组蛋白分子伴侣抑制剂的用途、药物组合物、筛选药物的方法和构建疾病模型的方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体的，涉及组蛋白分子伴侣抑制剂在制备药物中的用途、用于治疗或者预防组蛋白突变相关疾病的药物组合物、治疗或者预防组蛋白突变相关疾病的方法、用于筛选药物的方法和构建疾病模型的方法。


背景技术：

2.核小体是真核生物染色质的基本组成单位，由dna包裹组蛋白八聚体形成。每个组蛋白八聚体都含有两个拷贝的组蛋白h2a、h2b、h3和h4，虽然构成组蛋白八聚体的四种核心组蛋白的氨基酸序列相似性较低，但它们的二级结构却较为相似，都有两端的两个无序的尾部结构域和中心的球状结构域。癌组蛋白点突变是肿瘤发生的常见驱动因素，特别时组蛋白尾部结构域中与翻译后修饰相关的点突变。
3.目前关于组蛋白异常所引起疾病的研究仍有待深入。


技术实现要素：

4.本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
5.本发明的发明人发现了h2b亚型中只有his-58蛋白在线虫生殖腺和早期胚胎中表达。意外地发现，通过敲除四个编码his-58基因中的三个基因以降低生殖腺中的h2b含量后，会引起严重的线虫减数分裂缺陷和不育表型。进一步通过筛选，意外地发现组蛋白h3-h4 的分子伴侣asf1同源蛋白的功能缺失型点突变unc-85(g111r)可以抑制h2b敲除引起的不育表型。进一步地，发明人还发现其他组蛋白h3-h4分子伴侣及h3、h4的表达量降低均可以挽救h2b敲除的表型，这表明抑制h3-h4分子伴侣可能可以为组蛋白h2b突变的相关肿瘤治疗带来希望。
6.有鉴于此，本发明提出了组蛋白分子伴侣抑制剂在制备药物中的用途，其能够有效地用于治疗或者预防组蛋白突变相关的疾病。本发明的发明人意外地发现抑制h3-h4分子伴侣可以用于治疗或者预防组蛋白h2b突变的相关疾病例如肿瘤或者癌症。
7.在第一方面，根据本技术的实施例，本发明提出了组蛋白分子伴侣抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防组蛋白突变相关疾病。
8.在第二方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种用于治疗或者预防组蛋白突变相关疾病的药物组合物，其包括：组蛋白分子伴侣抑制剂作为活性成分。
9.在第三方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种治疗或者预防组蛋白突变相关疾病的方法，其包括：为有需要的对象给药组蛋白分子伴侣抑制剂。
10.在第四方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种用于筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防组蛋白突变相关疾病，所述方法包括：获取线虫突变虫体，所述突变虫体的h2b基因被下调或者敲除；采用候选试剂对所述线虫突变虫体进行处理；确定处理后所述线虫突变虫体的繁殖状态；和基于所述繁殖状态，确定所述候选试剂是否能够作为治
疗或者预防组蛋白突变相关疾病。
11.在第五方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种构建疾病模型的方法，所述疾病模型拥有筛选药物，所述药物治疗或者预防组蛋白突变相关疾病，所述方法包括：使线虫的基因组中h2b基因被下调或者敲除，以便获得所述疾病模型。
具体实施方式
12.下面将对本发明实施例中的技术方案进行描述。
13.治疗或预防疾病的用途
14.在第一方面，根据本技术的实施例，本发明提出了组蛋白分子伴侣抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防组蛋白突变相关疾病。
15.如前所述，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
16.本发明的发明人发现了h2b亚型中只有his-58蛋白在线虫生殖腺和早期胚胎中表达。意外地发现，通过敲除四个编码his-58基因中的三个基因以降低生殖腺中的h2b含量后，会引起严重的线虫减数分裂缺陷和不育表型。进一步通过筛选，意外地发现组蛋白h3-h4 的分子伴侣asf1同源蛋白的功能缺失型点突变unc-85(g111r)可以抑制h2b敲除引起的不育表型。进一步地，发明人还发现其他组蛋白h3-h4分子伴侣及h3、h4的表达量降低均可以挽救h2b敲除的表型，这表明抑制h3-h4分子伴侣可能可以为组蛋白h2b突变的相关肿瘤治疗带来希望。另外，发明人在哺乳细胞水平也验证了相关结论。具体的，在大约2％的宫颈、膀胱和子宫、头颈部癌症病人中发现h2b-e76k突变。发明人在293细胞中转入线虫h2b-e74k点突变基因(对应人的h2b-e76k)，发现细胞增殖异常，再通过rnai 敲低h3-h4分子伴侣也可以抑制细胞增殖表型。
17.在本文中所使用的术语“组蛋白分子伴侣”是用于在组织和细胞周期的不同时间不断地加工处理、掺入或者从染色体上拆卸组蛋白的功能蛋白。根据本技术的实施例，所采用的“组蛋白分子伴侣”是指涉及h3和/或h4的组蛋白分子伴侣。根据本技术的实施例，所述组蛋白分子伴侣包括h3-h4分子伴侣。具体的，所述组蛋白分子伴侣包括选自unc-85、 asf1(包括asf1a和asf1b的至少之一)、caf-1、hira和daxx的至少之一。
18.如无特别说明，在本文中所使用的基因或者蛋白的名字，在genebank中均可以获取其详细资料，在此不再赘述。
19.根据本技术的实施例，所采用的组蛋白分子伴侣涉及转运h3和h4的分子伴侣通路、复制依赖型h3-h4转运的分子伴侣、复制非依赖型h3-h4转运的分子伴侣。其中，组蛋白在合成后，h3-h4二聚体和h2a-h2b二聚体在转运到染色体的过程中会与多种不同的分子伴侣和酶结合。而asf1是新合成的h3.1-h4，h3.2-h4或h3.3-h4二聚体传递中的起着中心作用的分子伴侣。不结合组蛋白的asf1会被磷酸化，促进其与组蛋白结合，asf1结合的组蛋白会进一步结合多种不同的分子伴侣复合物，组蛋白与分子伴侣的结合可以很好的隐藏其功能界面，促进组蛋白乙酰化、进入细胞核和掺入染色体。当组蛋白h3、h4在细胞质中被翻译时，新翻译出来仍旧结合在核糖体上的组蛋白h3k9位点即被setdb1甲基转移酶单甲基化修饰，h3k9me被认为起着阻止其被乙酰化修饰并为其组装到异染色质上做准备的作用；随后，完全翻译出来的h3和h4会被poly(adp-ribosyl)ated和parylated 修饰，同时会被分子伴侣热激蛋白结合，其中h3会被hsc70结合，而h4被hsc70及 hsp90结合；下一步，分子伴侣nasp
与hsp90及h3-h4二聚体结合，h3-h4二聚体首次二聚化，二聚化的(h3h4)2被乙酰转移酶在h4k5和h4k12两个位点乙酰化，此时， h3k9me大大减少，至多有三分之一的h3h4二聚体仍保持h3k9me状态，nasp结合在 h3的组蛋白球状结构域，因此可以同时结合复制依赖和复制非依赖型的h3，nasp可以进一步帮助维持成熟的h3-h4组蛋白在细胞质中储存，而且可以协助组蛋白折叠并且保护 h3-h4不被分子伴侣介导的自噬信号通路降解；asf1随后与nasp-h3-h4复合体结合，而且核转运蛋白(importin)也结合在组蛋白h3的尾巴区域，其中importin-4是结合最多的核转运蛋白，importin-4不仅可以与h3结合，也可以与asf1相结合，在核转运蛋白和 asf1的帮助下，组蛋白被从细胞质转运到细胞核中，实现了在细胞中的转运。当组蛋白被不同的分子伴侣转运到细胞核中后，核转运蛋白进一步利用ras相关核蛋白(ran)gtpase 与细胞核中的asf1-h3-h4实现货物完全分离，在此过程中asf1可以起到帮助importin-4 从h3h4二聚体上释放的作用(grover et al.,2018)。在细胞分裂的s期，由于dna的复制导致了回收的组蛋白不足以重新分配到两个新复制的dna链上，此时需要组蛋白在s 期爆发式的合成缓解组蛋白的缺乏。这些新合成的组蛋白h3-h4被asf1结合并将它们转移到细胞核中的下游组蛋白分子伴侣上。在复制依赖型组蛋白h3-h4掺入染色体的途径中， asf1结合的h3-h4组蛋白二聚体转移到caf1上最终掺入染色质。这种途径特异地在h3.1 和h3.2的转运过程中起作用，而组蛋白h3-h4之所以能从分子伴侣asf1上转移到其他组蛋白伴侣复合物中，是因为asf1在结构上既可以与h3-h4二聚体相互作用，又可以与下游的组蛋白分子伴侣如caf-1相互作用，caf-1在体外实验中被鉴定是一种在复制过程中承担组蛋白h3-h4掺入新合成染色体的分子伴侣。caf-1复合体由p150,p60和rbap48(酵母中是cac1,cac2,和cac3)三种组分组成，它与增殖细胞核抗原(pcna)进行环发生相互作用。最初的结构和生物物理研究表明，酵母asf1通过cac2亚基直接与caf1相互作用，而这种体外相互作用在asf1与h3-h4结合情况下会增强。
