生长抑制，更进一步的，本发明在天然蒙脱石的基础上制备为改性载体，进一步提高其对发酵菌的负载和保护性能，具体的，本发明先将天然蒙脱石进行剥层处理，制备为分散片层，再通过引发聚合的方法在表面生长一层聚多巴胺改性层，基于聚多巴胺良好的生物结合度，可以促进发酵菌在硅酸盐矿物上的快速定殖，进一步的，本发明利用四苯乙烯的大平面结构为导向，以表面活性剂溶液中的胶束粒子为模板剂，使得改性纳米片在胶束粒子表面进行堆叠构筑孔化结构，再通过聚二甲基硅氧烷固定，制得所述改性蒙脱石载体，可以降低了外界环境对益生菌的活性影响，提高制剂稳定性。
具体实施方式
33.结合以下实施例对本发明作进一步描述。
34.实施例1
35.本实施例涉及一种中草药微生物发酵制剂的制备方法，包括以下步骤：
36.(1)按以下重量份数比例配置中草药组合物：枸杞子8-10份、黄芪10-12份、黄柏4-6份、三七4-6份、甘草12-15份、麦芽15-16份和茯苓6-8份；
37.(2)以培养基质分别对光合菌(沼泽红假单胞菌)、固氮菌(褐球固氮菌)、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌进行活化并扩大培养，分别扩大培养12h，再按活菌数量比为5：4：10：6混合制得所述第一复合发酵菌；
38.以培养基质分别对放线菌(链霉菌)、嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌、酵母菌、红酵母进行活化并扩大培养，分别扩大培养12h，再按活菌数量比为5：6：3：1混合制得所述第二复合发酵菌；
39.所述培养基质按重量份数，包括碳源4～6份，氮源9～12份，无机盐0.3～0.4份；
40.(3)将所述中草药组合物破碎后混合，加水调整湿度至20％后接种第一复合发酵菌进行发酵培养，制得固态发酵产物；
41.(4)以所述固态发酵产物为原料，加水浸提制得中药提取液；在1t的纯净水中加入50公斤中药提取液、30公斤赤砂糖混合，紫外线消毒杀菌后，在28-30℃的无菌厂房内进行好氧发酵7d，期间每3h搅拌一次；完成后接入第二复合发酵菌进行发酵培养，在28-30℃下的密封厌氧罐内发酵至检测活菌数大于106，发酵时间15d，制得所述中草药微生物发酵制剂。
42.实施例2
43.本实施例涉及一种中草药微生物发酵制剂的制备方法，其与实施例1的区别在于：所述第二复合发酵菌中还包括有改性蒙脱石载体，具体包括以下步骤：
44.(1)按以下重量份数比例配置中草药组合物：枸杞子8-10份、黄芪10-12份、黄柏4-6份、三七4-6份、甘草12-15份、麦芽15-16份和茯苓6-8份；
45.(2)以培养基质分别对光合菌(沼泽红假单胞菌)、固氮菌(褐球固氮菌)、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌进行活化并扩大培养，分别扩大培养12h，再按活菌数量比为5：4：10：6混合制得所述第一复合发酵菌；
46.以培养基质分别对放线菌(链霉菌)、嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌、酵母菌、红酵母进行活化并扩大培养，分别扩大培养12h，再按活菌数量比为5：6：3：1混合制得所述第二复合发酵菌；
47.所述培养基质按重量份数，包括碳源4～6份，氮源9～12份，无机盐0.3～0.4份；
48.(3)将所述中草药组合物破碎后混合，加水调整湿度至20％后接种第一复合发酵菌进行发酵培养，制得固态发酵产物；
49.(4)以所述固态发酵产物为原料，加水浸提制得中药提取液；在1t的纯净水中加入50公斤中药提取液、30公斤赤砂糖混合，紫外线消毒杀菌后，在28-30℃的无菌厂房内进行好氧发酵7d，期间每3h搅拌一次；完成后接入第二复合发酵菌进行发酵培养，在28-30℃下的密封厌氧罐内发酵至检测活菌数大于106，发酵时间10d，制得所述中草药微生物发酵制剂；
