一种基于TPE构建的亲水性四阳离子环番的应用

一种基于tpe构建的亲水性四阳离子环番的应用
技术领域
1.本发明涉及一种基于tpe构建的亲水性四阳离子环番在生物分子识别中的应用。


背景技术：

2.了解分子识别在各种核酸、酶和核苷酸参与的复杂生物过程中的重要性，有助于化学家们开发具有特异响应的智能结构。近年来，人工分子受体因其在医学和生物领域的潜在应用受到越来越多的关注。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)，一种主要的细胞还原剂，在维持谷胱甘肽的还原形式gsh中起着重要作用。gsh可消除细胞中的活性氧(ros)，从而防止细胞氧化损伤。尽管已经提出了nadph参与生理过程的可能机制，但由于现有机制的复杂性和不确定性，仍需进行更深入的探索机理研究。因此，构建一种能够选择性识别nadph的分子识别系统显得尤为重要。
3.冠醚的发现为超分子化学家们设计基于非共价键作用或弱配位的受体大环分子开辟了道路。目前化学家们已构建了多种多样的大环主体，如环糊精、葫芦[n]脲、杯[n]芳烃、环番和柱芳烃等。stoddart等人发现了“蓝盒”，开启了阳离子环番的新时代。阳离子环番不仅具有多阳离子态，而且与富含π电子的客体进行自组装，因此在分子识别方面有很大的潜力。例如，基于π-缺电子的4,4'-联吡啶单元构建的四阳离子环番化合物可以选择性地与π-富电子的主体配合形成1:1或1:2的配合物。四苯基乙烯(tpe)衍生物是一种典型的聚集诱导发射(aie)发光体，近年来已被广泛用于构建大环化合物。由于其具有aie效应和螺旋桨结构，因此基于tpe构建的环番化合物不仅表现出优异的光物理性能，而且还具有灵活多样的空腔结构，可用于捕获生物分子。尽管许多基于tpe的阳离子环番已用于主客体识别，但亲水性的tpe阳离子环番在水介质中识别生物分子的例子很少。
[0004]
本发明则发明了一种亲水性tpe四阳离子环番，用于在水介质中识别生物分子。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种基于tpe构建的亲水性tpe四阳离子环番在nadph识别和细胞成像中的应用。该tpe四阳离子环番(tpe-cyc)能够特异性识别nadph并形成1:1的主客体复合体。tpe-cyc不仅易于被肿瘤细胞吞噬，而且能够选择性捕获细胞内nadph，从而打破nadph参与的氧化还原过程的平衡，提高细胞抗氧化能力。同时，肿瘤细胞中高浓度的gsh可使tpe-cyc的4,4'-联吡啶(mv)单元还原为自由基阳离子状态，并破坏富电子tpe和缺电子联吡啶单元之间的光诱导电子转移(pet)效应，从而恢复tpe单元的荧光并点亮肿瘤细胞，因此，tpe-cyc可作为gsh响应的荧光开关，以高分辨率显示图像细胞。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007]
第一方面，本发明提供一种式(i)所示亲水性tpe四阳离子环番在制备诱导细胞死亡的药物中的应用，
[0008][0009]
式(i)所示亲水性tpe四阳离子环番在通过捕获nadph诱导细胞死亡。
[0010]
优选地，所述细胞为肿瘤细胞，进一步优选为u87细胞或hela细胞。
[0011]
进一步，在体外应用时，所述应用为：所述细胞在含4-10μm(优选4μm)式(i)所示亲水性tpe四阳离子环番的细胞培养基中孵育24-48h(优选24h)诱导细胞死亡。
[0012]
该分子也具有体内应用的潜力。
[0013]
第二方面，本发明提供一种式(i)所示亲水性tpe四阳离子环番在细胞的细胞质高分辨率荧光成像中的应用，
[0014][0015]
式(i)所示亲水性tpe四阳离子环番可以捕获细胞中谷胱甘肽，所有细胞中都含有谷胱甘肽，但肿瘤细胞中谷胱甘肽浓度更高，因此本发明推荐所述细胞为肿瘤细胞。