20.人的hira组蛋白伴侣复合物由三个蛋白亚基组成，即hira,ubinuclein 1(ubn1)和 cabin1。h3.3的特异性是由ubn1介导的，它结合组蛋白h3.3的球状结构域，并使用空间位阻来排除m90残基而不是h3.3特异性的g90。此外，和caf-1一样，hira被认为从asf1接收h3-h4二聚体，不同它接收的二聚体中h3是复制非依赖型h3.3，asf1与组蛋白的结合使得h3.1和h3.3之间不同的球状结构域残基暴露出来而被hira识别。而hira 与asf1的相互作用是通过hira的b结构域发生的，caf1也是利用一个类似b域的表面类似地结合asf1，这使得asf1与caf1或hira不能同时相互作用。hira几乎负责所有转录依赖的h3.3组蛋白的掺入，在没有hira的情况下，染色体上基因沉默区域的 h3.3也同样缺失，这表明hira的功能不仅在转录活跃区，在转录沉默区域也起着重要的作用。那么hira是如何被招募到活跃转录的基因及其调控元件的呢？研究发现h3.3在染色体上的占位与phospho-rna pol ii(ser5)呈正相关，而且hira的亚基可以与 phospho-rna pol ii(ser5)免疫共沉淀，表明hira与转录机制密切相关。此外，hira 可以结合dna，在与rna pol ii的相互作用下，hira将h3.3掺入到dna上；与转录区域的相互作用也涉及到nsd2(kmt3g)甲基转移酶，nsd2首先被招募到转录基因上，随后nsd2和磷酸化的rna pol ii在转录伸长过程中进一步招募hira到dna上，而且非催化活性的nsd2仍然能够刺激h3.3的掺入，这表明nsd2可能在hira依赖的组蛋白掺入中起到了脚手架的作用；此外，复制蛋白a(rpa)也被认为在转录过程中起到促进 hira依赖的h3.3-h4掺入的作用。
21.daxx是另一种复制非依赖型组蛋白的分子伴侣，daxx的组蛋白结合结构域包含一个疏水口袋，这个疏水口袋可以特异性结合h3.3-a87；而atrx是一个atp依赖的蛋白，其中包含一个异染色质结合区域，具有染色质重塑的功能。同时atrx也是daxx的主要结合蛋白。总之，atrx和daxx主要在重复的dna片段上掺入h3.3-h4，包括端粒和中心粒dna。atrx利用其add结构域结合h3k9me3，同时其pxvxl motif会结合hp1，因此将daxx招募到异染色质区域。swi/snf具有的atrx的解旋酶活性、atp依赖的染色质重塑活性以及atrx
–
daxx提供的大量蛋白间相互作用也促进了h3.3募集和掺入。另外，cenp-a-h4二聚体的转运和掺入染色质是通过holliday连接识别蛋白(hjurp) 与核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，npm1)和rbap46/48相互作用而完成的。
22.在本文中所使用的术语“抑制剂”是指能够特异性降低组蛋白分子伴侣活性的试剂，可以是蛋白质、小分子化合物、高分子化合物，也可以是核酸试剂，以及适于引起特定突变(例如基因编辑)的试剂。其中，降低组蛋白分子伴侣活性可以是与未施加该抑制剂相比，将细胞内组蛋白分子伴侣的活性降低至少10％，例如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，例如可以将细胞内组蛋白分子伴侣的蛋白表达水平降低至少10％，例如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少 60％，至少70％，至少80％，至少90％。
23.在本文中使用的术语“竞争性抑制剂”是产生竞争性抑制作用的抑制剂。它与被抑制的组蛋白分子伴侣的底物通常有结构上的相似性，能与底物竞相争夺分子伴侣上的结合位点，从而产生分子伴侣的可逆的抑制作用。
24.在本文中使用的术语“抗体”是指包含分子伴侣结合位点的结合蛋白。可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。具体的，本领域技术人员可以通过常用的手段分离纯化特异性识别预定抗原的抗体，例如通过杂交瘤手段或者通过噬菌体展示手段。另外，根据本发明的实施例，可以采用的“抗体”包括但不限于双链抗体、全长抗体、单链抗体、多聚体抗体、 cdr移植抗体或小分子抗体。本领域技术人员可以理解的是，还可以采用人源化抗体作为药物。
25.根据本技术的实施例，所述下调所述组蛋白分子伴侣表达的试剂包括特异性针对所述组蛋白分子伴侣的反义寡核苷酸aso、小发卡rna shrna和干扰rna rnai的至少之一。本领域技术人员可以通过常规的手段，基于目标分子例如分子伴侣的基因序列，设计相应核酸试剂的序列。
26.根据本技术的实施例，所述干扰rna rnai具有下列至少之一所示的核苷酸序列：
27.siasf1a sequence:5
’‑
gcagagagcaguaauccaauu-3’(seq id no：1)和
28.siasf1b sequence:5
’‑
ccuggaguggaagaucauuuu-3’(seq id no：2)。
29.近期的研究发现在哺乳动物细胞中引入h2b致癌组蛋白突变会引起细胞增殖能力的增强。发明人在哺乳细胞中引入了h2b致癌组蛋白突变(h2be74k)，利用组蛋白h3s10 磷酸化染色来判断正在进行分裂的细胞，统计正在分裂细胞的比例，发现在突变体中分裂细胞变多；而当发明人通过rnai敲低asf1a或者asf1b时，该表型有统计上显著的下降，表明了该机制在哺乳动物细胞中同样起着一定的作用，即在线虫中通过遗传筛选找到的核心组蛋白含量需要保持平衡的机制同样适用于哺乳动物细胞可以抑制其增殖的表型。
30.根据本技术的实施例，所述组蛋白突变包括组蛋白h2b突变和组蛋白h2a突变的至
少之一。根据本技术的实施例，发明人对组蛋白分子伴侣抑制剂能够治疗或者预防h2b突变或者h2a突变相关疾病的机理进行了深入研究，结果发现有可能是因为维持染色质上组蛋白的含量平衡对于疾病的治疗很重要。
31.根据本技术的实施例，所述组蛋白h2b突变包括选自下列的至少之一：e76k、f70l、 e113k、e113q、e71q、e2q、p103s、e93d、e76q、e2k、s14f、s123n、r99c、q47f、 k27n、g104w、e35k、e35d、d68n和d51n，和/或
32.所述组蛋白h2a突变包括选自下列的至少之一：s1c、e121q、e121k、r29q、r17p、 k75n、k74n、e56q、s1l、g37d、e92d、e121d、r11c、q014h、n73k、n38k、l34f、 h31y、e92k和e61d。
33.根据本技术的实施例，所述疾病包括肿瘤和癌症的至少之一。
34.根据本技术的实施例，所述疾病包括选自弥漫性内源中线神经胶质瘤、儿童恶性胶质细胞瘤、肉瘤、成软骨细胞瘤、骨巨细胞瘤、弥漫性b细胞淋巴瘤、头颈部癌症、和头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、急性髓系白血病、膀胱癌、结直肠癌、宫颈癌、子宫癌、食道癌、胃癌、皮肤癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、淋巴癌、肾癌、胰腺癌、白血病的至少之一。