50.所述改性蒙脱石的制备方法包括以下步骤：
51.(a)剥层处理
52.称取天然蒙脱石粉末3g并分散在500ml去离子水中，加入终浓度1wt.％的聚乙二醇，在常温下搅拌反应7d，再在6000-8000rpm转速下离心处理10min，重复离心处理3次，去除沉淀后制得均匀分散的蒙脱石纳米片悬浮液；
53.(b)表面改性
54.将所述蒙脱石纳米片悬浮液升温至40-50℃，加入10ml 30wt.％的过氧化氢溶液和2.5g氨丁三醇，充分搅拌混合后继续保温搅拌反应1-20min，反应完成后加入0.4g盐酸多巴胺，再在搅拌条件下逐滴滴加0.1mol/l的过硫酸铵溶液，滴加完成后继续搅拌反应10min，封闭反应体系，转入160-180℃的恒温烘箱中保温反应10-14h，反应完成后冷却，分离出沉淀并依次以无水乙醇和去离子水洗涤，干燥制得表面改性的蒙脱石纳米片；
55.(c)多孔化组装
56.称取聚乙烯醇6g并分散溶解在100ml的二甲亚砜溶液中，升温搅拌至完全溶解，继续搅拌升温至80-90℃，然后依次加入甲醛基四苯乙烯100g、对甲苯磺酸1.3g，充分搅拌混合后得到黄色溶液，继续保温搅拌4h至溶液黄色褪去，加入过量的丙酮溶剂，至无白色絮状沉淀析出，分离白色絮状沉淀，以丙酮洗涤，蒸除丙酮后得到四苯乙烯羧酸衍生物；称取peo-ppo-peo三嵌段共聚物0.01g并溶解在100ml去离子水中，制得溶液a，搅拌升温至80-90℃，加入所述四苯乙烯羧酸衍生物，充分搅拌混合后再加入所述表面改性的蒙脱石纳米片并分散，搅拌反应过夜后制得悬浮液a，将所述悬浮液a冻干，制得孔化组装的蒙脱石纳米片；
57.(d)固定化
58.将所述孔化组装的蒙脱石纳米片搅拌分散在10ml四氢呋喃中，加入端氨基聚二甲基硅氧烷的碱溶液，充分混合后蒸除四氢呋喃，搅拌升温至80-90℃，边搅拌边少量多次地加入固化剂，加入完毕后继续保温搅拌反应12h，反应完成后滤出沉淀，沉淀依次以碱性溶液和去离子水洗涤，干燥后制得所述改性蒙脱石；
59.其中，所述孔化组装的蒙脱石纳米片与聚二甲基硅氧烷的质量比例为2：1。
60.对比例
61.同实施例1，区别在于：所述第二复合发酵菌中还包括有天然蒙脱石粉末载体。
62.实验例
63.1、对实施例1、实施例2以及对比例所述中草药微生物发酵制剂在相同的保存条件下的剩余活菌数(lg值)进行测定：
64.保存时间0d30d60d90d实施例17653实施例27776对比例7765
65.2、选用高血脂症大鼠动物模型验证，选用8周龄，体重在200-225g的雄性大鼠50只，适应性饲养3d后，随机分为2
66.组(正常组：10只，高脂模型组：40只)，采用高脂饲料喂养法来建造高脂血症大鼠动物模型，正常组进食正常基础饲料，高脂模型组进食高脂饲料，饮用经紫外线消毒的自来水，喂养时间30d，30d后禁食12h，眼眶取血检测大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量。
67.随机将高脂模型组分为4组，分别为模型组、第一治疗组、第二治疗组和第三治疗组，每组10只，第一治疗组和第二治疗组分别每天灌胃1次实施例1、实施例2所述的发酵制剂，第三治疗组每天灌胃1次实施例1所述中草药组合物的常规水提取液，正常组和模型组每天灌胃1次等量生理盐水，喂养时间60d，60d后禁食12h，眼眶取血检测大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量。
68.检测结果如下表：
[0069][0070]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。