[0016]
优选地，所述细胞为hela细胞。
[0017]
进一步，在体外应用时，所述应用为：所述细胞在含2-4μm(优选2μm)式(i)所示亲水性tpe四阳离子环番的细胞培养基中孵育2-8h(优选8h)，即在高分辨率荧光成像仪下(350-370nm的激发波长)观察到蓝色荧光。
[0018]
上述孵育都是在通用的细胞培养条件下进行。
[0019]
另外，本发明提供一种上述式(i)所示亲水性tpe四阳离子环番的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0020][0021]
(1)中间体3的合成：在n2气氛下，首先将正丁基锂加入到化合物1的thf溶液中，得到的橙红色溶液在0℃下搅拌。然后，将化合物2的thf溶液滴加到上述混合溶液中，滴加完后混合物升温至室温，并搅拌6h。用饱和氯化铵水溶液淬灭反应。用dcm进行萃取。有机相用无水na2so4干燥。将所得粗产物溶于甲苯中，并加入催化量的对甲苯磺酸，用装有分子筛脱水装置分离生成的水。甲苯层用nahco3水溶液洗涤，用无水na2so4干燥。旋转除去甲苯溶剂，粗产物过柱层析纯化。
[0022][0023]
(2)中间体化合物4的合成：在n2气氛下，先将化合物3溶解在ccl4中，然后加入nbs和过氧化二苯甲酰，最后将混合物加热至70℃回流12h。
[0024][0025]
(3)中间体化合物5的合成：首先将4,4'-联吡啶溶于乙腈中，75℃回流。然后将化合物4溶于乙腈中，逐滴滴加到联吡啶溶液中。将混合物回流3天。过滤出沉淀，用乙腈洗涤，真空干燥，得到化合物5。
[0026][0027]
(4)中间体化合物6的合成：将化合物5和四丁基碘化铵溶解在干乙腈中，在85℃加热72h。离心出沉淀，真空干燥。通过加入过量的nh4pf6进行阴离子转化后，得到淡黄色固体。
[0028][0029]
(5)tpe-cyc的合成：在化合物6的乙腈溶液中加入过量的四丁基氯化铵，室温下搅拌过夜。然后将混合物离心，用乙腈洗涤。真空干燥后得到产物。
[0030][0031]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：由于tpe-cyc具有大而平的矩形腔，因此能够特异性识别nadph并形成1:1的主客体复合体。tpe-cyc不仅易于被肿瘤细胞吞噬，而且能够选择性捕获细胞内nadph，从而打破nadph参与的氧化还原反应的平衡，提高抗氧化能力。同时，肿瘤细胞内有高度的还原环境，如高浓度的gsh，能够将tpe-cyc的mv
2+
还原为mv
+
·
，阻断tpe和mv之间的pet效应，恢复tpe-cyc的荧光，最终实现肿瘤细胞的高分辨率荧光成像。阳离子环番化合物在识别生物大分子和肿瘤细胞成像的生物学应用方面开辟了一条新的途径，在未来诊断和治疗人类疑难疾病方面具有巨大的潜力。
附图说明：
[0032]
图1是部分1h nmr谱(d2o，室温，400mhz):nadph(2.00mm)，(2.00mm)，tpe-cyc(2.00mm)；
[0033]
图2是hela和u87细胞与不同浓度的tpe-cyc孵育4h和24h的细胞毒性；
[0034]
图3是tpe-cyc孵育不同时间hela细胞中ros的荧光图像；
[0035]
图4是流式细胞术检测tpe-cyc孵育不同时间hela细胞中ros荧光信号；
[0036]
图5是加或不加na2s2o4的tpe-cyc的紫外可见光谱；
[0037]
图6是加或不加na2s2o4的tpe-cyc的荧光光谱；
[0038]
图7是tpe-cyc孵育不同时间的hela细胞共聚焦图像(使用nuclear green lcs1染色活hela细胞的细胞核)。
具体实施方式
[0039]