35.本领域技术人员能够理解的是，在第二方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种用于治疗或者预防组蛋白突变相关疾病的药物组合物，其包括：组蛋白分子伴侣抑制剂作为活性成分。在第三方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种治疗或者预防组蛋白突变相关疾病的方法，其包括：为有需要的对象给药治疗有效量的组蛋白分子伴侣抑制剂。
36.前面所描述的特征和优点同样适用于该方法和药物组合物，在此不再赘述。
37.另外，根据本发明实施例的组合物可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于鼻内、口服、经皮、经眼、腹膜内、吸入、静脉内、icv、脑池内注射或输注、皮下、植入、阴道内、舌下、尿道(例如，尿道栓剂)、皮下、肌肉内、静脉内、直肠、舌下、粘膜、眼部、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋巴管施用。外用制剂可以呈凝胶、软膏剂、乳膏剂、气溶胶等形式；鼻内制剂可呈喷雾或液滴形式递送；经皮制剂可经由透皮贴剂或离子渗透疗法施用；吸入制剂可以使用喷雾器或类似装置递送。组合物也可以呈片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉剂、缓释制剂、溶液剂、混悬剂、酏剂、气溶胶或任何其它适当组合物的形式。
38.为制备此类药物组合物，可以根据常规制药化合技术，将活性成分与药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂混合。可用于本组合物中的药学上可接受的载体涵盖任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，如油/水或水/油乳液，及各种类型的湿润剂。组合物另外可含固体药物赋形剂如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是对于注射液而言，包括水、盐水、水性葡萄糖和二醇。载体、稳定剂和佐剂的实例，参见e.w.martin 编辑的remington”s pharmaceutical sciences(mack publishing company，1990年，第18版。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。
39.如本文中所用，术语“治疗有效量”是足以治疗指定病症或疾病的量或可选地足以
获得治疗病症或疾病的药理反应的量。确定最有效的施用方式和剂量的方法可以随用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而改变。通常可滴定治疗剂量以优化安全性和功效。可以按主治医师选定的剂量水平和模式进行单次或多次施用。合适的剂型和施用药剂的方法可由本领域的技术人员容易地确定。例如，按约0.01mg/kg至约200mg/kg、约0.1mg/kg至约100mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg施用组合物。当本文描述的化合物与另一种药剂或疗法共同施用时，有效量可低于单独使用该药剂时的量。
40.根据本发明的实施例，可以单独给予或与其它药物组合以短时间或长时间治疗或者预防前面所描述的疾病。在本文中所使用的术语“有需要的个体”是指任何存在激酶异常所引发异常的生物体，例如哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人类、鼠类、大鼠、兔、猿、牛、绵羊、猪、狗、猫、家畜、运动用动物、宠物、马和灵长类动物。
41.筛选药物和构建疾病模型的方法
42.在第四方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种用于筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防组蛋白突变相关疾病，所述方法包括：获取线虫突变虫体，所述突变虫体的h2b基因被下调或者敲除；采用候选试剂对所述线虫突变虫体进行处理；确定处理后所述线虫突变虫体的繁殖状态；和基于所述繁殖状态，确定所述候选试剂是否能够作为治疗或者预防组蛋白突变相关疾病。
43.在第五方面，根据本技术的实施例，本发明提出了一种构建疾病模型的方法，所述疾病模型拥有筛选药物，所述药物治疗或者预防组蛋白突变相关疾病，所述方法包括：使线虫的基因组中h2b基因被下调或者敲除，以便获得所述疾病模型。
44.根据本技术的实施例，本技术提出了一个可以探究组蛋白h2b功能的系统。根据本技术的实施例，发明人首先采用crispr-cas9技术对线虫中所有编码h2b的基因进行了gfp 的原位敲入，发现生殖腺是一个很好的研究体系；为了在生殖腺中探究h2b的功能，发明人还是采用crispr-cas9分别对生殖腺h2b进行了单敲除、双敲除及三敲除，意外地发现了h2b对于线虫的生殖是重要的，h2b三敲除线虫表现出完全的不育表型。
45.为了验证h2b三敲除线虫可以作为疾病模型进行药物筛选，发明人通过线虫经典学抑制子筛选手段，发现组蛋白h3-h4的分子伴侣unc-85(g111r)功能缺失型点突变可以挽救h2b三敲除线虫的不育表型；其次，利用反向遗传学筛选发现参与到h3-h4转运过程的分子伴侣包括hira复合物、daxx复合物等组成成分的敲低均可以不同程度地挽救 h2b三敲除线虫的不育表型。这里所使用的术语“三敲除”是指敲除his-48，his-58，his-62 和his-66中的三个，例如his-48，his-58，his-66。根据本技术的实施例，可以采用crispr-cas9 技术对编码生殖腺h2b的四个基因his-48，his-58，his-62和his-66的至少一个进行敲除。其中his-48，his-58，his-66可以采用同一个sgrna进行三敲除。
46.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
47.实验材料和方法
48.实验使用的菌株
49.大肠杆菌op50菌株：用于线虫培养；
50.ht115(de3)感受态细胞，用于线虫rna干扰技术(rnai)筛选菌株的构建；本技术中使用的rnai菌来自于ahringer c.elegans library。
51.感受态trans5α细胞(transgene cd501-03)：用于分子生物学质粒构建。
52.实验构建的质粒
53.实验使用的质粒列表及实验用途
[0054][0055][0056]
实验使用的质粒列表及实验用途
[0057][0058][0059]
注：pdd162、ppd95.77为实验中使用到的质粒名称；ki为knock in缩写。
[0060]
同源重组模板质粒列表
[0061][0062]
同源重组模板质粒列表
[0063]
[0064][0065]
实验使用的线虫品系
[0066][0067]
实验使用的线虫品系
[0068]
[0069][0070]
实验使用的线虫品系
[0071][0072]
线虫培养及分子生物学试剂及配方
[0073]
[0074][0075]
线虫培养及分子生物学试剂及配方
[0076]
[0077][0078]
试剂与试剂盒
[0079]
[0080][0081]
试剂与试剂盒
[0082]
[0083][0084]
一般实验方法
[0085]
线虫的培养
[0086]
以大肠杆菌op50培养秀丽隐杆线虫，将op50涂布于ngm平板上，培养过夜，第二天可以转移线虫至平板上，如非特别说明，将线虫培养于20℃生化培养箱中，温度敏感型突变体在20℃传代培养，表型分析时，将其转移至限制温度25℃。rna干扰实验中，菌液需要涂布在另外添加抗生素、iptg及四环素的ngm的培养基上诱导表达至少12h后将线虫转移至平板上。
[0087]
线虫的冻存
[0088]
线虫可以通过低温保存的方式进行保种，本技术中使用的线虫品系均使用冻存的方式保种于-80℃超低温冰箱中(brenner.,1974)。
[0089]
线虫的遗传杂交实验
[0090]
线虫作为模式生物，便捷的遗传操作是其显著的优势。遗传杂交需要其中一种基因型品系的线虫是雄虫，而线虫在标准培养条件下以雌雄同体的方式传代，故首先发明人获得需要做遗传杂交的其中一个品系的雄虫。本技术中主要使用可以产生雄虫的突变体him-5 (e1490)(自发产生雄虫的突变体)，将突变体引入目标品系。简言之，将20μl op50菌液滴到ngm培养皿中，在超净工作台中吹干。挑取10条生长至l4阶段的雌雄同体(p0) 和20条年轻雄性至上述ngm平板中，杂交24小时；从杂交ngm培养皿中选取10只健康的雌性同体，每个p0放置到一个ngm培养皿分到10个培养皿中；通过杂交而来的线虫p0会产生雄虫，以此为标准判断该p0知否杂交成功。从有成功杂交p0的平板中挑取与雄虫大小相当的雌雄同体线虫子代(f1)，挑出来后每只放在一个培养皿中，一共挑出8 只f1即可，这些即为杂合的f1。如果是不同染色体的两个基因型进行杂交，杂交而来的f1有四分之一的概率产生纯合的f2。有荧光信号的可以通过荧光信号挑选带荧光的f2；没有荧光信号的可以挑出16只左右的f2，通过分子检测基因型，鉴定到纯合的f2用于后续的实验；如果是同一条染色体的两个基因型进行杂交，那么通过遗传距离判断f2中发生交换的概率，可以以此为依据判断挑f2数量，最终以荧光纯合或者测序突变纯合确定基因型。
[0091]
基因组编辑线虫品系的构建
[0092]
本技术中所使用的所有的原位绿色荧光蛋白(gfp)、mcherry标记及线虫精确氨基酸突变的品系均使用基于基因重组的crispr-cas技术构建(liandou,2016)，对于研究中knock-in标记、精确氨基酸点突变，具体操作设计及操作如下：
[0093]
guiderna(sgrna)的设计
[0094]
在基因编辑位点上下游100bp范围内设计sgrna，本技术中sgrna使用美国mit大学张锋实验室设计的网站http://crispor.tefor.net设计(congetal.,2013)(ranetal.,2013)，选择特异性和效率都比较高的两条sgrna，将其克隆到pdd162-peft-3::cas9+pu6::sg的质粒上。
[0095]
同源重组模板质粒的设计
[0096]
对于内源蛋白gfp标记(knock-in)线虫品系的构建，本技术中分别使用了c端或者n端的标记(liandou,2016)，在gfp和目标蛋白之间添加柔性linkergctggaagtggtagcggt或者tev-stag；在gfp蛋白序列上下游设计1000bp-3000bp的同源臂；为避免sgrna对模板质粒的切割造成修复后多余的突变，本技术中对于sgrna靶向的序列进行同义突变，同义突变优先突变pam序列，如果pam序列不能进行同义突变则选择sgrna靶向的序列进行突变，这种情况下需要将所有的靶向序列做同义突变以保证sgrna不切割模板质粒；除此之外，对于精确氨基酸的编辑，需要在点突变附近通过同义突变设计用于酶切鉴定做基因型判断的位点
[0097]
质粒构建
[0098]
线虫基因组编辑使用两套质粒，即crispr-cas9系统中的sgrna、cas9蛋白编码质粒以及基于同源重组的修复模板质粒。对于sgrna，本技术中使用peft-3::cas9+pu6::empty-sgrna质粒为模板，将sgrna序列设计在引物上，对质粒进行扩增，扩增后用dpni酶37℃处理2h以消化用于pcr扩增的原始质粒，随后转化入dh5a，第二天挑取单克隆并使用sanger测序鉴定克隆；对于同源重组的修复模板，首先扩增目的片段，同时线性化载体ppd95.77；其中将ppd95.77线性化载体用dpni酶37℃处理2h；将同源臂和线性化的ppd95.77用in-fusion重组酶50℃连接15min后转化，第二天进行测序；测序正确后使用同样的方法将gfp序列插入到同源臂中间；对于精确氨基酸编辑的突变体质粒，可以通过引物将点突变及酶切位点引入质粒。本技术中涉及到的unc-85点突变和his-48(e74k)点突变的构建，首先发明人将同源臂克隆到质粒上，第一轮引入点突变及酶切位点，第二轮引入了sgrna靶向序列的同义突变。
[0099]
线虫显微注射
[0100]
首先，线虫显微注射之前需要用purelink
tm
quickpcrpurificationkit将即将用于注射的质粒sgrna-cas9、同源重组修复模板、共注射的筛选marker质粒rol-6和podr-1::dsred纯化以减少对注射后线虫的毒害；第二，4种质粒按照1:1:1:1的比例混合均匀，终浓度约50ng/μl，高速约14000rpm/min离心15min以去除液体中的气泡以免造成注射堵塞针头。使用显微注射仪将质粒注射进年轻雌雄同体成虫(p0)的生殖腺中，每个ngm培养皿分5-8只p0，三天后进行筛选，挑出带有有共注射标记质粒表型的f1，如荧光信号的标记或者线虫运动形态的变化，如旋转或者运动不协调等。
[0101]
分子检测鉴定基因编辑是否成功
[0102]
对于内源性gfp蛋白的插入，本技术中采用两对引物共同鉴定的方法，一对引物设计在同源臂的gfp序列两侧称为inner primer，另一对引物设计在gfp序列和同源臂外侧，称为outer primer，outer primer用于检测是否有插入gfp，inner primer用于鉴定是否是过表达品系；对于特定氨基酸点突变的品系，正反引物分别设计在同源臂内外，通过酶切鉴定是否有编辑成功，最终将序列测序以保证得到正确编辑的品系。
[0103]
线虫生殖腺细胞及早期胚胎活体荧光时序成像
[0104]
本技术中对于线虫生殖腺、卵细胞减数分裂及早期胚胎的成像使用zeiss及olympus转盘式激光共聚焦显微镜完成(yongping chai et al.,2012)。
[0105]
简言之，分别包括：
[0106]
1)线虫生殖腺、减数分裂成像。
[0107]
在微孔玻璃培养皿中滴加1μl levamisole麻醉剂(浓度为1mg/ml)，放置10条年轻成虫于麻醉剂中，等待1min左右线虫完全被麻醉，在培养皿的周围放一个浸湿的纸巾使得培养皿中保持湿润，接下来进行活体荧光时序成像观察。
[0108]
2)线虫早期胚胎实时成像
[0109]
在微孔玻璃培养皿中加入1μl无菌m9溶液，挑选20只年轻成年线虫，用两支1ml 注射器将针头交叉呈剪刀状来回切割将成虫切开，暴露出线虫子宫中刚刚受精的胚胎。将纸巾润湿放在微孔玻璃培养皿的四周，保持皿内的湿度，在转盘式激光共聚焦显微镜上成像。
[0110]
染色体免疫共沉淀实验
[0111]
染色体免疫共沉淀(chip)及高通量测序技术已经被广泛使用鉴定组蛋白及组蛋白修饰在染色体上结合的情况(david a.orlando et al.,2014)，本技术中使用了chip-seq技术来鉴定h3在染色体上是否结合有变化。
[0112]
线虫生殖腺解剖及成像
[0113]
用gonad dissection buffer稀释麻醉剂levamisol至1mg/ml，在凹面载玻片上滴2μl gonaddissection buffer，放入1-2条成年年轻线虫，待其麻醉，从咽部或尾部用1ml的注射器切开，因压力变化，gonad会暴露出来，用1ml注射器针头小心将gonad与肠道等组织分开，用2.5μl的移液器将其吸取到装有预冷后的10μl无水甲醇的200μl pcr管内并置于冰上，为了避免后续操作步骤中的损失，该步骤中吸取10-20个完整的生殖腺(xiaochen wang etal.,2007)。提前准备好涂有多层多聚赖氨酸poly-l-lysine载玻片，将pcr管里的样品滴在载玻片上，待样品周围的甲醇挥发干净，滴加pbs冲洗一下固定在玻片上的gonad，空气中避光晾干2-3min，滴加含有dapi的mounting medium 10μl，小心加上盖玻片，染色10 min，在盖玻片周围涂一圈指甲油以长久保持样品质量，进行镜检。
[0114]
线虫子代数目统计
[0115]
1)每个基因型准备10个ngm培养皿.