以下通过特定的具体实施例说明发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤，或在这些明确提到的步骤之间还可以加入其他方法步骤；还可理解，这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的保护范围。
[0040]
以下结合实施例，进一步说明本发明。
[0041]
实施例1：化合物3的合成
[0042]
在0℃、n2气氛下，将37.1ml正丁基锂(1.6m)加入化合物1(10g，59.4mmol)的thf(100ml)溶液，得到的橙红色溶液在0℃下搅拌30min。然后，将化合物2(6.3g，29.7mmol)溶于thf(20ml)中，得到化合物2的thf溶液，然后将化合物2的溶液滴加化合物1与正丁基锂的混合溶液中，混合溶液升温至室温，继续搅拌6h。用60ml饱和氯化铵水溶液淬灭反应。用dcm进行萃取有机相用无水na2so4干燥。将所得粗产物溶于20ml甲苯中，加入催化量的对甲苯磺酸(342mg，1.8mmol)，90℃反应回流5h，用装有分子筛脱水装置分离生成的水。用质量分数10％nahco3水溶液洗涤甲苯混合溶液，用无水na2so4干燥后通过旋转蒸发去除甲苯，所得粗产物通过柱色谱法进行纯化(硅胶；石油醚作为洗脱液)，收集含目标化合物的洗脱液，旋干，然后50℃真空干燥12h得到白色固体3(9.0g，产率85％)。
[0043]
实施例2：化合物4的合成
[0044]
在n2气氛下，先将化合物3(1.1g，2.83mmol)溶于ccl4(20ml)中，然后加入nbs(1.5g,8.49mmol)和过氧化二苯甲酰(50mg，0.2mmol)，最后将混合物70℃条件下加热回流12h。反应结束后，对混合物进行过滤，去除固体杂质。用dcm进行萃取，有机相用无水na2so4干燥。溶剂通过旋转蒸发除去，所得粗产物通过柱色谱法进行纯化(硅胶；石油醚与乙酸乙酯体积比10:1作为洗脱液)，收集含目标化合物的洗脱液，旋干，然后50℃真空干燥12h得到化合物4(0.9g，产率60％)。
[0045]
实施例3：化合物5的合成，
[0046]
将4,4'-联吡啶(2.0g，12.8mmol)溶于20ml乙腈中，75℃加热回流。然后将化合物4(1.2mg，2.3mmol)的乙腈(5ml)溶液滴加到联吡啶溶液中。75℃条件下回流3天。对反应后的混合物进行过滤，并用乙腈洗涤滤饼3次。50℃真空干燥12h，得到化合物5(1.7g，产率90％)。
[0047]
实施例4：化合物6的合成
[0048]
化合物4(220mg，0.42mmol)、5(400mg，0.42mmol)和四丁基碘化铵(35mg，0.095mmol)溶于乙腈(100ml)中，85℃条件下反应72h。离心获得橙黄色沉淀，高真空下干燥。加入过量nh4pf6(100mg，1.15mmol)进行阴离子转化后，离心(6000rpm，5min)收集沉淀，真空干燥得到淡黄色固体，即化合物6(250mg,产率37％)。
[0049]
实施例5：tpe-cyc的合成
[0050]
在化合物6(100mg，0.074mmol)的20ml乙腈溶液中加入过量的tbacl(205.66mg，0.74mmol)，室温下搅拌过夜。离心(6000rpm，5min)得到沉淀，并用乙腈洗涤三次。真空干燥后得到最终产物tpe-cyc(61mg，产率90％)。
[0051]
实施例6：
[0052]
在d2o中研究tpe-cyc与nadph之间的主客体相互作用。如图1所示，3.3mg的tpe、1.5mg的nadph溶解于1ml氘代水，配成2mmnadph与2mmtpe的混合溶液。利用上述nadph和tpe-cyc等摩尔溶解在d2o制备的溶液中做核磁氢谱，观察到tpe-cyc上质子的明显化学位移变化。例如，tpe-cyc上的质子h1、h2和h3的信号被划分为多组尖锐信号，并具有明显化学位移变化，这可能是由nadph的四磷酸基团和吡啶单元之间静电相互作用引起的。同时，络合后h