[0116]
2)挑选l4(p0)阶段幼虫，每只一个ngm培养皿，每隔一天将p0转移到新的ngm 培养皿中，连续转移三次至p0没有胚胎产生。
[0117]
3)三天后，对每一个ngm培养皿中的线虫(f1)进行计数，将四个培养皿中所有的线虫数量相加即为每个线虫的子代数目(hartman and herman,1982)。
[0118]
h2b三突变线虫正向遗传学筛选
[0119]
首先，将杂合的gou3227 h2b三敲除突变体扩大培养，使用400个6cm培养皿将大部
分线虫培养至成虫阶段；用m9将所有的线虫冲洗收集，用bleaching buffer将所有的线虫进行bleach，释放所有的胚胎至培养皿中，第二天，将同步化至l1阶段的幼虫冲洗至涂有op50的ngm上培养至late l4阶段；将l4线虫收集至15ml管中，用m9将体系定容到4ml，在通风橱中在体系中加入20μl乙基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,ems)，上下颠倒混匀，在通风橱中旋转诱变4h；诱变后，离心将线虫收集，将含有ems的液体用1m/l的naoh中和，收集后的线虫用m9漂洗2次，将线虫置于涂有op50的ngm培养皿中，恢复12-18h；第二天，将恢复后的线虫bleach释放胚胎至ngm培养皿中培养至 l4阶段，在荧光解剖镜下挑出纯合的三敲除突变体，每两只放在同一个ngm培养皿中， 20℃培养，20天后筛选诱变后的突变体是否可以饥饿；将筛选到的可以饥饿的板子single 虫子至可以饥饿的板子数量占总共板子数量的百分比稳定，即认为该突变体为纯合抑制子突变体。
[0120]
抑制子基因克隆
[0121]
首先，在cb4856品系中做一个gfp::his-48ki品系，用不同品系的snp以确定抑制子基因的位置；将抑制子的雌雄同体与cb4856(gfp::his-48ki)的雄性线虫进行杂交；挑杂交成功的80盘f1，挑选时利用来自于cb4856的绿色荧光信号来判断是否杂交成功；接下来挑出f2，标准时挑出完全纯和的没有绿色荧光信号的f2 400只左右，该步骤是确定h2b三敲除的纯合；20天后观察400个f2中饥饿的板子和几乎没有什么后代的完全三突表型，和绝对无后代的，进行分类。
[0122]
接下来确定基因位置，使用具有三突表型的虫子(有后代，但后代很少)，将这些线虫裂解(使用单独的pcr小管，30μl的裂解液；裂完虫子不要丢板子，每个都需要分析)；同时裂解完全饥饿状态的线虫，但是需要注意首先要排除有没有挑错线虫以确保基因定位的准确性，在荧光镜下排除掉带有his-48::gfp ki的线虫，裂完虫子后要注意及时标记和保存好不同的f2，以便于后续分析及测序。
[0123]
混合pcr(pool-pcr)，把每个具有三突表型线虫基因组dna裂解液吸取两微升到一个pcr管中，吹打混匀，作为pcr的混合模板；同样将处于饥饿(饥饿)的f2 dna裂解液也吹打混匀，两类不同表型的f2正反mapping可以更加保证基因定位的准确；为了接下来的精细mapping能够排版整齐，建议最好使用11，22，33，44，55，66等11的倍数个虫子。
[0124]
pcr体系：2x easytaq mix 5μl；template dna lysis 1μl；h2o 4μl
[0125]
将pcr后的产物用限制性内切酶draⅰ处理四个小时(过夜最佳)。
[0126]
酶切体系：draⅰ0.5μl；cutsmart buffer 2μl；h2o7.5μl
[0127]
将酶切后的样品进行电泳，鉴定是抑制子基因来自于哪条染色体。
[0128]
精细确定基因位置。在鉴定出来抑制子的染色体后，在该位置附近分别选取4对引物把每个饥饿的样品基因组dna裂解液样品都做一次pcr及酶切。将结果整理成pdf和表格，分析结果，找到一个绝对来自于n2的区间；找到该区间后，在该区间内将所有可以用的snp位点都做一次鉴定，将抑制子位置尽可能的缩小。
[0129]
全基因组测序
[0130]
线虫基因组dna提取，首先收集大约10个长满的6cm培养皿的线虫，m9冲洗2次， ten buffer冲洗一次，此处可以将收集好的线虫冻存于-80℃冰箱里；用500μl ten缓冲液将线虫重悬起来，加入0.5％sds,200μg/ml蛋白酶k,65℃孵育2h，每隔1h补加一次蛋白酶k；1：1加入phenol/chloroform/isopropanol(pci solution)，上下轻柔混匀，1,2000g 离心
2min，吸取上清至另外一个2ml管中；1：2.25加入预冷的100％乙醇，轻柔混匀萃取dna；用200μl移液器吸头挑取萃取的dna至一个新的ep管中，漂洗两次，用500μlten将dna溶解，加入rnase a,37℃消化dna中多余的rna；再次抽提以获取纯度更高的dna,最终用20μl ddh2o溶解dna，用qubit
tm
4fluoromete测浓度；全基因组dna 建库，首先使用covaris非接触式超声仪将dna打断至300bp左右的片段，通过电泳和 2100检测片段质量后，使用vazyme的试剂盒nd607进行dna建库，并在诺禾致源生物科技公司进行高通量测序及碱基突变分析；发明人结合snp mapping和全基因组测序分析，在snp mapping找到区间的测序结果中筛选编码区的导致氨基酸改变的突变。
[0131]
线虫rna干扰进行基因敲低
[0132]
本技术中使用的rnai菌液均来自于sourcebioscience c.elegans rnai library。使用前将不同的rnai菌株从rnai菌库中解冻出来，在氨苄青霉素和盐酸四环素双抗的培养基中培养以保证菌株不被杂菌及黏菌污染并测序确定菌种正确。将rnai菌涂布于添加iptg 的ngm培养皿中，诱导培养至少12h，部分菌液有黏菌污染，此时将培养好的菌液提取质粒再次转化进入ht115感受态细胞中即可去掉黏菌污染；将h2b三突变杂合线虫放置于涂好菌的培养皿上，培养一代，将纯合的三突变线虫10只挑至新的rnai培养皿中，两周内观察是否有恢复的表型。rnai情况下子代数目(brood size)的统计方法如前所述，但此处需要提前至少12h涂布rnai菌液进行rna诱导表达。
[0133]
线虫胚胎致死统计
[0134]
在ngm培养皿中滴加20μl大肠杆菌op50，每个ngm培养皿中放50只成年线虫，让其产卵约1h，此时约有50-80个线虫胚胎产生，对培养皿中的卵进行计数。三天后，对培养皿中的成虫和停滞发育的幼虫进行计数，计算胚胎致死和停滞发育幼虫的比例。对于热激启动基因胚胎致死率的统计，发明人首先在培养皿中放入50只年轻成年线虫，让这些线虫在培养基上同步化胚胎1小时，此时将同步化后的线虫挑出培养皿，注意避免伤害到同步化的胚胎，对胚胎进行计数后，正置于33℃热激1h，热激后正常培养，3天后统计成虫和停滞发育的幼虫进行计数，计算胚胎致死和停滞发育幼虫的比例。
[0135]
实施例1线虫中h2b蛋白的系统性分析
[0136]
为了探究不同的编码h2b的基因在表达模式上是否有区别，发明人使用crispr-cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-cas9)技术对线虫中17个编码组蛋白h2b的基因进行原位的绿色荧光蛋白(gfp)标记用以观察不同基因编码的h2b在线虫不同组织中表达模式是否相同。
[0137]
通过线虫活体荧光成像技术，发明人分别观察了17个基因编码的组蛋白h2b的在线虫体内的定位情况。通过观察发明人发现，与前人的报道相同，his-39是一个假基因，在线虫中并没有发现其表达的信号；而复制非依赖性h2b his-41在体细胞中表达；而由 his-11，his-15，his-29，his-34，his-44编码的his-29蛋白也在线虫体细胞中表达；his-4， his-8，his-20，his-22，his-52，his-54编码的his-54蛋白同样也在体细胞中表达；而由his-48， his-58，his-62，his-66编码的his-58蛋白在体细胞和生殖细胞中均有表达。随后发明人将内源性gfp标记的组蛋白h2b线虫与生殖腺细胞特异性过表达的红色h2b的线虫品系进行杂交，用以观察这些h2b蛋白在生殖腺及早期胚胎中的亚定位情况及染色体上富集情况。发明人发现，组蛋白his-58在线虫细胞中普遍表达，而且高度富集于细胞核及染色体
上。虽然线虫活体成像技术已经较为成熟，但是因为线虫生殖腺位于线虫身体的中央，故生殖腺的成像会被体细胞的信号所干扰。为了进一步探究his-58在生殖细胞中的表达模式，发明人通过解剖线虫暴露其生殖腺，实现了生殖腺组织特异性的成像，避免了体细胞造成的成像干扰。通过对体外解剖的线虫生殖腺成像发现，在17个h2b基因编码的蛋白中，只有his-58蛋白在线虫生殖腺的细胞核中表达，而且高度富集于染色体上；其次，发明人利用线虫早期胚胎实时成像技术发现，在线虫刚刚受精的早期胚胎中，也只有his-58蛋白表达，而其他13个基因编码的h2b蛋白在这两个系统中均不表达，这些组蛋白h2b在线虫晚期胚胎中才开始表达。
[0138]
组蛋白因为其复杂的冗余性给在多细胞真核生物中研究其功能造成了很大的困难，在发明人研究中，发明人通过将线虫中的h2b进行系统性的内源性荧光蛋白的标记，发现在线虫生殖腺和早期胚胎中只有四个基因his-48，his-58，his-62，his-66编码的his-58蛋白表达，发现线虫生殖腺及早期胚胎系统是在体内探究h2b功能的良好系统，发明人不仅可以在这个系统中对这几个h2b基因进行敲除，还可以进一步在这个系统中对一些h2b的翻译后修饰位点突变进行构架以探究他们的功能。发明人可以通过简单的操作这四个h2b基因来实现在一个组织中调控组蛋白h2b的蛋白含量，避免了在体细胞的其他系统中，因为h2b 多个蛋白的冗余性而造成的遗传操作上的困难。
[0139]
实施例2线虫中敲除h2b会造成线虫不育
[0140]
为了在线虫生殖腺系统中探究h2b蛋白的功能，发明人使用crispr-cas9技术对编码生殖腺h2b的四个基因his-48，his-58，his-62和his-66进行敲除。其中his-48，his-58，his-66 使用的是同一个sgrna，所以发明人首先对这三个基因进行了敲除。
[0141]
发明人分别对编码his-58蛋白的基因进行单敲除，构建了his-48(cas943)，his-58(cas946)，his-66(cas949)品系。通过对h2b单敲除突变雌雄同体线虫子代数目的分析，发明人发现单独敲除编码组蛋白his-58基因的任何一个都会引起显著的线虫子代数目变少的表型，表明了线虫生殖腺组蛋白h2b的含量对线虫正常的生殖功能是必须的。为了探究 h2b含量的多少对生殖腺的影响，发明人对其中两个基因进行了双敲除，构建了 his-48(cas944)iv；his-58(cas946)及his-58(cas946)iv；his-66(cas951)品系。因为这三个基因均位于四号染色体上的同一个基因簇中，并且高度连锁，发明人不能通过遗传杂交的方式获得双敲除品系，所以发明人进行双敲除时，依旧使用了做单敲除使用的sgrna，最终造成的敲除是不同位置的移码突变造成的。通过对双敲除线虫品系子代数目的统计，发明人发现双敲除品系的子代数目有进一步的显著减少。
[0142]
基于单敲除和双敲除的线虫品系的表型，发明人发现生殖腺中的h2b含量对于线虫的生殖功能具有计量效应。因此，发明人接下来想探究进一步减少h2b在生殖腺中的含量是否会引起更加剧烈的表型。发明人同样使用之前用到的sgrna对线虫的his-48，his-58和his-66 进行了三敲除，此后发明人称为h2b三敲除品系(h2b triple kncokout，h2b t_ko)。通过分析发现，h2b三敲除线虫纯合品系具有母源不育的表型，在其纯合第三代时表现出完全不育。为了维持该三敲除线虫品系的正常传代，发明人使用线虫iv/v染色体的平衡子 nt1[qis51](iv；v)，使该品系维持在一个杂合的状态，通过平衡子中的odr-1::mcherry荧光信号，发明人可以筛选到纯合的h2b三敲除品系线虫用于后续实验。接下来，为了探究 h2b三敲除品系如何造成不育表型，发明人对h2b三敲除突变体生殖腺子宫(uterus)内的胚
ems抑制子筛选，发现与h3-h4相关的信号通路可以调控h2b敲除引起的表型。
[0149]
4.1 unc-85功能缺失型点突变可以挽救线虫h2b敲除引起的不育表型
[0150]
线虫h2b三敲除的品系具有母源不育的表型，纯合第三代线虫完全不育。因此，当发明人将一只纯合突变体放置于一个ngm平板中时，该平板中的线虫不会像野生型线虫一样生长至消耗尽所有的op50，即不会达到饥饿状态，而且该品系纯合线虫也不可以进行传代，因此这样一种能否传代的表型为发明人提供了一个很好的筛选表型。为了探究是否具有一些分子或者信号通路可以调控h2b敲除引起的表型，发明人将杂合的突变体进行正向遗传学ems诱变筛选，通过平衡子nt1(iv；v)的荧光筛选出诱变后纯合的f1，将f1培养 20天左右进行筛选，挑选出已经达到饥饿状态的品系。最终，发明人得到了108个非h2b 编码基因回复突变的突变体，这说明线虫生殖腺中h2b敲除后引起的表型是可以被调控的。发明人在108个突变体中选择了一个恢复表型比较高且长势最好的品系进行了抑制子基因定位。同时，在进行基因定位前，发明人还发现该突变体具有运动不协调(uncoordinated， unc)的表型。
[0151]