4-8
质子的信号完全消失，这些结果都说明tpe-cyc和nadph之间发生了主客体络合作用。
[0053]
实施例7：
[0054]
细胞毒性实验，nadph被认为是细胞电子转移过程中的一种关键辅酶，它驱动氨基酸、dna、磷脂、脂肪酸和甾体的生物合成。nadph的另一个重要功能是其强还原性，以及促进各种酶的活性，如谷胱甘肽过氧化物酶(gshpx)、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶。因此，打破生命系统中nadph的平衡会引起细胞严重损伤，甚至死亡。考虑到tpe-cyc对nadph的强络合作用，我们研究了tpe-cyc对细胞生物学功能的影响。首先通过3-(4'，5'-二甲基噻唑-2'-基)-2,5-二苯基四唑溴化铵(mtt)分析评估细胞活力，其中在无血清dmem中将u87和hela细胞与不同浓度的tpe-cyc在37℃,5％co2孵箱中孵育4h或24h。如图2所示，0.063-1μm细胞存活率几乎保持在100％，表明tpe-cyc在此浓度范围内不会破坏nadph平衡。然而，随着浓度的进一步增加，存活率下降。当浓度达到4μm时，存活率下降了一半，表明该浓度的tpe-cyc可以捕获足够的细胞内nadph并最终诱导细胞死亡。
[0055]
实施例8：
[0056]
nadph具有保持谷胱甘肽还原为gsh的重要能力，gsh在gshpx的帮助下消除ros并将有害的过氧化氢转化为水。因此，nadph在抵抗细胞氧化应激中起着至关重要的作用。接下来，我们使用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)作为荧光探针来监测细胞内ros水平。dcfh-da本身不发出荧光，但ros能够氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf。如图3所示，随着孵育时间的增加，tpe-cyc组的ros水平降低，表明细胞的抗氧化能力减弱。流式细胞术(fcm)也用于定量分析细胞内ros水平。如图4所示流式结果与荧光成像的结果类似，随着时间的延长，活性氧的产生显著降低。其原因可能是tpe-cyc对细胞内nadph的捕获打破了nadph在氧化还原反应中的平衡，促进了还原物质的产生，从而使ros含量降低。
[0057]
实施例9：
[0058]
由于tpe与联吡啶单元之间的pet效应，水溶性tpe-cyc是一种猝灭型主体，具有强烈的紫外吸收而无荧光，严重限制了其应用。在还原条件下，mv
2+
可被还原为mv
+
·
(联吡啶基团)，从而阻断tpe和联吡啶单元之间的pet效应，可用于激发tpe-cyc的荧光。如图5所示，添加na2s2o4后，在450-750nm范围出现mv
+
·
的吸收峰，表明在还原剂的帮助下，mv
2+
被还原为mv
+
·
。如预期的那样，tpe-cyc+na2s2o4组在300-550nm范围内出现新的荧光发射(如图6所示)，表明tpe-cyc的荧光开关已被打开。
[0059]
实施例10：
[0060]
利用激光共聚焦显微镜(clsm)研究tpe-cyc的内化行为。如图7所示，用含2μm tpe-cyc的无血清dmem对hela进行孵育，孵育2h后，在细胞质中350nm的激发波长下观察到tpe-cyc产生的明显蓝色荧光，表明tpe-cyc很容易被hela细胞内化。随着孵育时间增加到8h，蓝色荧光强度显著增加，表明tpe-cyc的内吞作用具有时间依赖性，并且细胞内还原环境可以保证tpe-cyc持续发光，这为tpe-cyc在荧光成像中的应用提供了重要的优势。