随后，发明人使用遗传学中传统的核苷酸多态性分析定位(snp mapping)h2b三敲除抑制子基因位置，结合现代生物学全基因组测序技术对该抑制子突变体进行克隆(davidfay and bender,2006)。首先，发明人利用crispr-cas9技术对来自于美国夏威夷的cb4856 品系的his-48基因做了内源性gfp标记，根据不同品系之间具有单核苷酸多态性的差异，利用品系之间的snp差异来确定来源于不同品系的dna序列，从而确定抑制子基因的位置。ems诱变之后的品系与来自于美国夏威夷的cb4856品系进行杂交，在遗传杂交过程中，发明人可以通过his-48::gfp信号来判断h2b三敲除是否纯合，发明人通过荧光信号挑选出不带有gfp信号同时也可以进行传代的f2(1组)和不带有gfp信号且不能进行传代的f2(2组)，这些f2即为发明人接下来snp mapping的重组子，两组不同表型的重组子可以使发明人的克隆更加准确；随后，发明人将2组中11个重组子f2的基因组混合在一起通过混合pcr的方式确定了该突变基因位于ii号染色体；随后，发明人在ii号染色体的左臂，中间，及右臂上分别选择不同snp位点，通过酶切的方式确定了发明人的突变基因位于ii号染色体-9.74cm—0.94cm之间。随后，发明人对该抑制子进行了线虫全基因组测序(wgs)，在发明人snp mapping定位到的-9.74cm—0.94cm之间，发明人发现在蛋白编码区有单核苷酸突变的基因只有一个即unc-85。
[0152]
unc-85是人中组蛋白h3-h4分子伴侣asf1在线虫中的同源蛋白，在线虫中asf1 有两个同源蛋白，分别由unc-85和asfl-1两个基因编码，该分子伴侣可以在细胞质中结合组蛋白h3h4二聚体将其转运至细胞核内并将h3h4传递给下游的分子伴侣。发明人筛选到的unc-85突变位点为编码区的g331a，其突变导致了unc-85蛋白上的第111位的甘氨酸突变成了一个精氨酸(camerini-otero et al.,1978)，该位点是一个非常保守的氨基酸，从人到线虫都具有很高的保守性。该突变可以很好的挽救h2b三敲除引起的不育表型，可以将子代数目挽救至野生型的60.9％。此外，发明人发现通过rnai降低unc-85的表达量也可以很好的抑制h2b三敲除引起的不育表型。另外发明人通过crispr-cas9技术对unc-85 基因进行敲除，构建了unc-85(cas1571)品系，将unc-85(cas1571)引入h2b三敲除品系，发现unc-85的敲除也可以挽救h2b三敲除突变体。以上数据表明，unc-85(cas1100) 是一个功能缺失型点突变，敲低和敲除unc-85均可以挽救h2b三敲除突变体。另外，发明人在获得该突变体时
就观察到了其有运动不协调(uncoordinated，unc)的表型，且unc-85 突变体被报道也有该表型，从另外一个角度也说明了发明人的克隆到的基因是准确的。除此之外，通过unc-85(cas1100)品系也可以很好的挽救线虫生殖腺中卵细胞减数分裂异常的表型。发明人通过对该品系线虫生殖腺减数分裂过程进行活体成像，发现unc-85 (cas1100)对挽救的h2b三突变卵细胞减数分裂过程进行实时荧光活体成像发现其减数分裂过程可以恢复至正常状态。综上，发明人通过正向遗传学筛选发现了h3h4分子伴侣 unc-85的功能缺失型点突变可以调控h2b敲除的表型。
[0153]
4.2 unc-85同源蛋白的敲除也可以挽救h2b敲除突变体的表型
[0154]
asf1是组蛋白h3-h4的分子伴侣，在组蛋白h3-h4二聚体转运到细胞核中并组装到染色体上的过程中起着重要的作用(hammond et al.,2017)。在线虫中，asf1由两个同源蛋白分别为unc-85和asfl-1。发明人之前的遗传筛选中发现功能缺失型突变体unc-85 (g111r)可以挽救h2b敲除的表型，为了进一步探究其同源蛋白是否也可以调控h2b缺失引起的不育表型，发明人通过crispr-cas9技术对asfl-1进行敲除，得到了一个118bp 缺失引起移码突变的敲除品系asfl-1(cas1222)，发明人将asfl-1(cas1222)引入h2b三敲除突变体发现，asfl-1的敲除也可以抑制h2b三敲除突变体的不育表型，子代数目可以达到野生型的11％。以上数据表明，组蛋白h3-h4分子伴侣asf1的缺失可以挽救h2b三敲除引起的不育表型。
[0155]
4.3 unc-85(g111r)点突变蛋白有进入细胞核缺陷
[0156]
组蛋白在细胞质中被翻译出来后，h3、h4会发生二聚化而形成h3-h4异源二聚体。同样的，h2a、h2b也会二聚化形成异源二聚体。为了避免组蛋白的二聚体进一步多聚化形成组蛋白聚集体，不同的组蛋白二聚体会被各自特异性的分子伴侣结合并转运。组蛋白的分子伴侣一方面可以在细胞质中储存组蛋白，另一方面也可以帮助组蛋白转运到真核细胞的细胞核中，进一步组装到染色质上。其中，asf1就是组蛋白h3-h4的分子伴侣，为了进一步探究unc-85(cas1100)点突变抑制h2b三敲除表型的机制，发明人利用基于同源重组的crispr-cas9技术在unc-85的c端进行gfp的内源敲入。通过实时荧光成像，发明人发现，unc-85蛋白定位于线虫的细胞核中，在体细胞及包括精子在内的生殖细胞都有丰富的表达。与复制依赖型组蛋白定位在细胞核中且富集于染色体上不同，unc-85蛋白并没有富集于染色体上，而是分布于整个细胞中，且大部分都集中在细胞核中。在细胞周期的前期，随着核膜的破裂，细胞核中的unc-85蛋白迅速从细胞核中释放并弥散到整个细胞中。
[0157]
由此，在h2b三敲除品系线虫中，发明人通过正向遗传学筛选的方式找到了其抑制子 unc-85(g111r)点突变，这个unc-85(g111r)突变是一个功能缺失型点突变，且该突变位于其与h3-h4相互作用的界面上，氨基酸电荷变化引起了其与h3的相互作用减弱。 unc-85(g111r)突变使得其蛋白的亚细胞定位发生变化，unc-85::gfp
g111r
蛋白在细胞核中含量降低。
[0158]
实施例5抑制h3-h4的分子伴侣可以挽救h2b缺失的表型
[0159]
在本实施例中，发明人通过将组蛋白h3-h4分子伴侣敲低的方法发现了h3-h4分子伴侣的减少可以挽救h2b三敲除的表型，而h2a-h2b分子伴侣的降低不能挽救其表型。结果暗示了，h2a-h2b与h3-h4的适当比例对于线虫减数分裂和生殖是非常重要的。
[0160]
5.1组蛋白h3-h4的分子伴侣的敲降可以挽救h2b敲除引起的不育
[0161]
如前所述，发明人发现功能缺失型组蛋白h3h4分子伴侣unc-85(g111r)可以挽救 h2b敲除引起的不育表型，那么在组蛋白从翻译出来到转运至染色体的过程中，还有许多其他重要的分子伴侣，这些分子伴侣在组蛋白h3-h4二聚体转运的不同时期起着不同的作用。当h3和h4蛋白在细胞质中被翻译出来后，迅速折叠并结合分子伴侣，首先其与hsp90、 hsc70、nasp结合，并被乙酰转移酶进行乙酰化，乙酰化的h3-h4会被asf1结合而被转运到细胞核中，其中复制依赖型h3-h4被转移到caf1复合体上而进一步组装到染色体上，而复制非依赖型h3-h4则被转运到hira复合物上组装到染色体上(hammond et al., 2017)。另外，fact复合物可以同时做h3-h4和h2a-h2b的分子伴侣；端粒和异染色质区域染色体的h3-h4会daxx-utrx转运并组装到染色体上。基于发明人正向遗传学筛选的发现，发明人猜测，除了asf1同源蛋白unc-85、asfl-1的缺失可以挽救h2b敲除的表型，其余的分子伴侣也可能挽救h2b突变体不育表型。基于这个猜想，发明人利用线虫rnai干扰技术对线虫中目前已知的组蛋白分子伴侣都进行了敲低。发明人发现除了发明人正向遗传学筛选到的unc-85，其余的h3-h4分子伴侣也可以对h2b敲除突变体引起的不育表型进行挽救。其中包括asf1上游的nasp蛋白在线虫的两个同源蛋白nasp-1/2， unc-85另一个同源蛋白asfl-1,asf1下游的caf-1复合体中的线虫同源蛋白chaf-1和 chaf-2，及hira复合体中的hira-1,负责染色体端粒区域h3-h4转运的daxx同源蛋白dap-1。除此之外，发明人还发现对线虫中发明人之前敲除的h2b同一个亚基因簇中的 h3(his-63)和h4(his-46)进行rna干扰敲降也会挽救h2b敲除引起的不育表型。
[0162]
其中不同的组蛋白h3-h4分子伴侣有不同的挽救效率，敲低nasp-1和nasp-2分别挽救子代数目至野生型的4.5％和40％；chaf-1的敲低可以挽救至6％；而hira-1则挽救突变体子代数目至野生型的18.1％；dap-1可以挽救至22.4％；编码h4的基因his-46的敲低可以挽救至10％，而编码h3的基因his-74则可以挽救至16.3％。通过正向遗传学及反向遗传学筛选，发明人发现在线虫生殖腺中由于h2b的敲除引起的不育表型可以被组蛋白h3-h4 的分子伴侣以及h3、h4本身的敲降所抑制。这些数据暗示了，在细胞核或者在染色体核小体中的h3-h4与h2a-h2b可能需要呈现出一种含量平衡的状态，h2b的三敲除造成其平衡被打破，而发明人在h2a-h2b缺失的基础上再敲降h3-h4的含量又使得h2a-h2b与 h3-h4的含量重新达到一种平衡的状态，从而挽救了h2a-h2b缺失造成的表型。
[0163]
实施例6抑制h3-h4分子伴侣可以挽救h2b癌组蛋白突变体
[0164]
在本实施例中，发明人通过在线虫中构建h2b-e76k突变体，发现其与敲除h2b表型高度相似，突变也会严重影响线虫的生殖和减数分裂。而且将发明人遗传筛选到的 unc-85(cas1100)引入该突变体中，发现其可育挽救该突变体的表型，说明了组蛋白平衡机制在组蛋白肿瘤突变体的致病中起着一定的作用。
[0165]
6.1癌组蛋白h2b突变引起线虫生殖缺陷
[0166]
为了探究在组蛋白球状区影响核小体稳定性的突变是否为一种功能缺失型突变，是否与前人的生物化学结果相同，癌组蛋白h2b突变是否引起h2b敲除同样的的表型，发明人想利用基于基因重组的crispr-cas9技术在his-48上构建了h2b蛋白上最高频的点突变 h2b-e76k，同时敲除his-58和his-66基因。首先，发明人分析了人、小鼠、果蝇和线虫中该位点是否具有保守性，通过分析发明人发现h2be76k位点在物种间具有很高的保守性。因此，发明人构建了his-48(cas1241)；his-58(cas1242)；his-66(cas1243)组蛋白肿瘤突变体。
通过表型分析，发明人发现该突变体是温度敏感性突变体，这与酵母中的突变相似(bennettetal.,2019)，其在25℃条件下培养时，子代数目发生了明显的降低，对照组的双突变his-58(cas946)；his-66(cas951)突变体在25℃培养情况下，平均子代数目为122个，而在肿瘤组蛋白突变体中，平均子代数目为15个，子代数目平均降低了87.5％；同时发现肿瘤组蛋白突变体的胚胎致死率显著升高，双突his-58(cas946)；his-66(cas951)对照组在25℃条件下培养，胚胎致死率平均为9.6％，而在肿瘤组蛋白突变体中胚胎致死率升高至70％。因此，发明人发现肿瘤组蛋白突变体的确会引起线虫生殖缺陷，与h2b敲除品系表型一致。
[0167]
为了进一步在细胞水平上探究肿瘤组蛋白突变体是否同样有h2b三敲除突变体的减数分裂表型。发明人在肿瘤组蛋白突变体中引入了gfp标记的微管tba-1和mcherry标记的组蛋白h3-his-72，对子宫内受精后的卵细胞减数分裂过程进行成像。成像后发现受精后的卵细胞可以正常进行第一次减数分裂；随后该突变体的卵细胞还可以迅速招募第二次减数分裂的纺锤体，而且第二次减数分裂过程可以正常持续到后期，而在分裂后期，染色体排列相较于对照组来说变得更加分散无规则，不能整齐地排列在微管两侧；随后的细胞分裂过程也出现缺陷，并没有成功进行细胞分裂，没有排出第二极体，而未排出的第二极体滞留于细胞中。肿瘤组蛋白突变体第二次减数分裂的表型与h2b三敲除突变体减数第一次分裂的缺陷高度相似。随着第一次有丝分裂的进行，滞留在细胞中的极体遗传物质参与到了该突变体品系胚胎接下来的有丝分裂过程中，造成了胚胎中出现多极分裂，最终导致了这些胚胎的死亡。
[0168]
肿瘤组蛋白突变体子代数目减少、胚胎致死率升高及卵细胞减数分裂表型表明该突变体是一个h2b功能缺失型突变体。该肿瘤组蛋白突变体具有强烈的生殖系统表型，良好的表型为在线虫中研究肿瘤组蛋白突变体治病机理及药物筛选提供一个很好的研究体系。
[0169]
6.2h3-h4分子伴侣unc-85点突变可以抑制癌症相关点突变引起的生殖腺缺陷
[0170]
在前期的研究中，发明人发现不同组蛋白含量比例对于线虫的生殖非常重要，h3-h4的降低可以挽救h2a-h2b缺失引起的表型。而发明人发现h2b肿瘤组蛋白突变体具有h2b敲除的表型，因此发明人推断组蛋白比例机制可以挽救h2b肿瘤组蛋白突变体线虫的生殖表型。
[0171]
为了探究h3的缺失是否可以挽救h2b肿瘤组蛋白突变体的表型，发明人将挽救h2b敲除效率最高的unc-85(cas1100)引入到h2b肿瘤组蛋白突变体中，对其生殖能力和胚胎存活情况进行分析发现，unc-85(cas1100)可以很好的挽救h2b肿瘤组蛋白突变体，子代数目由平均每个线虫12个子代恢复至43个，占野生型的比例从12.5％提高到35％；而胚胎致死率也大大降低，从h2b肿瘤组蛋白突变体的70％降低到30％。
[0172]
由此，发明人通过构建组蛋白结构性突变的h2b肿瘤组蛋白突变体，对其进行子代数目、胚胎致死及细胞学表型分析，在体内验证了h2b-e74k突变对于核小体的组装是一个功能缺失型突变。基于发明人在遗传筛选中发现的h3h4的减少可以挽救h2b敲除表型的机制，利用unc-85(cas1100)突变体部分挽救了h2b肿瘤组蛋白突变体的生殖表型。这提示可以利用组蛋白平衡的机制探究h2a或者h2b上影响核小体稳定性突变的治疗方案。
[0173]
本发明的范围不受上文具体示出和描述的内容的限制。本文所述的内容的变化、修改和其它实现方式在不脱离本发明的精神和范围的情况下将是本领域的普通技术人员
显而易见的。